Encapsulation de cellules de mammifères dans des perles d'alginate à l'aide d'un récipient agité simple

Cette vidéo décrit une méthode pour immobiliser des cellules de mammifères, telles que des îlots pancréatiques, dans des billes d’alginate à l’aide d’un simple récipient agité. Le principe de la méthode est de générer des gouttelettes d’alginate par émulsion d’eau et d’huile, suivie d’une gélification interne des gouttelettes d’alginate. La première étape de la procédure consiste à générer une émulsion où une phase aqueuse contenant des cellules d’alginate et du carbonate de calcium est dispersée dans une phase organique d’huile minérale.

La deuxième étape consiste à acidifier l’émulsion en ajoutant un acide soluble dans l’huile, tel que l’acide acétique, qui se répartit rapidement dans la phase aqueuse. La baisse du pH conduit à la dissolution du carbonate de calcium et à la gélification interne des gouttelettes d’alginate en billes. L’étape finale consiste à récupérer les billes de l’émulsion par l’ajout d’une solution aqueuse, la séparation des phases par centrifugation, suivie d’un lavage et d’une filtration des billes.

Les cellules immobilisées peuvent ensuite être cultivées in vitro ou utilisées pour la transplantation. La méthode que nous avons décrite est une alternative à l’utilisation d’encapsulateurs de cellules à base de buses pour générer des billes d’alginate. Cela a été dérivé d’une méthode d’immobilisation des enzymes et des cellules microbiennes, rapportée pour la première fois par Poncelet et d’autres en 1992.

L’application qui nous intéresse le plus est l’encapsulation d’alginate comme moyen d’immunoisoler les cellules transplantées, afin de réduire, voire d’éliminer, le besoin de médicaments anti-rejet. Les principaux avantages du procédé à base d’émulsion par rapport aux dispositifs à base de buses sont son évolutivité et sa robustesse. Étant donné que les gouttelettes sont générées presque simultanément, de très grandes quantités de billes peuvent être produites en très peu de temps, à partir de solutions d’alginate très diluées ou très concentrées.

De plus, le processus est très robuste et n’est pas sujet aux défaillances, et même en présence de particules qui pourraient obstruer les buses, et enfin l’équipement de traitement est assez simple et donc accessible, très relativement peu coûteux pour la plupart des laboratoires. Les principales étapes de traitement sont l’émulsification pour former les gouttelettes d’alginate et l’acidification pour libérer la source interne de calcium. La taille des gouttelettes est principalement influencée par la conception de la roue, le taux d’agitation et la durée de l’agitation.

Les propriétés mécaniques des billes et la survie cellulaire sont influencées par l’étendue et la durée de l’acidification. Dans cette vidéo, nous présentons une méthode utilisée pour encapsuler des cellules dans des billes d’alginate à 5 % pour la transplantation. Ces paramètres nécessiteraient probablement une optimisation pour d’autres applications potentielles.

Pour générer des billes d’alginate à 5 % contenant un mélange moitié-moitié d’alginates LVM et MVG, pesez 583 milligrammes de LVM et 583 milligrammes de poudre d’acide alginique MVG. Placez le tampon de processus de 20 millilitres sur une plaque d’agitation magnétique. Pour les applications de transplantation, nous utilisons un tampon HEPES de 10 millimolaires contenant 170 millimolaires de chlorure de sodium à pH 7,4.

Ajouter progressivement la poudre d’acide alginique à la solution. Laissez la solution en remuant toute la nuit à basse vitesse. Si nécessaire, fixez le ballon à la plaque d’agitation.

Le lendemain, si l’alginate n’est pas complètement dissous, fixez le pot sur un mélangeur rotatif et continuez à mélanger toute la nuit à 37 degrés Celsius. Une fois l’alginate complètement dissous, stérilisez la solution à l’autoclave pendant 30 minutes. Laissez la température descendre en dessous de 50 degrés Celsius avant d’ouvrir l’autoclave.

Préparez la suspension de carbonate de calcium en ajoutant un gramme de carbonate de calcium dans un tampon de traitement de 20 millilitres. Autoclave la suspension de carbonate de calcium et le récipient agité utilisé pour le processus d’émulsion. Avant l’utilisation, retirez toute trace d’eau condensée du récipient.

Immédiatement avant le processus d’émulsion, dissoudre 44 microlitres d’acide acétique glacial dans 11 millilitres d’huile minérale placée dans un tube conique de 50 millilitres. Une erreur courante est la dissolution incomplète de l’acide acétique, évitez le pipetage de quantités inférieures à 10 microlitres et assurez-vous que l’acide est complètement dissous par vortex répété. Laissez toutes les solutions atteindre la température ambiante avant de procéder à l’encapsulation des cellules.

Placez 10 millilitres d’huile minérale dans la fiole essoreuse et commencez à remuer à 250 tr/min. Si des cellules adhérentes telles que les cellules bêta-tc3 sont utilisées, trypsinisez les cellules. Terminez la réaction en ajoutant un milieu complet et prélevez un échantillon pour le dénombrement des cellules.

Déterminez la concentration des cellules manuellement ou à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Centrifuger les cellules pendant sept minutes à 300 g, puis remettre en suspension la palette cellulaire dans un milieu complet. Répétez l’étape de centrifugation, puis remettez les cellules en suspension dans le volume approprié de milieu complet pour obtenir 10 fois et 1/2 la concentration finale souhaitée dans les billes.

Transférez 9,9 millilitres de solution d’alginate dans un tube à fond plat, puis ajoutez 1,1 millilitre de stock cellulaire et 550 microlitres de suspension de carbonate de calcium. Mélanger l’alginate, le carbonate de calcium et la suspension cellulaire par un léger vortex. Transférez immédiatement 10,5 millilitres de ce mélange dans l’huile d’agitation à l’aide d’une seringue.

Augmentez le taux d’agitation, puis démarrez la minuterie. Pour déterminer le taux d’agitation, il faut d’abord générer une courbe standard reliant la taille du cordon au taux d’agitation. Après 12 minutes, ajoutez 10 millilitres de la solution d’huile et d’acide acétique pour acidifier l’émulsion, libérer le calcium du carbonate et obtenir des billes gélifiées.

Comptez huit minutes pour cette étape de gélification interne. Remarquez le changement de couleur des gouttelettes émulsionnées qui contiennent l’indicateur de pH rouge phénol. Réduisez le taux d’agitation à 400 tr/min, neutralisez l’acide en ajoutant 40 millilitres de tampon de processus mélangé à 10 % de fluide, ce qui conduit à une inversion de phase.

Arrêtez l’agitation une minute plus tard et transférez le mélange dans des tubes coniques. Rincez la fiole essoreuse avec 20 millilitres supplémentaires de fluide et ajoutez-le dans les tubes. Aspirez autant de solution aqueuse que possible avant d’aspirer la phase huileuse.

Centrifuger les tubes pendant trois minutes à 630 g pour accélérer la décantation des billes et la séparation des phases. Retirez l’huile et l’excès de tampon de processus en aspirant avec une pipette Pasteur. Lavez les perles au moins une fois avec du médium en utilisant une centrifugation de 630 g entre les lavages.

Filtrez la suspension de billes sur des crépines à cellules en nylon de 40 microns et aspirez l’excès de liquide dans la crépine par le bas. Transférez les perles dans un volume connu de support à l’aide d’une spatule. Mesurez le volume du cordon et complétez le fluide pour obtenir la concentration de cordon souhaitée.

Une concentration typique est d’un millilitre de billes par volume total de cinq millilitres. À partir de ce moment, manipulez toujours les billes avec des pipettes de gros calibre pour éviter d’endommager les billes. Les cellules encapsulées peuvent maintenant être transférées dans des flacons T et utilisées pour la culture in vitro ou la transplantation.

À la fin du processus d’émulsion, il faut obtenir des billes d’alginate contenant des cellules immobilisées. Après le processus, la distribution de la taille des billes et la survie cellulaire doivent être évaluées régulièrement. Pour déterminer la distribution de la taille des billes, les billes peuvent être colorées au bleu de toluidine, suivies d’une analyse d’image.

Une large distribution de la taille des billes est attendue de ce processus. Pour évaluer la survie cellulaire, les billes peuvent être incubées avec des colorants morts vivants, tels que la calcéine-AM et l’homodimère d’éthidium. En utilisant le processus décrit dans cette vidéo, 76 % de survie des cellules bêta-tc3 a été mesurée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’immobiliser des cellules de mammifères dans des billes d’alginate à l’aide d’un simple système d’agitation. Le protocole de base présenté dans cette vidéo doit être adapté pour immobiliser une variété de types de cellules en utilisant une large gamme de types d’alginates et de calcitrations. Nous vous recommandons de générer une courbe standard reliant la taille moyenne des billes à la vitesse d’agitation avec chaque nouveau lot d’alginate ou d’huile.

Le processus d’émulsification que nous avons décrit est une alternative prometteuse aux encapsulateurs de cellules à base de buses. Il s’agit d’une méthode robuste et simple pour immobiliser des cellules de mammifères dans des billes d’alginate. Alors que nous et d’autres dans le monde développons des thérapies cellulaires à buse, une telle échelle de méthodes sera nécessaire pour les milliers de patients diabétiques.

Nous avons publié des résultats prometteurs de la transplantation d’une lignée de cellules bêta dans des billes d’alginate à 5 %, et nous continuons d’explorer les performances in vivo de cette barrière améliorée contre le rejet de greffe.