Méthode d'extraction et d'analyse de lipides pour caractériser les microbes du sol dans les expériences avec de nombreux échantillons

L'objectif de cette vidéo est de décrire une méthode qui augmente le débit tout en équilibrant l'effort et la précision pour l'extraction de lipides à partir des membranes cellulaires de microorganismes, afin d'être utilisée dans la caractérisation des lipides totaux ainsi que de l'abondance relative des lipides indicateurs permettant de déterminer la structure des communautés microbiennes du sol, notamment dans les études impliquant de nombreux échantillons. Sur le terrain, vous devez tenir compte de l'hétérogénéité du sol en collectant les échantillons de manière à ce qu'ils soient représentatifs de votre site. Afin de préserver la communauté microbienne au moment de l'échantillonnage, les échantillons doivent être transportés depuis le terrain sur de la glace.

Une fois revenu au laboratoire, retirez les racines et les pierres et décomposez les mottes par tamisage grossier. Cela permet également d'homogénéiser votre échantillon. Préparez le séchage par congélation en plaçant des sous-échantillons dans des récipients appropriés et procédez au séchage par congélation dès que possible.

Une fois que les sols sont séchés par lyophilisation, les conserver dans un récipient hermétique avec un dessiccant jusqu'à l'extraction. Il est préférable de stocker les sols lyophilisés à -80 °C. En préparation pour l'extraction, sortir les sols lyophilisés du stockage et les broyer. Les méthodes de broyage comprennent le broyeur à billes, le dispositif à billes ou le mortier et le pilon.

Après avoir broyé le sol à nouveau, homogénéisez soigneusement vos échantillons de sol et stockez-les au congélateur. Tout le matériel de laboratoire doit être scrupuleusement propre. Tout résidu de détergent, de graisse ou de saleté peut fausser les résultats en apparaissant comme un pic sur le chromatogramme CG final.

Les extractions sont effectuées dans des tubes à centrifuger en téflon de 30 millilitres, qui doivent être rincés avec du solvant. Ajouter deux à trois millilitres d'hexane dans les tubes et homogénéiser brièvement au vortex. Verser l'hexane dans un autre tube et homogénéiser au vortex.

Deux à trois millilitres d'hexane peuvent être utilisés pour rincer en série six tubes. Conserver les tubes rincés à l'hexane retournés sous la hotte et jeter l'hexane utilisé dans un contenant approprié pour déchets. La verrerie peut être placée au four ou rincée avec un solvant juste avant utilisation.

Le grillage assure la propreté de la verrerie par l'oxydation des résidus à haute température. Envelopper la verrerie dans deux à trois couches de papier d'aluminium et placer dans le four à grillage. Régler à 450 degrés C et, une fois que le four a atteint la température définie, faire chauffer pendant au moins 4 heures et demie.

Laisser refroidir au moins une heure avant de sortir du four. Étiqueter et peser les tubes en téflon rincés à l'hexane. Ajouter le sol dans les tubes en téflon pour centrifugation et les re-peser afin d'obtenir la masse de sol.

Préparez toujours au moins deux blancs par lot et incluez un témoin de contrôle, de préférence un sol qui a été précédemment extrait, si vous souhaitez vérifier que l'extraction a correctement fonctionné. Extractions lipidiques. Préparez trois pipettes de re-prélèvement de cinq à 10 millilitres pour le tampon phosphate, le chloroforme et le méthanol.

Le chloroforme est un liquide très dense possédant une faible tension superficielle. Veillez à ce que la quantité que vous distribuez soit précise et constante. Gardez la bouteille remplie au moins à moitié de liquide.

Dans la hotte, ajoutez les réactifs au sol dans le tube en téflon dans l'ordre suivant : tampon phosphate, chloroforme et méthanol. Il s'agit de la première extraction physique des lipides à partir de votre matériau d'échantillon. Les recettes des solutions de réactifs sont incluses dans le protocole écrit.

Les proportions de solvant et l'ordre d'ajout sont importants pour une séparation adéquate des phases organique et aqueuse. Laisser aux sols le temps de s'humidifier après l'ajout du tampon avant d'ajouter le chloroforme. Si cela est pratique, les agents d'extraction peuvent être combinés et ajoutés en une seule prise pour la deuxième extraction et toutes les extractions ultérieures.

Fermer hermétiquement les tubes en téflon et les couvrir pour les protéger de la lumière. Les placer horizontalement sur l'agitateurs en veillant à ce qu'ils soient bien fixés. Agiter à vitesse élevée pendant une heure.

Pendant que les tubes sont en agitation, préparez deux longs tubes en verre pour chaque échantillon comme suit. Étiquetez le tube, ajoutez le même volume de chloroforme que celui ajouté au sol et un volume égal de tampon phosphate. Après avoir retiré les tubes en téflon de l'agitateeur, centrifugez les tubes à 25 degrés C pendant 10 minutes à 2 500 tr/min.

Ensuite, sous la hotte avec les lumières éteintes, versez le surnageant du tube en téflon dans l'un des tubes longs. La séparation des phases doit être visible dans le tube en verre. La couche inférieure contient le solvant organique, principalement du chloroforme, ainsi que les lipides.

Cette extraction est répétée. Versez le surnageant dans le second tube préparé précédemment. Vous avez maintenant extrait physiquement les lipides du sol deux fois.

Pour la plupart des sols, cela est suffisant. Boucher solidement tous les tubes longs de classe avec des bouchons revêtus de téflon et les retourner 10 fois pour mélanger. Séparer les phases par décantation gravitationnelle pendant une nuit.

Laisser reposer les échantillons sans perturbation toute la nuit pour permettre la séparation complète des deux phases. Pour ce faire, conserver les échantillons dans un placard sombre ou recouverts de papier d'aluminium à température ambiante. Il est acceptable de laisser les extraits se séparer pendant le week-end.

Jour deux, isolement des lipides. Le jour deux, la couche aqueuse est aspirée et les lipides sont concentrés par élimination du solvant dans un système d'évaporation sous vide. Les échantillons peuvent également être séchés en les plaçant dans un bain d'eau ou de sable et en appliquant un léger flux d'azote.

Le liquide dans les tubes doit maintenant être bien séparé et en grande partie clair. Dans le cas contraire, ou si l'interface entre les deux couches est particulièrement épaisse, laissez la séparation se poursuivre pendant un autre jour. Installez un aspirateur sous vide dans la hotte.

Il s'agit d'un ballon à branchement latéral relié à une pompe à vide par un tube en Tygon à ailettes et une pipette Pasteur. Avec la pompe en marche, utilisez la pipette pour prélever la phase aqueuse dans le ballon. Aspirez la couche supérieure et l'interface.

Cela se situera à environ 2/3 de la hauteur. Faites cela pour deux à trois séries de tubes en verre. La couche supérieure peut contenir quelques particules de sol.

Les retirer si possible. Combiner l'extrait du deuxième et/ou du troisième ensemble de tubes avec celui des deux premiers en effectuant une décantation soigneuse. Veiller à ne pas verser les matières solides et rincer les parois du tube en le faisant tourner.

Utilisez une pipette propre pour chaque échantillon et répétez ce processus pour les échantillons restants. Une fois les extraits de chloroforme combinés et après quelques minutes de repos, examinez la surface du liquide. Souvent, une fine couche d'eau résiduelle se forme.

S'il est présent, aspirez avant de continuer. L'eau résiduelle pourrait attaquer les doubles liaisons des acides gras, mais une très petite quantité devrait co-évaporer avec les solvants lors du séchage des échantillons. Suspendez tous les échantillons à l'aide de l'appareil d'évaporation sous vide.

Fermer hermétiquement les tubes et les conserver dans un congélateur à -80 °C. Jour trois, saponification et méthylation. Tout d'abord, allumer les bains-marie. Vérifier le niveau d'eau et régler le bain 1 à 95 °C et le bain 2 à 80 °C. À l'aide d'une pipette multipipette, ajouter un millilitre du réactif de saponification, Réactif 1, aux lipides séchés.

Fermer hermétiquement, vortexer brièvement, puis placer sur un support. Une fois cette étape terminée, placer le support de tubes dans le bain d'eau à 95 degrés C et attendre cinq minutes. Retirer le support de tubes du bain et vérifier les fuites éventuelles des tubes.

Cela sera indiqué par des bulles qui montent dans le tube comme une mousse. Revisser ou remplacer les bouchons des tubes qui fuient. Poursuivre le chauffage des tubes dans le bain d'eau pendant encore 10 minutes.

Réduisez la température du bain-marie à 80 degrés C et poursuivez l'incubation pendant encore 15 minutes. Retirez les tubes et refroidissez-les en plaçant la grille dans un récipient d'eau du robinet. N'utilisez pas d'eau glacée.

Une fois les échantillons refroidis, ajouter deux millilitres du réactif de méthylation, Réactif 2, à chaque échantillon. Refermer hermétiquement et mélanger par vortex pendant cinq à dix secondes. Des sels sous forme de grains peuvent devenir visibles sous forme de précipité dans la solution, ce qui se produit parfois en raison d’un excès de réactifs.

Placer le porte-tubes dans le bain-marie à 80 degrés C et incuber pendant 10 minutes. Retirer le porte-tubes du bain-marie et le placer dans un récipient d'eau du robinet pour le refroidir. Agiter le porte-tubes pour accélérer le processus de refroidissement.

À l’aide d’une pipette multipipette, ajouter 1,25 millilitre d’hexane et d’éther méthyl tert-butylique, réactif 3, dans chaque tube afin d’extraire la phase. Fermer hermétiquement les bouchons et placer les tubes sur un agitateur pendant 10 minutes. Après agitation, laisser reposer le support de tubes pendant 10 minutes afin de permettre la séparation des phases.

Transférez la phase organique, qui est maintenant la couche supérieure, dans un tube en verre court à l’aide d’une pipette Pasteur. Il est préférable de récupérer la majeure partie du liquide. De très petites quantités de la phase aqueuse n’affecteront pas l’extraction.

Répétez l'extraction de la phase aqueuse en ajoutant le réactif 3, en agitant, en laissant les phases se séparer, puis en transférant la phase supérieure. Selon l'état de la phase inférieure, vous pouvez répéter cette étape une fois supplémentaire, pour un total de trois transferts. Ajoutez 3 millilitres de la solution basique de lavage, le réactif 4, qui est une solution diluée d'hydroxyde de sodium, aux extraits contenus dans les tubes courts.

Fermer hermétiquement les tubes à essai et vortexer de 20 à 30 secondes, puis centrifuger pendant trois minutes à 2 000 tr/min. Après centrifugation, à l’aide d’une pipette Pasteur propre, aspirer la phase organique supérieure et la transférer dans un flacon brun de quatre millilitres. Veiller soigneusement à ne pas aspirer la moindre quantité de la phase aqueuse.

L'étape suivante consiste à évaporer le solvant à sec dans un appareil d'évaporation sous vide. Jour quatre, préparation des extraits pour l'analyse en chromatographie en phase gazeuse. À l'aide de la pipette, ajouter 100 microlitres du Réactif 3 dans chacun des vials de 4 millilitres contenant la phase sèche.

Vortexez l'échantillon, puis laissez-le reposer pendant 10 minutes. À l’aide de la deuxième pipette, transférez soigneusement les FAME en suspension dans un flacon pour chromatographie en phase gazeuse. Ajoutez un autre aliquot de solvant dans le flacon de quatre millilitres et vortexez brièvement.

Faites rouler le flacon afin de garantir que les FAME résiduelles présentes sur les parois du flacon soient dissoutes. À l’aide de la deuxième pipette, transférez le solvant dans le flacon pour chromatographie en phase gazeuse. Terminez le transfert en ajoutant une troisième aliquote de solvant dans le flacon, en vortexant, puis en transférant le contenu dans le flacon pour chromatographie en phase gazeuse.

Fermer le flacon de chromatographie en phase gazeuse et conserver au congélateur. Conserver les flacons de chromatographie en phase gazeuse scellés au congélateur avant l'analyse. Analyse par chromatographie en phase gazeuse.

Pour utiliser ce système, l'analyse doit être réalisée à l'aide d'une colonne GC spécifique. Le chromatographe en phase gazeuse est équipé d'une entrée sélective non sélective munie d'un revêtement en verre de 4 mm de diamètre intérieur, contenant une bourre de laine de verre désactivée. L'entrée est réglée à 250 degrés C et fonctionne en mode pression constante.

Le gaz vecteur est l'hydrogène. Du diazote et de l'air sont nécessaires comme gaz de support pour le détecteur. Une colonne Agilent Ultra 2 est utilisée.

La colonne mesure 25 mètres de longueur, avec un diamètre intérieur de 2 millimètres et une épaisseur de film de phase stationnaire de 33 micromètres. La phase stationnaire de cette colonne est composée de 5 % de phényle et de 95 % de polysiloxane méthylé, également connue sous le nom de colonne de type DB-5. Pour analyser les extraits lipidiques, un aliquot de deux microlitres est injecté avec un rapport de division de 100:1, la température du four étant fixée à 170 degrés C. Après l'injection, le four est programmé pour augmenter de cinq degrés par minute jusqu'à 300 degrés C, puis maintenu à cette température pendant 12 minutes.

Une série d'injections du standard MIDI est effectuée et les résultats sont utilisés pour effectuer des réglages conformément aux instructions du manuel MIDI. Une fois calibré de cette manière, le système peut nécessiter occasionnellement de légers ajustements, mais devrait généralement fournir de bons résultats en utilisant ces paramètres. Le système MIDI produit un rapport pour chaque échantillon contenant un tableau avec une ligne par pic détecté.

Le logiciel indique le temps de rétention du pic, la surface du pic, l'identification du pic, ainsi que la longueur de chaîne équivalente (ECL) ou longueur de chaîne estimée, un paramètre utilisé pour l'identification des pics, et un facteur de réponse, un paramètre permettant de normaliser les variations et la réponse du détecteur par rapport au temps de rétention. La longueur de chaîne équivalente exprime la position d'élution de chaque FAME inconnu parmi une série de FAME à chaîne droite. Par exemple, si le temps de rétention d'un FAME inconnu correspond à la moitié de l'intervalle entre ceux d'une chaîne à 12 et 13 atomes de carbone, la longueur de chaîne équivalente est indiquée comme une chaîne à 12,5 atomes de carbone.

Le logiciel compare les ECL de chaque pic à ceux des MEAG présents dans une base de données et, lorsque des correspondances sont trouvées, attribue le nom correspondant à l'inconnu. Lorsque deux MEAG de la base de données ont des ECL très proches, le logiciel indique les deux noms, en listant en premier celui dont l'ECL est la plus proche. Les tableaux de données provenant des rapports peuvent être regroupés dans un tableur ou une base de données.

Après correction du facteur de réponse, les aires des pics peuvent être comparées à l'aire du pic d'un étalon externe ou interne afin de déterminer la concentration de l'extrait. En divisant par la masse de sol extraite, les données peuvent être exprimées en masse de MEAG par gramme de sol ou, en utilisant également la masse moléculaire de chaque MEAG, en nanomoles par gramme de sol. Les MEAG biomarqueurs peuvent ensuite être sommés pour obtenir la biomasse des guildes microbiennes, et ces guildes peuvent faire l'objet d'une analyse plus poussée.

Par exemple, ici, nous observons des prairies non fertilisées avec une biomasse FAME supérieure à celle des prairies fertilisées. Les deux présentent une biomasse plus élevée que celle des champs de maïs voisins. De plus, les FAME sont associés à des groupes fonctionnels particuliers, comme les champignons ou les bactéries.

Ces associations sont spécifiques à l'écosystème, il est donc important de ne pas les généraliser excessivement. Ce type d'analyse indique si certains groupes sont plus abondants dans certains environnements. Ici, les champignons sont plus abondants dans la prairie non fertilisée que dans le champ de maïs.

Et enfin, une autre façon d’analyser la composition globale de la communauté microbienne consiste à comparer l’abondance relative de tous les FAME simultanément à l’aide de méthodes d’ordination telles que l’échelonnement multidimensionnel non métrique (NMDS) ou l’analyse en composantes principales (ACP). Dans une telle ordination, les communautés microbiennes plus similaires sont situées plus près les unes des autres. Ainsi, d’après nos données d’exemple, le maïs et la prairie non fertilisée sont très éloignés, tandis que certains échantillons de prairie fertilisée présentent des communautés microbiennes qui ressemblent soit à celles du maïs, soit à celles de la prairie non fertilisée.

Les communautés microbiennes sont souvent très variables, même au sein d'un même environnement, et ne se séparent donc pas toujours nettement. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait bien comprendre le processus d'extraction des biomarqueurs lipidiques provenant des membranes cellulaires des micro-organismes à partir du sol. L'extraction des acides gras phospholipidiques constitue un moyen efficace, rapide et peu coûteux d'évaluer les guildes microbiennes et la biomasse microbienne totale grâce à l'identification de biomarqueurs microbiens spécifiques.