Robotique et d'analyse d'images dynamiques pour les études d'expression génique dans les tissus végétaux

Dans cette procédure, la dynamique de l’expression des gènes dans les tissus végétaux est imagée au fil du temps à l’aide de la robotique, les graines de haricot de Lima sont d’abord stérilisées et placées entre des serviettes en papier humidifiées dans un récipient de culture tissulaire pour la germination. Après quatre jours, les coans sont retirés et bombardés d’une construction d’ADN contenant un promoteur fusionné à la GFP Les coans placés dans des boîtes de Pétri sont montés sur un système de collecte d’images robotique bidimensionnel conçu sur mesure. Le robot est programmé pour capturer des images de chaque morceau de tissu toutes les heures pendant 100 heures.

Les images sont soumises à une analyse d’images, à des données quantitatives sur l’intensité de l’expression de la GFP au cours du temps. Bonjour, je suis John Finer, directeur du laboratoire de transformation des plantes du Département d’horticulture et de science des cultures de l’Université d’État de l’Ohio. Je m’appelle Carlos Herandez Garcia, je suis doctorant dans le dernier laboratoire de l’Université d’État de l’Ohio.

Aujourd’hui, Carlos va vous montrer le protocole que nous avons développé pour l’analyse de l’expression des gènes et des tissus végétaux à l’aide de la protéine fluorescente verte. Nous utilisons cette procédure que nous avons développée en laboratoire pour mesurer la déformation de l’activité OD. Pour ce faire, nous avons mis en place notre première couronne en amont du gène GFP, qui est notre gène rapporteur.

Je vais vous montrer comment nous introduisons le contrôle du promoteur dans la veine Lima Cataly et envoyons une application sur notre système de capture d’images robotisé de conception personnalisée. Je terminerai en passant en revue notre protocole d’analyse d’images. Alors, allons-y : pour commencer cette procédure, faites stériliser en surface les graines de haricot de Lima en utilisant des procédures standard.

Placez les graines stérilisées dans sept récipients de GA magenta entre des couches d’essuie-tout humide et en papier et incubez-les pendant quatre jours à 25 degrés Celsius. Ici, nous utilisons un vecteur d’expression à nombre de copies élevé, utile pour les analyses de promoteur et d’élément de promoteur. Ce vecteur contient le gène GFP, qui est utilisé pour visualiser la fonction du promoteur ou de l’élément promoteur dans les tissus transformés environ une à deux heures avant le bombardement.

Exciser le plomb CU du haricot de Lima à partir des témentages. Le plomb CU adapté au bombardement doit être jaune à vert clair, plat et exempt de tout dommage qui pourrait interférer avec l’analyse ultérieure de l’image immédiatement après l’excision et placer 12 cu de plombine dans une boîte de Pétri avec un milieu de culture OMS contenant des sels MS B, cinq vitamines, 3 % de saccharose et 0,2 % de taux de gel à pH 5,7. Ensuite, précipitez la construction de l’ADN sur des particules de tungstène M 10 Tout d’abord, juste avant utilisation, remettez les particules en suspension dans de l’eau stérile à une concentration de 100 milligrammes par millilitre.

Ensuite, dans un tube fuge de 0,6 millilitre, ajoutez 25 microlitres de particules, cinq microlitres d’ADN à un microgramme par microlitre, 25 microlitres de chlorure de calcium 2,5 molaires et 10 microlitres de spermatozoïdes 100 millimolaires. Incuber la préparation d’ADN sur de la glace pendant cinq minutes, puis retirer et jeter 50 microlitres de la solution sur les particules. Remettre en suspension les particules enrobées d’ADN qui restent au fond du tube par vortex.

Et immédiatement après le vortex, retirez un Eloqua de deux microlitres. Répétez cette étape de vortex. Chaque fois qu’un Eloqua est retiré, les particules enrobées doivent être conservées sur de la glace et utilisées dans les 15 minutes.

Maintenant que l’ADN est enrobé sur les particules, placez deux microlitres de particules par le haut d’un filtre de seringue au milieu d’un tamis filtrant. Placez ensuite le filtre de la seringue dans l’unité de maintien du filtre à l’intérieur du pistolet d’entrée de particules ou de la chambre PIG. Placez un haricot de Lima co-leadin, un côté axial vers le haut, sur un déflecteur qui consiste en un tamis fondu au fond d’un bécher.

Placez le déflecteur, qui sert de plate-forme pour soutenir les tissus pendant le bombardement, dans la chambre du canon à particules. Pour bombarder le tissu, ouvrez d’abord la valve menant au vide pour évacuer la chambre. Lorsque le vide atteint 760 millimètres de mercure, activez le solénoïde et libérez l’hélium pour propulser les particules.

La pression d’hélium utilisée pour accélérer les particules est de 50 à 60 PSI. Après le bombardement de particules, fermez la soupape de conduite de vide et libérez le vide à l’aide de la soupape d’échappement. Lorsque le vide est relâché, ouvrez la porte de la chambre pour récupérer le plomb bombardé et renvoyer le plomb perdu par un côté dal.

Jusqu’au milieu de culture OMS pour la quantification et le profilage d’expression. Bombardez un minimum de trois co-plombines pour chaque construction d’ADN. Un contrôle positif, qui donne un profil d’expression génique bien étudié, est également inclus.

Les co-leaders sont maintenant prêts pour l’imagerie. Allumez la lampe au mercure et attendez 30 minutes qu’elle se réchauffe. Allumez les sources d’alimentation de la caméra SPOT R-T-C-C-D et du contrôleur de moteur, qui pilote le mouvement de la plate-forme robotique conçue sur mesure, qui contient huit plaques.

Réglez le jeu de filtres pour la détection GFP en sélectionnant le jeu de filtres GFP deux à 480 nanomètres d’excitation et 510 nanomètres d’émission sur un microscope à trois dissections MZ L. Ensuite, stérilisez les couvercles de la boîte de Pétri en polycarbonate épaissi en pulvérisant de l’éthanol à 70 %. Les couvercles spécialisés utilisés pour couvrir la base de la boîte de Pétri empêchent la condensation lors de la collecte d’images.

Placez les plaques contenant le cuan bombardé sur la plate-forme robotique et serrez la vis de réglage latérale pour les fixer en position. Ouvrez maintenant l’application logicielle personnalisée qui contrôle à la fois la plate-forme robotique et l’acquisition d’images. Ouvrez également l’interrupteur du contrôleur de lumière blanche du logiciel à l’aide du logiciel, orientez la plate-forme sur la position d’origine.

Cela se fait avant d’entrer dans les positions. Pour chaque tête de dorloteur dans l’onglet moteur, sélectionnez la première plaque. La plateforme positionnera le centre de la boîte de Pétri sous l’objectif du microscope.

À l’aide des boutons de distance de déplacement, positionnez avec précision le premier CU LEADIN pour la collecte d’images. À l’aide de la fonction de mode en direct, déplacez le câlin en plomb vers la zone de visualisation appropriée Pour le premier câlin en plomb, utilisez les boutons manuels du microscope de dissection pour régler la mise au point et réglez le grossissement sur 1,6 x. Une fois la région d’intérêt définie, cliquez sur le bouton Ajouter cette position.

Le logiciel ajoutera les coordonnées de cette région à un fichier de planification de position et la plate-forme reviendra au centre des positions de jeu de plaques pour tous les coens restants sur les plaques. À l’aide des boutons de distance de déplacement, utilisez les trois vis de nivellement manuel situées sous chaque plaque de la plate-forme robotique pour ajuster la mise au point du coan restant sur la même plaque. Une fois que toutes les coordonnées de tous les coan ont été saisies, enregistrez les coordonnées de l’horaire de position.

Entrez les paramètres de collecte d’images tels que le type de lumière, qui est bleu pour la GFP et le réglage de l’exposition, et spécifiez l’emplacement de stockage des images comme décrit dans le protocole écrit qui l’accompagne. Allez dans l’onglet de contrôle du temps de capture et définissez l’intervalle de temps d’acquisition de l’image et le nombre total de cycles de collecte d’images. Les images sont généralement collectées toutes les heures pendant 100 heures.

Générer des profils d’expression génique bien définis. Démarrez l’acquisition d’images en ouvrant l’onglet du programme de position, puis en cliquant sur le bouton du programme d’exécution. Isolez le système de collecte d’images de la lumière étrangère à la fin de la collecte d’images de 100 heures.

Les images haute résolution d’environ cinq mégaoctets chacune sont prêtes pour l’analyse d’image. Utilisez image ready pour assembler les 100 images séquentielles de chaque dossier. Importez toutes les images séquentielles sous forme d’images et redimensionnez-les à 800 x 600 pixels pour accélérer le traitement de l’image.

Ensuite, utilisez des repères sur un nouveau calque introduit, qui est visible dans toutes les images et en utilisant les points GFP sélectionnés dans la référence de l’image. Alignez manuellement chaque image une fois l’alignement terminé, supprimez le calque utilisé comme référence et enregistrez le fichier en tant que fichier PSD unique. Exportez également toutes les images sous la forme d’un seul fichier MOV en utilisant la résolution la plus élevée.

Les fichiers sont maintenant prêts à démarrer la quantification GFP. Utilisez l’image J pour ouvrir le fichier MOV et recadrer une zone de 400 x 300 pixels. Séparez ensuite les images séquentielles en couches rouge, bleue et verte à l’aide de l’outil de division RVB pour les couches rouges et vertes.

Soustrayez la fluorescence d’arrière-plan à l’aide du retour sur investissement mesuré pour chaque outil de plug-in de tranche. Calculez l’expression de la GFP en ajustant les niveaux de seuil et en utilisant un plugin conçu pour mesurer la valeur moyenne de l’échelle de gris par pixel et le nombre total de pixels exprimant la GFP. Copiez les valeurs de sortie dans l’image J.Enfin, collez les valeurs de sortie pour les canaux vert et rouge dans Microsoft Office.

Excel pour une manipulation plus poussée des données afin de vous donner une idée des résultats de l’alignement des images. Cette première animation montre l’imprécision du repositionnement de la plateforme robotique pendant l’expérience de 100 heures. Le mouvement ponctuel est un artefact résultant de l’incapacité de la plate-forme robotique à revenir exactement à la même position à chaque point temporel après l’alignement manuel de l’image, les cellules exprimant la GFP peuvent être facilement observées et les caractéristiques uniques de ce système de suivi sont facilement visualisées.

Comme le note cette animation, les cellules exprimant la GFP qui sont encerclées, la cellule qui est encerclée en rouge montre une baisse très rapide de l’expression 18 à 20 heures après le bombardement tandis que la cellule qui est encerclée en blanc montre un début retardé de l’expression de la GFP. Outre les animations, cette procédure permet une quantification rapide de l’expression de la GFP dans le temps dans le tissu cible du haricot de Lima. Ces résultats représentatifs montrent la quantification comparative de l’intensité du promoteur à l’aide du promoteur CAMV 35 S et de quatre promoteurs de soja différents.

Nous venons de vous montrer comment introduire de l’ADN dans la cataline de germer. Les graines de la veine Lima placent la cataline sur le robot, collectent des images pour l’analyse d’images et analysent ces images. Nous utilisons régulièrement cette procédure dans notre laboratoire pour valider les promoteurs de plantes clones.

On peut générer une grande quantité de données à partir de l’introduction de différents promoteurs de plantes. Cependant, cette procédure est compliquée avec de nombreuses étapes qui peuvent mal tourner lorsque cette procédure est importante pour commencer avec des graines de haricot fraîches ou au moins utiliser des semences de haute qualité qui ont été stockées correctement. Il est également important d’obtenir rapidement le couvercle coupé à la bombarde et de l’installer sur le robot et d’utiliser le couvercle épais de la parabole en PET pour minimiser les problèmes de condensation.

Et enfin, veuillez noter que le GFP que nous utilisons est une autre version appelée SGFP, front Gen HIN Lab à l’Université de Harvard. Cette GFP n’est pas très stable et peut être meilleure pour suivre les changements rapides dans l’expression des gènes. Et c’est nous qui nous regardons.

Et bonne chance dans vos expériences.