Méthode d'extraction et d'analyse de lipides pour caractériser les microbes du sol dans les expériences avec de nombreux échantillons

L’objectif de cette vidéo est de décrire une méthode qui augmente le débit tout en équilibrant l’effort et la précision pour l’extraction des lipides des membranes cellulaires des micro-organismes afin de caractériser à la fois les lipides totaux et l’abondance relative des lipides indicateurs afin de déterminer la structure de la communauté microbienne du sol et des études avec de nombreux échantillons. Sur le terrain, vous devez tenir compte de l’hétérogénéité du sol en recueillant des échantillons de sol de manière à ce qu’il représente votre site. Afin de préserver la communauté microbienne au moment de l’échantillonnage, les échantillons doivent être transportés du terrain sur de la glace.

Une fois de retour au laboratoire, retirez les racines et les pierres et brisez les mottes par tamisage grossier. Cela sert également à homogénéiser votre échantillon. Préparez-vous à la lyophilisation en mettant les sous-échantillons dans des récipients appropriés et en les lyophilisant dès que possible.

Une fois les sols lyophilisés, conservez-les dans un récipient scellé avec un dessiccant jusqu’à l’extraction. Il est préférable de conserver les sols séchés au congélateur à 80 degrés C.As une préparation pour l’extraction, de retirer les sols lyophilisés du stockage et de les broyer. Les méthodes de broyage comprennent le broyeur à boulets, le compteur de boulets ou le mortier et le pilon.

Après avoir broyé le sol, encore une fois, homogénéisez soigneusement vos échantillons de sol et conservez-les au congélateur. Tout le matériel de laboratoire doit être scrupuleusement propre. Tout résidu de détergent, de graisse ou de saleté peut avoir un impact sur les résultats en apparaissant sous la forme d’un pic dans le chromatogramme final de la GC.

Les extractions sont effectuées dans des tubes à centrifuger en téflon de 30 millilitres, qui doivent être rincés au solvant. Ajoutez deux à trois millilitres d’hexane dans les tubes et vortex pendant quelques secondes. Décantez l’hexane dans un autre tube et vortex.

Deux à trois millilitres d’hexane peuvent être utilisés pour rincer en série six tubes. Rangez les tubes rincés à l’hexane à l’envers dans la hotte et jetez l’hexane usagé dans un conteneur à déchets approprié. La verrerie peut être étouffée ou rincée avec un solvant immédiatement avant utilisation.

L’étouffement garantit la propreté de la verrerie par oxydation des résidus à haute température. Enveloppez la verrerie dans deux à trois couches de papier d’aluminium et placez-la dans le four à moufle. Réglez à 450 degrés C et, une fois que le four a atteint le point de consigne, faites cuire pendant au moins 4 1/2 heures.

Attendez au moins une heure pour refroidir avant de retirer du four. Étiquetez et pesez les tubes en téflon rincés à l’hexane. Ajouter de la terre dans des tubes centrifugés en téflon et peser à nouveau pour obtenir la masse de terre.

Faites toujours au moins deux blancs par lot et incluez un étalon de contrôle, de préférence un sol qui a été préalablement extrait, si vous voulez vérifier que l’extraction a fonctionné correctement. Extractions de lipides. Préparez trois repipettes de cinq à 10 millilitres pour le tampon phosphate, le chloroforme et le méthanol.

Le chloroforme est un liquide très dense ayant une faible tension superficielle. Veillez à ce que la quantité que vous distribuez soit précise et constante. Gardez la bouteille au moins à moitié pleine de liquide.

Dans la hotte, ajoutez les réactifs au sol dans le tube en téflon dans l’ordre suivant, tampon phosphate, chloroforme et méthanol. Il s’agit de la première extraction physique de lipides à partir de votre échantillon. Les recettes des solutions réactives sont incluses dans le protocole écrit.

Les proportions de solvant et l’ordre d’addition sont importants pour une bonne séparation des phases organique et aqueuse. Laissez le temps aux sols de mouiller après l’ajout du tampon avant d’ajouter le chloroforme. Si cela vous convient, les agents d’extraction peuvent être combinés et ajoutés en une seule aliquote pour la deuxième extraction et les suivantes.

Fermez bien les tubes en téflon et couvrez-les pour les protéger de la lumière. Placez-les sur le shaker horizontalement en vous assurant qu’ils sont bien fixés. Avec un réglage de vitesse élevé, secouez pendant quand heure.

Pendant que les tubes agitent, préparez deux longs tubes de verre pour chaque échantillon comme suit. Étiquetez le tube, ajoutez le même volume de chloroforme que celui qui a été ajouté au sol et un volume égal de tampon phosphate. Après avoir retiré les tubes en téflon de l’agitateur à 25 degrés C, centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 2 500 tr/min.

Ensuite, dans la hotte avec les lumières éteintes, décantez le surnageant du tube en téflon dans l’un des longs tubes. La séparation de phase doit être visible dans le tube de verre. La couche inférieure contient le solvant organique, principalement le chloroforme, et les lipides.

Cette extraction est répétée. Versez le surnageant dans le deuxième tube préparé précédemment. Maintenant, vous avez physiquement extrait les lipides du sol deux fois.

Pour la plupart des sols, c’est suffisant. Fermez solidement tous les tubes de classe longue avec des capuchons doublés de téflon et retournez-les 10 fois pour mélanger. Séparer les phases par gravité pendant la nuit.

Laissez les échantillons reposer sans être dérangés pendant la nuit pour compléter la séparation des deux phases. Pour ce faire, conservez les échantillons dans une armoire sombre ou recouverte d’une feuille d’aluminium à température ambiante. Vous pouvez laisser les extraits se séparer pendant le week-end.

Deuxième jour, isolement des lipides. Le deuxième jour, la couche aqueuse est aspirée et les lipides concentrés en éliminant le solvant dans un système d’évaporation sous vide. Les échantillons peuvent également être séchés en les plaçant dans un bain d’eau ou de sable et en appliquant un léger jet d’azote.

Le liquide dans les tubes doit maintenant être bien séparé et largement clair. Si ce n’est pas le cas, ou si l’interface entre les deux couches est particulièrement épaisse, laissez la séparation se poursuivre pendant un autre jour. Installez un aspirateur dans la hotte.

Il s’agit d’une fiole à bras latéral reliée à une pompe à vide par un tube Tygon à feuilles et une pipette de pâturage. Avec la pompe en marche, à l’aide de la pipette, aspirer la phase aqueuse dans le ballon. Aspirez la couche supérieure et l’interface.

Ce sera environ les 2/3 de la descente. Faites cela pour les deux à trois ensembles de tubes de verre. La couche supérieure peut contenir quelques particules de terre.

Retirez-les si possible. Combinez l’extrait de la deuxième et/ou de la troisième série de tubes avec celui des deux premiers en les décantant soigneusement. Essayez d’empêcher de verser tout matériau solide et rincez les parois du tube en tournant.

Utilisez une pipette propre pour chaque échantillon et répétez ce processus pour les échantillons restants. Une fois que les extraits de chloroforme ont été combinés et sont restés pendant quelques minutes, inspectez la surface du liquide. Souvent, une fine couche d’eau résiduelle se forme.

Si c’est le cas, aspirez avant de continuer. L’eau résiduelle peut attaquer les doubles liaisons d’acides gras, mais une très petite quantité doit s’évaporer avec les solvants au fur et à mesure que les échantillons sont séchés. Séchez tous les échantillons à l’aide de l’appareil d’évaporation sous vide.

Fermez hermétiquement les tubes et conservez-les au congélateur à 80 degrés C.Troisième jour, saponification et méthylation. Tout d’abord, allumez les bains-marie. Vérifiez le niveau de l’eau et réglez le bain un à 95 degrés C et le bain deux à 80 degrés C.À l’aide d’une repipette, ajoutez un millilitre de réactif de saponification, réactif 1, aux lipides séchés.

Fermez hermétiquement, agitez brièvement et placez sur une grille. Une fois cette étape terminée, placez le rack de tubes dans le bain-marie à 95 degrés C et attendez cinq minutes. Retirez le rack de tubes du bain et vérifiez que les tubes ne fuient pas.

Cela sera indiqué par des bulles qui montent dans le tube comme une mousse. Resserrez ou remplacez les capuchons des tubes qui fuient. Continuez à chauffer les tubes dans le bain-marie pendant encore 10 minutes.

Réduisez la température du bain-marie à 80 degrés C et poursuivez l’incubation pendant encore 15 minutes. Retirez les tubes et laissez refroidir en plaçant la grille dans une casserole d’eau du robinet. N’utilisez pas d’eau glacée.

Une fois les échantillons refroidis, ajoutez deux millilitres du réactif de méthylation, le réactif 2, à chaque échantillon. Encore une fois, fermez bien le capuchon et agitez pendant cinq à 10 secondes. Les sels granulaires peuvent devenir visibles comme un précipitant dans la solution, ce qui se produit parfois en raison d’un excès de réactifs.

Placez la grille dans le bain-marie à 80 degrés C et incubez pendant 10 minutes. Retirez la grille de tubes du bain-marie et mettez-la dans une casserole d’eau du robinet pour le refroidissement. Agitez la grille pour accélérer le processus de refroidissement.

À l’aide d’une repipette, ajoutez 1,25 millilitre d’hexane et de méthyl tertiaire butylique, réactif 3, dans chaque tube pour extraire la phase. Fermez hermétiquement les bouchons et placez les tubes sur un shaker pendant 10 minutes. Après avoir secoué, laissez reposer la grille de tubes pendant 10 minutes pour que les phases se séparent.

Transférez la phase organique, qui est maintenant la couche supérieure, dans un tube de verre court à l’aide d’une pipette de pâturage. Il est préférable de récupérer la majeure partie du liquide. De très petites quantités de phase aqueuse ne compromettront pas l’extraction.

Répétez l’extraction en phase aqueuse en ajoutant le réactif 3, en agitant, en laissant les phases se séparer et en transférant la phase supérieure. En fonction de l’état de la phase inférieure, vous pouvez répéter cette opération une fois de plus pour un total de trois transferts. Ajoutez 3 millilitres de lait de base, le réactif 4, qui est une solution diluée d’hydroxyde de sodium, aux extraits dans les tubes courts.

Fermez hermétiquement les tubes à essai et faites tourner le torson pendant 20 à 30 secondes, puis centrifugez-le pendant trois minutes à 2 000 tr/min. Une fois centrifugé, à l’aide d’une pipette de pâturage propre, aspirez la phase organique supérieure et transférez-la dans un flacon ambré de quatre millilitres. Faites très attention à ne pas aspirer la phase aqueuse.

L’étape suivante consiste à évaporer le solvant jusqu’à ce qu’il soit sec dans un appareil d’évaporation sous vide. Quatrième jour, préparation des extraits pour l’analyse GC. À l’aide de la pipette, ajoutez 100 microlitres de réactif 3 dans chacun des flacons de 4 millilitres contenant la phase séchée.

Vortex l’échantillon, puis laissez-le reposer pendant 10 minutes. À l’aide de la deuxième pipette, transférez avec précaution les EMAG suspendus dans un flacon de GC. Ajoutez une autre aliquote du solvant dans le flacon de quatre millilitres et utilisez brièvement le vortex.

Roulez le flacon pour vous assurer que les EMAG résiduels sur les parois du flacon sont dissous. À l’aide de la deuxième pipette, transférez le solvant dans le flacon GC. Terminez le transfert en ajoutant une troisième aliquote de solvant dans le flacon, en faisant un vortex et en transférant dans le flacon GC.

Boucher le flacon GC et le conserver au congélateur. Conservez les flacons de GC scellés dans le congélateur avant l’analyse. Analyse GC.

Pour utiliser ce système, l’analyse doit être effectuée à l’aide d’une colonne GC spécifique. Le chromatographe en phase gazeuse est équipé d’une entrée sans fente, équipée d’un revêtement d’entrée en verre de quatre millimètres de diamètre intérieur avec un bouchon en laine de verre désactivé. L’entrée est réglée à 250 degrés C et fonctionne en mode de pression constante.

Le gaz vecteur est l’hydrogène. L’azote et l’air sont nécessaires comme gaz de support du détecteur. Une colonne Agilent Ultra 2 est utilisée.

La colonne mesure 25 mètres de long avec un diamètre intérieur de 2 millimètres et une épaisseur de film de phase stationnaire de 33 micromètres. La phase stationnaire dans cette colonne est 5 % de phényle, 95 % de méthylpolysiloxane, également connue sous le nom de colonne de type DB-5. Pour analyser les extraits lipidiques, une aliquote de deux microlitres est injectée dans un rapport de 100:1 avec la température du four à 170 degrés C.Post l’injection, le four est programmé pour augmenter à cinq degrés par minute jusqu’à 300 degrés C, puis maintenir pendant 12 minutes.

Une série d’injections de la norme MIDI est effectuée et les résultats sont utilisés pour effectuer des ajustements selon les instructions du manuel MIDI. Une fois calibré de cette manière, le système peut nécessiter des ajustements mineurs à l’occasion, mais devrait généralement obtenir de bons résultats en utilisant ces paramètres. Le système MIDI produit un rapport pour chaque échantillon contenant une table avec une ligne par pic réalisé.

Le logiciel indique le temps de rétention des pics, la surface des pics, l’identification des pics, ainsi que l’ECL ou la longueur de chaîne estimée, un paramètre utilisé pour l’identification des pics et un facteur de réponse, un paramètre utilisé pour normaliser les variations et la réponse du détecteur par rapport au temps de rétention. L’ECL exprime où, parmi une série de FAME en chaîne droite, chaque FAME inconnu élue. Ainsi, par exemple, si le temps de rétention d’un élué inconnu se situe à mi-chemin entre ceux d’une chaîne de 12 et 13 atomes de carbone, l’ECL est déclarée comme une chaîne de carbone de 12,5.

Le logiciel compare l’ECL de chaque pic à celles des EMAG dans une base de données et, en cas de correspondance, attribue le nom correspondant à l’inconnu. Dans les cas où deux EMA de la base de données ont des ECL très proches, le logiciel signale les deux noms en indiquant le plus proche en premier. Les tableaux de données des rapports peuvent être rassemblés dans une feuille de calcul ou une base de données.

Après ajustement pour le facteur de réponse, les aires des pics peuvent ensuite être comparées à l’aire des pics d’un étalon externe ou interne pour arriver à une concentration de l’extrait. En divisant par la masse de sol extraite, les données peuvent être exprimées en masse d’EMAG par gramme de sol ou, en utilisant également le poids moléculaire de chaque EMAG, en nanomoles par gramme de sol. Les biomarqueurs EMAG peuvent ensuite être additionnés pour produire la biomasse de guildes microbiennes, et ces guildes peuvent être analysées plus en détail.

Par exemple, nous voyons ici des prairies non fertilisées avec plus de biomasse d’EMAG que des prairies fertilisées. Les deux ont plus de biomasse que les champs de maïs voisins. De plus, les AMAG sont associés à des groupes fonctionnels particuliers comme les champignons ou les bactéries.

Ces associations sont spécifiques à l’écosystème, il est donc important de ne pas trop les généraliser. Ce type d’analyse permet de déterminer si certains groupes sont plus abondants dans certains environnements. Ici, les champignons sont plus abondants dans la prairie non fertilisée que dans le champ de maïs.

Et enfin, une autre façon d’examiner la composition globale de la communauté microbienne est de comparer en examinant l’abondance relative de tous les EMAG à la fois à l’aide de méthodes d’ordination telles que la mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique, NMDS, ou l’analyse en composantes principales, PCA. Dans une ordination, les communautés microbiennes qui sont plus similaires seront plus proches les unes des autres. Ainsi, d’après nos données d’exemple, le maïs et les prairies non fertilisées sont très éloignés les uns des autres, tandis que certains échantillons de prairies fertilisées ont des communautés microbiennes qui ressemblent à celles du maïs et d’autres ressemblent à la prairie non fertilisée.

Les communautés microbiennes sont souvent très variables, même au sein d’un environnement, de sorte qu’elles ne se séparent pas toujours nettement. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension du processus par lequel les biomarqueurs lipidiques des membranes cellulaires des micro-organismes sont extraits du sol. L’extraction des acides gras phospholipidiques est un moyen efficace, rapide et peu coûteux d’évaluer les guildes microbiennes et la biomasse microbienne totale grâce à l’identification de biomarqueurs microbiens uniques.