Name: Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de drosophile Junction neuromusculaires Morphology (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Découvrez deux algorithmes d'analyse d'images pour quantifier automatiquement la morphologie des jonctions neuromusculaires de Drosophila. Cette méthode permet une analyse objective et reproductible des synapses en haut débit.

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Nous reconnaissons le centre boursier drosophile Drosophila Resource Center Vienna et Bloomington (NIH P40OD018537) pour fournir des souches de drosophile. Nous remercions Jack Fransen du Centre d&#39;imagerie Microscopie pour le soutien d&#39;experts en imagerie. Cette étude a été soutenue par des subventions et VIDI TOP (917-96-346, 912-12-109) de l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), par deux DCN / Université Radboud de bourses de doctorat du Centre médical, par le Réseau arriération mentale allemand financé par le programme NGFN + du ministère fédéral allemand de l&#39;éducation et de la recherche (BMBF) et par la grande échelle de l&#39;Union européenne du 7e PC Gencodys réseau intégré (SANTÉ-241995) à l&#39;AS. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

<ol><li>Lin, Y. C., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synapse+and+dendrite+maintenance+and+their+disruption+in+psychiatric+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).</li>
<li>van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+networks+in+intellectual+disabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.</a> Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).</li>
<li>Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+vulnerability+of+synapses+and+circuits+associated+with+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders.</a> J Neurochem. 126, 165-182 (2013).</li>
<li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+dendritic+structure+on+firing+pattern+in+model+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons.</a> Nature. 382, 363-366 (1996).</li>
<li>Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+form+to+function%3A+calcium+compartmentalization+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).</li>
<li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li>
<li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22, 383-388 (2012).</li>
<li>Mehnert, K. I., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+morphology+of+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila.</a> Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).</li>
<li>Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).</li>
<li>Ruiz-Canada, C., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+on+the+use+of+the+Drosophila+embryonic%2Flarval+neuromuscular+junction+as+a+model+system+to+study+synapse+development+and+function%2C+and+a+brief+summary+of+pathfinding+and+target+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).</li>
<li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).</li>
<li>Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-function+screen+for+genes+controlling+motor+axon+guidance+and+synaptogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila.</a> Curr Biol. 11, 417-430 (2001).</li>
<li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34, 729-741 (2002).</li>
<li>Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+suppressors+of+Drosophila+NSF2+neuromuscular+junction+overgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth.</a> Genetics. 170, 779-792 (2005).</li>
<li>Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+restrains+synaptic+growth+by+attenuating+a+MAP+kinase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal.</a> Neuron. 51, 57-69 (2006).</li>
<li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Fiji-Based+Algorithm+That+Systematically+Quantifies+Nine+Synaptic+Parameters+Provides+Insights+into+Drosophila+NMJ+Morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1004823(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Dubos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+depletion+of+intellectual+disability+and+Parkinsonism+candidate+gene+ATP6AP2+in+fly+and+mouse+induces+cognitive+impairment+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration.</a> Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).</li>
<li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNijhof%2C+B+%22Drosophila+NMJ+Morphometrics%22">Drosophila NMJ Morphometrics</a>. , figshare 
 
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.
">https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.
</a> (2017).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+IJ+1.46%22">ImageJ User Guide IJ 1.46</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html</a> (2014).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+IJ+1.46%22">ImageJ User Guide IJ 1.46</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/Auto_Threshold">http://fiji.sc/Auto_Threshold</a> (2014).</li>
<li>Pielage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+of+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58, 195-209 (2008).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ankyrin+2+is+required+for+synaptic+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability.</a> Neuron. 58, 210-222 (2008).</li>
<li>Iqbal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+and+heterozygous+disruptions+of+ANK3%3A+at+the+crossroads+of+neurodevelopmental+and+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders.</a> Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).</li>
<li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).</li>
<li>Wan, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+regulates+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Highwire regulates synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 26, 313-329 (2000).</li>
<li>Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+maturation+and+maintenance+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).</li>
<li>Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-type+specific+functions+of+DNT1%2C+DNT2+and+Spz+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PLoS One. 8, e75902(2013).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
</ol>

Les auteurs ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

« Drosophile NMJ Morphometrics » et « drosophile NMJ Morphometrics bouton » sont de puissants outils pour les chercheurs intéressés à évaluer la morphologie des synapses. évaluation manuelle des paramètres NMJ est laborieuse; on estime que les macros économiseraient un chercheur expérimenté jusqu&#39;à 15 min / NMJ consacré à la segmentation d&#39;images manuel. Avec une à deux douzaines de synapses évaluées par état ou génotype, cela résume rapidement à des quantités considérables de temps économisé, même dans les études à petite échelle. Lorsque vous effectuez de grands écrans, le gain en utilisant l&#39;analyse à haut débit, par rapport à l&#39;évaluation et la quantification manuelle, peut être immense. En plus de l&#39;augmentation du débit, les macros fournissent facilement une analyse objective; ils excluent les préjugés personnels qui s&#39;y opposent des expériences aveuglés ainsi que les différences interpersonnelles qui se produisent lorsque plusieurs chercheurs sont impliqués dans l&#39;analyse. Enfin, les macros sont un sensible et précisaly des caractéristiques NMJ, permettant l&#39;identification des régulateurs synaptiques qui causent plutôt subtiles que des défauts NMJ dramatiques et ont jusqu&#39;à présent restés incompris par l&#39;œil du chercheur. Des informations détaillées sur les procédures de validation et les algorithmes utilisés dans les macros se trouvent dans la publication Nijhof et al. 17. La fonctionnalité des macros a été validé pour mesurer de manière appropriée les caractéristiques morphologiques de Drosophila melanogaster NMJs au muscle 4. Ensuite, on a démontré que les macros sont également appropriés pour analyser synapses à d&#39; autres muscles de cet organisme. Il est probable que les macros peuvent également être utilisés pour mesurer les paramètres morphologiques de NMJ avec une structure similaire dans d&#39; autres espèces, y compris d&#39; autres espèces de drosophiles et les insectes autres. Même NMJs très éloignés dans l&#39; évolution, par exemple, NMJs de souris, montrent une conformation structurelle assez similaire 29. Les macros n&#39;ont pas été testées sur des préparations NMJ d&#39;autres espèces, mais les utilisateurs potentiels sont encouragés à tester les macros à ces fins. Il est très important que l&#39;utilisateur explore les différents seuils d&#39;auto-et algorithmes pour définir / choisir les paramètres macro les plus appropriés pour les images. Avec ces paramètres, on obtient une précision d&#39;environ 95% lors de l&#39;évaluation macro a été comparée à l&#39;évaluation manuelle. Réglage des paramètres macro correctement pour le segment 100% des images peut être une procédure très laborieuse, voire impossible. Par conséquent, l&#39;exclusion des images pas correctement segmentés est recommandée si leur nombre est inférieur à 5%. De toute évidence, si la qualité des images est faible, les macros génèrent des rapports plus élevés de segmentations d&#39;image non satisfaisantes. images de faible qualité influenceront de la même évaluation manuelle et ne peuvent donc pas être lié à la performance des macros. Néanmoins, les macros sont assez robustes car ils ont été conçus pour l&#39;images généré sur un microscope à haute teneur (un microscope à fluorescence automatisé qui permet l&#39; imagerie d&#39; un grand nombre d&#39;échantillons) 17. Un point critique est que l&#39;utilisateur inspecte visuellement toutes les images de résultats générés par les macros. Cela permettra de détecter et d&#39;exclure des images avec une segmentation peu satisfaisante. Dans l&#39;article 6 de ce protocole, l&#39;utilisateur est guidé comment ajuster les paramètres pour la segmentation d&#39;image correcte lors de l&#39;exécution de la sous-macro « Analyser ». Pour familiariser rapidement avec les exigences des macros et comment régler les paramètres macro un dossier appelé « Examples_adjusting paramètres macro » est inclus dans le référentiel macro https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Treize sous-répertoires, chacun avec des exemples d&#39;images obtenues à différentes plates-formes de microscopie (microscope à haute teneur / confocale / fluorescence) et des différentes immunomarquages, sont fournis. Un PDF intitulé « Guide des exemples » est inclus dans le mêmedossier dans lequel les paramètres requis pour chaque exemple sont fournis, ainsi que d&#39;un document de texte fournissant les résultats attendus et des images de résultats. Les macros ont été conçues pour traiter les images enregistrées en tant que fichiers séparés .tiff, néanmoins certains utilisateurs ont sauvé leurs images dans un format différent. Le site Web suivant https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 contient un dossier nommé « drosophile NMJ » où trois exemples de fichiers (exemple 1 - 3) et le document « Guide des exemples » avec des instructions détaillées comment importer des images dans la macro sinon stockées sous forme de fichiers .tiff séparés peuvent également être trouvés dans le même dossier. Ensemble, &quot;drosophile NMJ Morphometrics&quot; et macros &quot;drosophile NMJ Morphométrie&quot; quantifient bouton dix caractéristiques différentes NMJ: zone NMJ, périmètre NMJ, le nombre de boutons, zone NMJ de bouton, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre de islaPDN, nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives. Cela donne un grand avantage sur les outils disponibles à ce jour qui permettent d&#39; évaluer seulement un ou quelques caractéristiques synaptiques 30, 31. Analyse quantitative multiparamétrique porte un grand potentiel pour de nouvelles découvertes, par exemple, pour identifier les régulateurs de nouvelles qui contrôlent un à de nombreux aspects de la biologie des synapses. Il fournit également la résolution requise pour déterminer les gènes qui coregulate exactement les mêmes caractéristiques NMJ ou qui se chevauchent et sont donc susceptibles d&#39;opérer dans les voies moléculaires communes. Enfin, il ouvre la possibilité d&#39;étudier comment les différents paramètres synaptiques sont corrélés entre eux dans des conditions non perturbées 17 et dont les gènes assurent ces corrélations morphométriques coordonnées. Pris ensemble, ce protocole illustre comment utiliser les deux macros « drosophile NMJ Morphometrics » et« Drosophila NMJ Bouton Morphometrics », qui effectue une quantification objective et sensible de dix caractéristiques morphologiques NMJ d&#39;une manière à haut débit.

Les troubles cognitifs tels que la déficience intellectuelle, troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont souvent caractérisées par la fonction synaptique anormale 1, 2, 3. la morphologie et la fonction des synapses sont étroitement imbriquées; défauts morphologiques peuvent provoquer un dysfonctionnement synaptique et, inversement, la transmission synaptique aberrante aura un impact sur la maturation synaptique et de la morphologie 4, 5, 6. Un certain nombre d&#39;organismes modèles ont été utilisés afin de mieux comprendre la biologie des synapses et faire la lumière sur la façon dont les changements affectent synaptiques le fonctionnement du cerveau dans la santé et la maladie 7, 8, 9. Le NMJ Drosophila est un largement étudiée et bien établie dans le modèle in vivo pour glutamatergique synapse biologie 10, 11. Au cours des dernières décennies, ce modèle a été utilisé pour des études physiologiques et génétiques concentré, ainsi que pour les écrans génétiques à grande échelle, dans le but de détecter des différences morphologiques entre NMJs. En particulier, les écrans génétiques avant ont identifié de nombreux organismes de réglementation et des mécanismes sous - jacents cruciaux le développement des synapses et la fonction 12, 13, 14, 15, 16. Cependant, la plupart de ces écrans se est fondé sur une évaluation visuelle de la morphologie terminale NMJ et sur la détection qualitative des anomalies synaptiques ou notation semi-quantitative de quelques caractéristiques morphologiques. En conséquence, plutôt subtiles anomalies morphologiques synaptiques qui ne sont pas visibles à l&#39;œil humain sont facilement passer inaperçus. Afin de pouvoir détecter globalement des différences quantitatives, lesNMJ doit être évaluée avec précision par quantification systématique des paramètres morphologiques d&#39;intérêt. La mesure des caractéristiques NMJ manuellement est laborieuse, en particulier lorsqu&#39;il y a plusieurs caractéristiques NMJ d&#39;intérêt et / ou lors de l&#39;exécution des projections génétiques à grande échelle. Afin de soutenir multiparamétrique, analyse morphologique à haut débit et d&#39;atteindre la quantification objective, deux macros « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été développés 17. Les deux macros fonctionnent dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;images open source Fidji 18, et peuvent quantifier les images confocale et nonconfocal. &quot;Drosophila NMJ morphométrie&quot; mesures bornes NMJ immunocolorées avec le disque de marqueur postsynaptique grand-1 (DLG-1) ou la peroxydase de raifort présynaptique (HRP), co-marquées avec le marqueur de zone active Bruchpilot (Brp). Il quantifie neuf Paramé morphologiqueTER (décrit plus en détail ci - dessous): Surface de la jonction neuromusculaire, le périmètre NMJ, le nombre de boutons, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre d&#39;îles, le nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives dans le terminal synaptique (figure 1) . Bien qu&#39;un algorithme pour déterminer le nombre de boutons est présent dans cette macro, il ne répondait pas aux critères de précision 17. Pour évaluer correctement le nombre de boutons, il est nécessaire d&#39;utiliser la macro « drosophile NMJ Bouton Morphometrics », qui est spécialement conçu pour quantifier boutons à l&#39; aide de préparations NMJ immunocolorées par anti-Synaptotagmin (SYT) ou de la protéine de chaîne anti-Cystéine (Csp), et co-immuno avec Brp. La macro « drosophile NMJ Bouton Morphometrics » quantifie les paramètres suivants: nombre de boutons, zone NMJ de bouton, longueur NMJ, NMJ longueur de la branche la plus longue, le nombre d&#39;îles, nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zo actifnes (Figure 2). Les macros sont constituées de trois sous-macros: (I) « Autre empiler » identifie tous les fichiers d&#39;image disponibles et crée Z-hyperstacks et les projections d&#39;intensité maximale des deux canaux. En sortie, cette macro va générer deux nouveaux fichiers par synapse appelé « stack_image_name » et « flatstack_image_name ». II) « Définir ROI » ouvrira toutes les images de projection maximale de « flatstack_image_name » consécutivement et les présenter à la demande de définir manuellement la région d&#39;intérêt (ROI) dans laquelle le terminal synaptique spécifique d&#39;intérêt est présent. Ceci a été mis en œuvre pour permettre à l&#39; exclusion des synapses reliant les muscles adjacents et / ou d&#39; autres types de terminaux synaptiques (comme 1s) qui peuvent être présents dans les images 11. (III) « Analyse » applique une analyse entièrement automatisée pour toutes les régions des images à l&#39;intérieur de la ROI. Commeà la suite de cette étape, l&#39;utilisateur obtiendra deux nouveaux fichiers: « Results.txt » où toute la mesure numérique sera annotées et un « res_image_name.tif » où les segmentations d&#39;images sous-jacentes produites par la macro seront illustrées. Au cours de l&#39;analyse d&#39;image de trois structures sont dérivées de chaque terminal synaptique: le contour NMJ, le squelette NMJ, et le nombre de zones actives Brp-positives. Le contour NMJ est utilisé pour déterminer la zone NMJ et son périmètre et une séparation des bassins versants après indique le nombre de boutons. À partir du squelette, cinq caractéristiques NMJ sont déduits: la longueur totale NMJ, la somme de la longueur du plus long trajet continu reliant les deux points d&#39;extrémité (longueur plus longue branche), le nombre de compartiments non connectés par NMJ (dénommé « îlots » ), le nombre de branches, et le nombre de points de ramification (un point de dérivation relie trois branches ou plus). Le nombre de zones actives est déterminée dans le canal en comptant Brptaches Brp positives. Le contour NMJ annoté (ligne jaune), le squelette NMJ (ligne bleue), et le nombre de zones actives Brp-positives (indiqués par les foyers blanc) sont affichés dans un tableau de résultats et les mesures des paramètres sont traités à un (. txt) du fichier de sortie (figure 3). Drosophila NMJ Morphometrics » et &quot;drosophile NMJ Bouton Morphometrics&quot; ont d&#39; abord été décrits et largement validés par Nijhof et al. 17. Ce manuscrit se concentre sur la méthodologie pour analyser la morphologie NMJ à l&#39; aide des macros &quot;drosophile NMJ Morphométrie&quot; et &quot;drosophile NMJ Bouton Morphométrie&quot;. Néanmoins, avant analyses macro assistée, dissections NMJ et immunomarquages ​​doivent être effectuées. Ce sont des étapes cruciales, et la combinaison de marqueurs utilisés pour l&#39;immunohistochimie doit convenir à des analyses macro. Ces étapes sont brièvement mentionnées en soiction 1 de ce protocole et diriger l&#39;utilisateur vers des références décrivant en détail les protocoles d&#39;exécuter ces procédures.

<table><tbody><tr><td><fort>Immunomarquage</fort></td><td></td><td></td><td><fort>Dilution</fort></td></tr><tr><td>Anti-disques de souris grand 1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (combiné à l’aide du kit de marquage Zenon Alexa Fluor 528)</td></tr><tr><td>Lapin anti-raifort peroxydase</td><td>Jackson IR</td><td>323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Lapin anti-Synaptotagmin</td><td>Don de Hugo Bellen</td><td></td><td>Jan-00</td></tr><tr><td>Protéine de chaîne anti-cystéine de souris</td><td>Études développementales Banque d’hybridomes</td><td>DCSP-1(ab49)</td><td>1/10 (combinée à l’aide du kit de marquage Zenon Alexa Fluor 528)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Souris anti-Bruchpilot</td><td>Etudes développementales Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Jan-50</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin Alexa Fluor 568</td><td>Life technologies</td><td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 Souris IgG1 Kit d’étiquetage</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Material</strong</td><td>>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal ou microscope à fluorescence</td><td>Leica SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ordinateur Mac ou Pc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

deux algorithmes pour quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; junction neuromusculaires morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

morphologie synaptique est étroitement liée à l&#39;efficacité synaptique, et dans de nombreux cas des défauts synaptiques morphologiques conduisent finalement à un mauvais fonctionnement synaptique. La jonction neuromusculaire des larves de drosophile (NMJ), un modèle bien établi pour synapses glutamatergiques, a été largement étudié depuis des décennies. L&#39;identification de mutations provoquant des défauts morphologiques NMJ a révélé un répertoire de gènes qui régulent le développement des synapses et de la fonction. Un grand nombre d&#39; entre eux ont été identifiés dans des études à grande échelle axés sur des approches qualitatives pour détecter des anomalies morphologiques du NMJ drosophile. Un inconvénient des analyses qualitatives est que de nombreux acteurs subtils qui contribuent à la morphologie NMJ restent probablement inaperçues. Alors que les analyses quantitatives sont nécessaires pour détecter les différences morphologiques plus subtiles, ces analyses ne sont pas encore courante, car ils sont laborieux. Ce protocole décrit en détail deux algorithmes d&#39;analyse d&#39;image &quot;drosophile </em&gt; NMJ Morphometrics » et « drosophile NMJ Bouton Morphometrics », disponible sous forme de macros Fidji compatibles, pour l&#39; analyse morphométrique quantitative, précise et objective de la NMJ drosophile. Cette méthodologie est développée pour analyser les terminaux NMJ immunomarquées avec les marqueurs couramment utilisés Dlg-1 et . Brp de plus, son application plus large à d&#39;autres marqueurs tels que Hrp, Csp et Syt est présenté dans ce protocole Les macros sont en mesure d&#39;évaluer neuf caractéristiques NMJ morphologiques:. zone NMJ, périmètre NMJ, le nombre de boutons, longueur NMJ, NMJ branche la plus longue longueur, le nombre d&#39;îles, le nombre de branches, le nombre de points de ramification et le nombre de zones actives dans le terminal NMJ.

Deux algorithmes d&#39;analyse d&#39;images, « drosophile NMJ Morphométrie » et « drosophile NMJ Bouton Morphométrie » ont été créés, pour quantifier automatiquement neuf caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire drosophile (NMJ).

Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; Junction neuromusculaires Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

L’objectif général de cette procédure est de quantifier automatiquement les caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire de la drosophile à l’aide de macros logicielles morphométriques. Cette méthode peut aider à identifier les régulateurs du développement des synapses, une question clé en neurobiologie. Le principal avantage de cette technique est la quantification automatique de plusieurs caractéristiques NMJ.Cela permet une analyse objective de la morphologie de la JNM dans les hautes fréquences. Nous avons décidé de développer cette méthodologie pour pouvoir étudier la morphologie de la JNM dans un grand nombre de modèles de maladies. Nous avons réfléchi à des moyens de prévenir leurs différences personnelles et d’accélérer considérablement le processus de quantification.La démonstration visuelle de cette méthode est très utile. Les paramètres de macro appropriés sont cruciaux et certaines étapes peuvent être difficiles pour les nouveaux utilisateurs, surtout lorsqu’ils ne sont pas familiers avec le logiciel VT. Pour ce protocole, générez des piles d’images de NMJ et enregistrez-les sous forme de fichiers TIFF individuels, où le premier canal montre la coloration DLG1, ou un marqueur similaire, et le deuxième canal montre la coloration BRP.Pour commencer, créez des projections C et des hyper-piles des fichiers d’image NMJ. Ouvrez les options du plugin et sélectionnez Drosophila NMJ Morphometrics. Maintenant, identifiez la chaîne de fichiers unique que le microscope a attribuée à la série d’images lors de leur stockage au format TIFF.Ce sera à la fin du nom de l’image. Copiez et collez la chaîne donnée au plan le plus bas et au numéro de canal dans la fenêtre de réglage de la chaîne de fichier unique. Ensuite, sélectionnez la sous-macro convertir en pile et choisissez le répertoire ou le dossier où se trouvent les images.Pour chaque fichier image, deux nouveaux fichiers sont créés avec les noms par défaut stack et flat stack, suivis du nom de l’image d’origine. Les fichiers d’origine peuvent ensuite être supprimés pour économiser de l’espace de stockage. Ensuite, dans l’interface de Drosophila NMJ Morphometrics, sélectionnez la sous-macro define ROI et choisissez le répertoire du fichier image.Lorsque la première projection s’ouvre, sélectionnez l’outil de sélections à main levée. Utilisez ensuite la souris pour définir une région contenant un terminal NMJ complet d’intérêt. Une fois sélectionné, cliquez sur OK dans la fenêtre de définition du terminal.Continuez ainsi jusqu’à ce que les terminaux NMJ soient définis dans toutes les projections. La macro fait avancer le processus automatiquement. Pour chaque fichier image, un nouveau fichier est créé avec les noms par défaut ROI suivis du nom de l’image d’origine.Pour quantifier les caractéristiques de la NMJ, rendez-vous d’abord sur l’interface de morphométrie de la NMJ de la drosophile et réglez l’échelle. Par exemple, si un pixel de l’image correspond à 0,72 micron, définissez les pixels d’échelle sur un et la distance d’échelle sur 0,072. Sélectionnez ensuite la sous-macro d’analyse et s’il y a deux images de canal, basculez également le poids.Appuyez sur OK et, lorsque vous y êtes invité, sélectionnez le répertoire du fichier image. Le temps de traitement peut être de plusieurs minutes par synapse. Après l’analyse, de nouveaux fichiers d’images pour chaque synapse analysée sont stockés dans le dossier parental et les mesures quantitatives en sont les résultats.txt. Inspectez toutes les images et excluez les images présentant des erreurs de segmentation. Par exemple, certaines parties de la terminaison synaptique peuvent ne pas être incluses dans le contour jaune.Des parties de l’arrière-plan peuvent être incluses dans le terminal synaptique. Une ligne squelette bleue peut s’étendre au-delà de la terminaison synaptique. Il se peut qu’il y ait trop de zones actives ou que certaines zones actives ne soient pas détectées.Si plus de 5 % des images présentent des erreurs de segmentation, explorez différents algorithmes d’analyse pour améliorer le traitement de l’image. Les sections vidéo à venir décrivent comment définir un grand nombre de ces paramètres d’analyse de macros. Pour ajuster la valeur du rayon de la balle roulante de la macro, sélectionnez trois projections NMJ Z représentatives de l’ensemble de données d’image.Supprimez le nom de l’image de résolution du résultat et le nom de l’image de la pile des deux zones actives, précédemment créés par l’analyse de sous-macro. Ouvrez les fichiers de nom d’image de pile pour chaque image sélectionnée, puis, dans la barre d’outils, sélectionnez Diviser les canaux pour créer une image du canal un et une image du canal deux et enregistrez ces fichiers. Ouvrez l’image appartenant au canal un, qui dans ce cas correspond à l’immunomarquage DLG un.Maintenant, exécutez le filtre soustraire l’arrière-plan, qui se trouve sous l’onglet processus. Définissez le rayon de la balle roulante sur une valeur qui augmente le contraste entre la synapse et l’arrière-plan. Créez une projection Z avec un type de projection comme intensité maximale et enregistrez l’image.Exécutez ensuite l’algorithme de soustraction d’arrière-plan avec le nouveau rayon de la balle roulante sur toutes les projections Z et enregistrez les résultats. Pour déterminer les meilleurs seuils automatiques pour la macro, ouvrez les projections C enregistrées et exécutez le seuil automatique avec l’option try all. À partir des images résultantes, trouvez l’algorithme le plus approprié pour les images et procédez à l’aide de ce paramètre de seuil lors de l’exécution de la macro pour d’autres images.La définition des différents seuils automatiques est essentielle pour une bonne segmentation de l’image par la macro. Pour cette raison, pour quantifier correctement huit des paramètres de signalisation, il est important de se familiariser avec les 16 options de seuil automatique offertes par le logiciel. Appuyez sur le bouton plus pour zoomer sur l’image de résultat du seuil automatique.Les noms des algorithmes se trouvent sous chaque image de résultat. Dans cet exemple, le meilleur algorithme de seuil automatique pour la définition du seuil de contour NMJ est Huang. Pour le seuil de squelette, le meilleur paramètre est Li et le meilleur paramètre pour le seuil de zone active est Huang.Pour définir la valeur maximale de tolérance au bruit de la macro, revenez aux images NMJ représentatives d’origine. Ouvrez le canal BRP. Allez dans l’onglet des plugins dans le menu contextuel et sélectionnez 3D maximum.Après un court instant, une nouvelle image apparaîtra, puis fermera l’image d’origine. Ensuite, utilisez la commande 3D minimale. Fermez ensuite le maximum de C2 stacks synapse une image et sélectionnez l’image nouvellement créée minimum de maximum C2 stack synapse one.Utilisez maintenant la commande find maxima. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Aperçu de la sélection de points et réglez la tolérance au bruit sur 50. Les points maximaux sont alors indiqués par de petites croix, qui ne doivent couvrir que les zones actives des synapses.Si trop de croix sont faites, augmentez la valeur de tolérance au bruit. Si certaines des zones actives ne sont pas annotées, diminuez la valeur de tolérance au bruit. Utilisez la valeur de seuil dérivée pour le champ de tolérance au bruit find maxima de la macro.Pour choisir la valeur maximale de tolérance au bruit, il est important de quantifier correctement le nombre de zones actives. Parfois, il est nécessaire d’essayer différentes valeurs pour définir la bonne. Ajustez maintenant toutes les valeurs dérivées dans les algorithmes de seuil dans l’interface de macro et exécutez l’analyse de sous-macro sur les images représentatives qui ont été utilisées à l’origine pour définir les paramètres de macro.Un nouveau fichier avec les zones actives indiquées par des points blancs sera créé. Ouvrez ce fichier en le faisant glisser et en le déposant dans la barre d’outils et en sélectionnant le projet Z avec un type de projection sous forme de tranches. Ainsi, un fichier de projection est réalisé.L’étape suivante consiste à ajuster le seuil. Dans la nouvelle fenêtre de seuil, faites glisser la barre supérieure pour choisir une valeur de seuil où tous les foyers souhaités sont lus. Voici les points positifs de BRP.Utilisez cette valeur comme seuil inférieur BRP puncta. Maintenant, réexécutez l’analyse sur les images NMJ représentatives d’origine à l’aide des valeurs et des algorithmes précédemment définis, puis de la nouvelle valeur de seuil inférieure BRP ponctuelle. Les images résultantes doivent répondre aux critères d’analyse critique.Utilisez maintenant les paramètres définis pour exécuter la macro sur toutes les images NMJ obtenues dans les mêmes conditions. La macrométrie morphométrique de la NMJ de la drosophile a été utilisée pour valider différents défauts synaptiques connus dans trois génotypes mutants. Ankyrin deux mutants sont connus pour avoir des boutons fusionnés et des NMJ plus petits.À l’aide de la macro, l’aire et le périmètre du panuronil et du quirin ont été mesurés et se sont révélés significativement plus petits que ceux des témoins. La GTPase Rab3 est nécessaire pour une bonne distribution de bruckpila. Lorsqu’il est perturbé, il y a moins de zones actives.En utilisant le macro panuronil Rab 3, les mouches renversées avaient en moyenne 138 zones actives par terminal NMJ contre 290 détectées dans les témoins. Le fil haut est un régulateur important de la croissance des NMJ et, lorsqu’ils sont mutés, les NMJ ont une ramification étendue à leurs terminaux. À l’aide du macro panuronil, les lignes d’inactivation de l’ARNAI ont montré des augmentations significatives de plusieurs paramètres dérivés du squelette à leurs NMJ, y compris la longueur totale, la longueur de branche la plus longue, le nombre de branches et le nombre de points de ramification.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’utilisation et du réglage des paramètres de la macro morphométrique NMJ de la drosophile. Une fois maîtrisée, l’analyse de 50 synapses peut être effectuée en une heure. Cela permet d’économiser environ 15 minutes de temps de quantification par synapse.Il est important d’acquérir des images de bonne qualité du NMJ. Plus les images sont bonnes, meilleures seront les performances de la macro. Cette technique aidera les chercheurs dans le domaine de la neurobiologie à quantifier efficacement les paramètres morphologiques de la NMJ de la drosophile.

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