Une méthode simple d'extraction fractionnée pour l'analyse complète des métabolites, des lipides et des protéines à partir d'un seul échantillon

L’objectif global de cette méthode est de récupérer et d’analyser toutes les principales entités moléculaires, y compris les métabolites polaires et semi-polaires, les lipides et les protéines à partir d’un seul échantillon en utilisant une simple extraction fractionnée de méthyl-tributyléther . En général, les scientifiques ont du mal à analyser plusieurs classes de composés à partir d’un seul échantillon. À l’aide de l’extraction au MTBE que nous présentons ici, vous pouvez extraire et analyser plusieurs classes de composés, comme les lipides, les métabolites et les protéines, à partir d’un seul échantillon.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut extraire de manière robuste toutes les classes de composés moléculaires à partir d’une petite quantité d’aliquote d’échantillon unique. Cette méthode aide à répondre à des questions fondamentales en biologie des systèmes, car elle fournit la base expérimentale de l’analyse multiomique, fournissant des fractions qui peuvent être utilisées pour l’analyse par la protéomique, la lipidomique et la métabolomique. Le protocole suivant est démontré à l’aide de tissus foliaires d’Arabidopsis.

Les Arabidopsis sont de petites plantes à fleurs de la famille des Brassicaceae et sont apparentées au chou. Commencez cette procédure en pré-refroidissant les supports de tube d’homogénéisation de tissus dans de l’azote liquide pendant au moins 10 minutes. Retirez les échantillons d’azote liquide et placez-les dans les porte-tubes.

Et puis retirez les supports de tube de l’azote liquide. Placez rapidement les porte-tubes dans l’homogénéisateur de tissus et réglez l’homogénéisateur pour broyer la matière biologique en une poudre fine et homogène. Pour les feuilles, utilisez 20 hertz pendant une minute.

Le temps et la vitesse d’homogénéisation peuvent varier en fonction du tissu. Assurez-vous d’homogénéiser jusqu’à ce que l’échantillon résultant soit une poudre très fine. Et l’échantillon doit être conservé congelé à chaque étape de l’homogénéisation.

Homogénéiser les échantillons, puis retirer les échantillons biologiques des porte-tubes. Et s’ils ne sont pas utilisés tout de suite, placez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient extraits. Étiquetez quatre tubes de microcentrifugation à fond rond de deux millilitres avec le numéro de l’échantillon.

Pré-refroidissez les tubes et certaines spatules en les immergeant dans de l’azote liquide. Une fois que les tubes et les spatules sont refroidis, placez l’un des tubes sur une balance analytique et utilisez une spatule pour aliquoter 25 milligrammes de poudre de tissu dans le tube de microcentrifugation. Enregistrez le poids exact de chaque échantillon, puis placez immédiatement les échantillons aliquotiques dans de l’azote liquide.

Effectuez cette étape rapidement pour éviter de décongeler la matière végétale. Conservez les échantillons aliquotes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la fin de l’extraction. Pour préparer l’extraction, pré-refroidissez le mélange d’extraction de méthyl tert-butyl éther, ou MTBE méthanol, préparé comme décrit dans le document d’accompagnement, dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius.

Retirez les échantillons aliquotes et ajoutez un millilitre du mélange d’extraction pré-refroidi dans chaque tube d’échantillon. Effectuez cette étape rapidement. Le MTBE a une faible viscosité et peut s’écouler de la pointe de la pipette.

Mélangez immédiatement chaque échantillon sur un mélangeur vortex jusqu’à ce que le tissu soit bien homogénéisé dans le mélange d’extraction. Conservez les tubes dans un rack sur la paillasse jusqu’à ce que tous les échantillons aient été extraits. Cette étape est cruciale.

Ici, nous précipitons les protéines et inactivons leurs activités enzymatiques. Incuber tous les échantillons sur un agitateur orbital à 100 tr/min pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, sonicez les échantillons pendant 15 minutes dans un bain de sonication glacé.

Ensuite, pour fractionner par séparation de phase, ajoutez 650 microlitres d’une solution à trois pour un d’eau et de méthanol dans chaque tube d’échantillon. Mélangez ensuite en vortex pendant une minute. Centrifugez les échantillons à une vitesse de 20 000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après cette étape, manipulez les tubes avec précaution pour éviter de mélanger les deux phases liquides et éviter de perturber la pastille précipitée. À ce stade, il y a deux phases liquides admissibles avec une pastille solide au fond du tube. La phase supérieure non polaire contient des lipides.

La phase aqueuse inférieure contient des métabolites polaires et semi-polaires. La pastille contient des protéines, des amidons et la paroi cellulaire. Transférez 500 microlitres de solvant de la phase supérieure contenant des lipides dans un tube à microcentrifuger de 1,5 millilitre marqué.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirez soigneusement la phase lipidique restante et jetez-la. Ensuite, transférez 400 microlitres du solvant de la phase inférieure dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre étiqueté. Transférez une aliquote supplémentaire de 200 microlitres dans un tube de micro-fuge pour effectuer une analyse plus approfondie, telle que l’analyse des métabolites basée sur la chromatographie en phase gazeuse.

Retirez et jetez le reste de la phase aqueuse en pipetant l’excédent de volume. Ensuite, pour laver la pastille de paroi protéine-amidon-cellule obtenue, ajoutez 500 microlitres de méthanol, puis agitez-la pendant une minute. Centrifugez les échantillons à une vitesse de 10 000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Évaporer le solvant des échantillons de lipides à l’aide d’un évaporateur à flux d’azote pour éviter les modifications oxydatives des lipides. Les échantillons séchés qui en résultent doivent être analysés immédiatement. Évaporer le solvant des échantillons aqueux pendant la nuit dans un concentrateur sous vide sans chauffage.

Les échantillons aqueux séchés peuvent être conservés pendant plusieurs semaines à moins 80 degrés Celsius avant d’être analysés. Remettre en suspension les fractions lipidiques séchées dans 400 microlitres d’une solution de sept à trois acétonitrile et 2-propanol. Transférez suffisamment de liquide dans les flacons en verre et fermez hermétiquement.

Ensuite, placez les flacons en verre dans un échantillonneur automatique refroidi à quatre degrés Celsius. Injectez deux microlitres par échantillon et séparez les lipides sur une colonne C8 en phase inverse maintenue à 60 degrés Celsius à l’aide d’un système UPLC fonctionnant à un débit de 400 microlitres par minute. Utiliser les phases mobiles décrites dans le tableau 1 du document d’accompagnement pour la séparation chromatographique.

Acquérir les spectres de masse en mode ionisation positive et négative à l’aide d’un instrument MS approprié couvrant la gamme de masse entre 150 et 1500 rapport charge/masse. Remettre en suspension la phase polaire dans 200 microlitres d’une solution de méthanol de qualité UPLC dans de l’eau. Transférez suffisamment de liquide dans les flacons en verre et fermez hermétiquement.

Ensuite, placez les flacons en verre dans un échantillonneur automatique refroidi, à quatre degrés Celsius. Injectez deux microlitres de chaque échantillon et séparez les métabolites sur une colonne RP C-18 maintenue à 40 degrés Celsius à l’aide d’un système UPLC fonctionnant à un débit de 400 microlitres par minute. Utiliser les phases mobiles pour la séparation chromatographique avec les paramètres indiqués dans le tableau 2 du document d’accompagnement.

Acquérez des spectres de masse à balayage complet en mode ionisation positive et négative à l’aide d’un spectromètre de masse approprié couvrant une plage de masse comprise entre 50 et 1500 rapport masse/charge. Enfin, effectuez l’extraction, la digestion et l’analyse des protéines, comme décrit dans le document d’accompagnement. 25 milligrammes de tissu foliaire d’Arabidopsis ont été récoltés, broyés et extraits avant d’être soumis à trois plateformes analytiques UPLC-MS.

Les métabolites primaires et secondaires polaires et semi-polaires ont été analysés à partir de la phase polaire par C-18 UPLC-MS en phase inverse. Les chromatogrammes de pointe basique des lipides, montrés dans le panneau supérieur, et les métabolites semi-polaires, montrés dans le panneau inférieur, ont été analysés en mode d’ionisation positive. Le graphique circulaire dans le coin supérieur droit de chaque chromatogramme montre le nombre de lipides et de métabolites identifiés attribués à différentes classes chimiques.

Par exemple, 58 lipides différents ont été attribués au groupe des triacylglycérides, indiqué dans le tableau supérieur par TAG. D’autres métabolites hydrophiles de cette fraction, tels que les sucres et les acides aminés polaires, qui ne présentent pas une bonne rétention sur le matériau en phase inverse, peuvent être analysés par d’autres méthodes analytiques, telles que le GCMS, ou la chromatographie liquide à interaction hydrophile. Les protéines qui ont été extraites de l’extraction ont été digérées en solution et analysées à l’aide d’un LCMS au fusil de chasse.

Le graphique circulaire présenté dans le coin supérieur droit indique le nombre de protéines identifiées attribuées à différents processus biologiques. Par exemple, 268 protéines ont été classées dans la catégorie de localisation. En résumé, plus de 200 espèces lipidiques, 50 métabolites semi-polaires annotés et plusieurs milliers de protéines peuvent être identifiés en routine à partir d’échantillons comme celui utilisé dans cet exemple.

De plus, la méthode a montré une large applicabilité en utilisant différents tissus, organes et matériaux de culture cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire et d’analyser la plupart des composés essentiels à partir d’un seul échantillon. Lors de cette procédure, il est important de garder tous les échantillons congelés, de broyer correctement le matériau et d’utiliser des solvants et des produits chimiques de qualité analytique.

À la suite de cette procédure, toutes les méthodes analytiques peuvent être utilisées pour déterminer la composition moléculaire des échantillons extraits.