Une méthode simple d'extraction fractionnée pour l'analyse complète des métabolites, des lipides et des protéines à partir d'un seul échantillon

L'objectif général de cette méthode est de récupérer et d'analyser toutes les grandes entités moléculaires, notamment les métabolites polaires et semi-polaires, les lipides et les protéines, à partir d'un seul échantillon, en utilisant une extraction simple par méthyl-tert-butyl éther fractionnée. En général, les scientifiques ont du mal à analyser plusieurs classes de composés à partir d'un seul échantillon. Grâce à l'extraction par MTBE que nous présentons ici, vous pouvez extraire et analyser plusieurs classes de composés, comme les lipides, les métabolites et les protéines, à partir d'un même échantillon.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'extraire de façon robuste toutes les classes de composés moléculaires à partir d'une faible quantité d'un seul aliquot d'échantillon. Cette méthode aide à répondre à des questions fondamentales en biologie des systèmes, car elle fournit la base expérimentale pour une analyse multiomique, en produisant des fractions pouvant être utilisées pour des analyses en protéomique, lipidomique et métabolomique. Le protocole suivant est démontré à l'aide de tissu foliaire d'Arabidopsis.

Les Arabidopsis sont de petites plantes à fleurs de la famille des Brassicacées, apparentées au chou. Commencez cette procédure en prérefroidissant les supports de tubes du homogénéisateur dans l'azote liquide pendant au moins 10 minutes. Retirez les échantillons de l'azote liquide et placez-les dans les supports de tubes.

Puis retirez les porte-tubes de l'azote liquide. Placez rapidement les porte-tubes dans l'homogénéisateur de tissus et réglez l'homogénéisateur pour broyer le matériel biologique en une poudre fine et homogène. Pour les feuilles, utilisez 20 hertz pendant une minute.

Le temps et la vitesse d'homogénéisation peuvent varier selon le tissu. Assurez-vous d'effectuer l'homogénéisation jusqu'à ce que l'échantillon obtenu forme une poudre très fine. L'échantil doit rester congelé à chaque étape de l'homogénéisation.

Homogénéisez les échantillons, puis retirez les échantillons biologiques des supports de tubes. S’ils ne doivent pas être utilisés immédiatement, placez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius jusqu’à leur extraction ultérieure. Étiquetez quatre microcentrifugeuses sûres à fond rond de deux millilitres avec le numéro d’échantillon.

Prérefroidissez les tubes et quelques spatules en les plongeant dans de l'azote liquide. Une fois que les tubes et les spatules sont refroidis, placez l'un des tubes sur une balance analytique et utilisez une spatule pour aliquoter 25 milligrammes de poudre de tissu dans un tube de microcentrifugation. Notez le poids exact de chaque échantillon, puis placez immédiatement les échantillons aliquotés dans de l'azote liquide.

Effectuez cette étape rapidement afin d'éviter la décongélation du matériel végétal. Conservez les échantillons aliquotés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'extraction ultérieure. Pour préparer l'extraction, prérefroidissez le mélange d'éther méthyl tert-butylique, ou MTBE, et de méthanol, préparé comme décrit dans le document accompagnant, dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius.

Retirer les échantillons aliquotés et ajouter un millilitre du mélange d'extraction prérefroidi dans chaque tube d'échantillon. Effectuer cette étape rapidement. Le MTBE a une faible viscosité et peut s'écouler au bout de la pipette.

Mélanger immédiatement chaque échantillon au vortex jusqu'à ce que le tissu soit bien homogénéisé dans le mélange d'extraction. Maintenir les tubes dans un porte-tubes sur la paillasse jusqu'à ce que tous les échantillons aient été extraits. Cette étape est cruciale.

Ici, nous précipitons les protéines et inactivons leurs activités enzymatiques. Incubez tous les échantillons sur un agitateur orbital à 100 tr/min pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, soniquez les échantillons pendant 15 minutes dans un bain de sonication glacé.

Ensuite, pour fractionner par séparation de phase, ajoutez 650 microlitres d'une solution d'eau et de méthanol dans un rapport trois pour un à chaque tube d'échantillon. Mélangez ensuite par vortexage pendant une minute. Centrifugez les échantillons à une vitesse de 20 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après cette étape, manipulez les tubes avec précaution afin d'éviter le mélange des deux phases liquides et de ne pas perturber le culot précipité. À ce stade, il existe deux phases liquides admissibles avec un culot solide au fond du tube. La phase supérieure non polaire contient les lipides.

La phase aqueuse inférieure contient les métabolites polaires et semi-polaires. Le culot contient les protéines, les amidons et la paroi cellulaire. Transférez 500 microlitres du solvant provenant de la phase supérieure contenant les lipides dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre étiqueté.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirez soigneusement la phase lipidique résiduelle et jetez-la. Transférez ensuite 400 microlitres du solvant provenant de la phase inférieure dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre étiqueté. Transférez un aliquot supplémentaire de 200 microlitres dans un tube microfuge afin d’effectuer des analyses complémentaires, telles qu’une analyse des métabolites par chromatographie en phase gazeuse.

Retirez et jetez le reste de la phase aqueuse en pipettant le volume excédentaire. Ensuite, pour laver le culot de paroi cellulaire protéine-amidon obtenu, ajoutez 500 microlitres de méthanol, puis vortexez pendant une minute. Centrifugez les échantillons à une vitesse de 10 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Évaporer le solvant des échantillons lipidiques à l’aide d’un évaporateur à flux d’azote afin d’éviter les modifications oxydatives des lipides. Les échantillons séchés obtenus doivent être analysés immédiatement. Évaporer le solvant des échantillons aqueux toute la nuit dans un concentrateur sous vide sans chauffage.

Les échantillons aqueux séchés peuvent être conservés pendant plusieurs semaines à moins 80 degrés Celsius avant analyse. Résuspendre les fractions lipidiques séchées dans 400 microlitres d'une solution de sept à trois d'acétonitrile sur 2-propanol. Transférer un volume suffisant de liquide dans des vials en verre et boucher hermétiquement.

Ensuite, placer les vials en verre dans un échantillonneur automatique refroidi à quatre degrés Celsius. Injecter deux microlitres par échantillon et séparer les lipides sur une colonne en phase inverse C8 maintenue à 60 degrés Celsius à l’aide d’un système UPLC fonctionnant à un débit de 400 microlitres par minute. Utiliser les phases mobiles décrites dans le tableau 1 du document accompagnant pour la séparation chromatographique.

Acquérir les spectres de masse en mode ionisation positive et négative à l'aide d'un instrument de spectrométrie de masse adapté couvrant la plage de masse entre 150 et 1500 de rapport charge-masse. Résuspendre la phase polaire dans 200 microlitres d'une solution de méthanol de qualité UPLC à l'eau en proportion un pour un. Transférer un volume suffisant de liquide dans des vials en verre et boucher hermétiquement.

Ensuite, placer les vials en verre dans un échantillonneur automatique refroidi à quatre degrés Celsius. Injecter deux microlitres de chaque échantillon et séparer les métabolites sur une colonne RP C-18 maintenue à 40 degrés Celsius à l’aide d’un système UPLC fonctionnant à un débit de 400 microlitres par minute. Utiliser les phases mobiles pour la séparation chromatographique avec les paramètres indiqués dans le tableau 2 du document accompagnant.

Acquérir des spectres de masse en mode ionisation positive et négative à l’aide d’un spectromètre de masse adapté, couvrant un domaine de masse compris entre 50 et 1500 rapports masse/charge. Enfin, réaliser l’extraction, la digestion et l’analyse des protéines, comme décrit dans le document accompagnant. Vingt-cinq milligrammes de tissu foliaire d’Arabidopsis ont été récoltés, broyés et extraits avant d’être soumis à trois plates-formes analytiques UPLC-MS.

Les métabolites primaires et secondaires polaires et semi-polaires ont été analysés à partir de la phase polaire par UPLC-MS en phase inverse C-18. Les chromatogrammes du pic de base des lipides, présentés dans le panneau supérieur, et des métabolites semi-polaires, présentés dans le panneau inférieur, ont été analysés en mode d'ionisation positive. Le camembert situé dans le coin supérieur droit de chaque chromatogramme indique le nombre de lipides et de métabolites identifiés attribués à différentes classes chimiques.

Par exemple, 58 lipides différents ont été attribués au groupe des triacylglycérols, indiqués dans le graphique supérieur sous l'acronyme TAG. Les métabolites plus hydrophiles de cette fraction, tels que les sucres et les acides aminés polaires, qui ne présentent pas une bonne rétention sur le matériau en phase inverse, peuvent être analysés par d'autres méthodes analytiques, comme la GC-MS ou la chromatographie liquide d'interaction hydrophile. Les protéines récupérées lors de l'extraction ont été digérées en solution et analysées par spectrométrie de masse en mode shotgun LCMS.

Le diagramme circulaire illustré dans le coin supérieur droit indique le nombre de protéines identifiées attribuées à différents processus biologiques. Par exemple, 268 protéines ont été attribuées à la catégorie de localisation. En résumé, plus de 200 espèces lipidiques, 50 métabolites semi-polaires annotés et plusieurs milliers de protéines peuvent être couramment identifiés à partir d'échantillons tels que celui utilisé dans cet exemple.

En outre, la méthode a démontré une large applicabilité en utilisant différents tissus, organes et matériaux issus de cultures cellulaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire et analyser la plupart des composés essentiels à partir d'un seul échantillon. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir tous les échantillons congelés, de broyer correctement le matériau et d'utiliser des solvants et produits chimiques de qualité analytique.

Après cette procédure, toutes les méthodes analytiques peuvent être utilisées pour déterminer la composition moléculaire des échantillons extraits.