Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de drosophile Junction neuromusculaires Morphology

L’objectif général de cette procédure est de quantifier automatiquement les caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire de la drosophile à l’aide de macros logicielles morphométriques. Cette méthode peut aider à identifier les régulateurs du développement des synapses, une question clé en neurobiologie. Le principal avantage de cette technique est la quantification automatique de plusieurs caractéristiques NMJ.

Cela permet une analyse objective de la morphologie de la JNM dans les hautes fréquences. Nous avons décidé de développer cette méthodologie pour pouvoir étudier la morphologie de la JNM dans un grand nombre de modèles de maladies. Nous avons réfléchi à des moyens de prévenir leurs différences personnelles et d’accélérer considérablement le processus de quantification.

La démonstration visuelle de cette méthode est très utile. Les paramètres de macro appropriés sont cruciaux et certaines étapes peuvent être difficiles pour les nouveaux utilisateurs, surtout lorsqu’ils ne sont pas familiers avec le logiciel VT. Pour ce protocole, générez des piles d’images de NMJ et enregistrez-les sous forme de fichiers TIFF individuels, où le premier canal montre la coloration DLG1, ou un marqueur similaire, et le deuxième canal montre la coloration BRP.

Pour commencer, créez des projections C et des hyper-piles des fichiers d’image NMJ. Ouvrez les options du plugin et sélectionnez Drosophila NMJ Morphometrics. Maintenant, identifiez la chaîne de fichiers unique que le microscope a attribuée à la série d’images lors de leur stockage au format TIFF.

Ce sera à la fin du nom de l’image. Copiez et collez la chaîne donnée au plan le plus bas et au numéro de canal dans la fenêtre de réglage de la chaîne de fichier unique. Ensuite, sélectionnez la sous-macro convertir en pile et choisissez le répertoire ou le dossier où se trouvent les images.

Pour chaque fichier image, deux nouveaux fichiers sont créés avec les noms par défaut stack et flat stack, suivis du nom de l’image d’origine. Les fichiers d’origine peuvent ensuite être supprimés pour économiser de l’espace de stockage. Ensuite, dans l’interface de Drosophila NMJ Morphometrics, sélectionnez la sous-macro define ROI et choisissez le répertoire du fichier image.

Lorsque la première projection s’ouvre, sélectionnez l’outil de sélections à main levée. Utilisez ensuite la souris pour définir une région contenant un terminal NMJ complet d’intérêt. Une fois sélectionné, cliquez sur OK dans la fenêtre de définition du terminal.

Continuez ainsi jusqu’à ce que les terminaux NMJ soient définis dans toutes les projections. La macro fait avancer le processus automatiquement. Pour chaque fichier image, un nouveau fichier est créé avec les noms par défaut ROI suivis du nom de l’image d’origine.

Pour quantifier les caractéristiques de la NMJ, rendez-vous d’abord sur l’interface de morphométrie de la NMJ de la drosophile et réglez l’échelle. Par exemple, si un pixel de l’image correspond à 0,72 micron, définissez les pixels d’échelle sur un et la distance d’échelle sur 0,072. Sélectionnez ensuite la sous-macro d’analyse et s’il y a deux images de canal, basculez également le poids.

Appuyez sur OK et, lorsque vous y êtes invité, sélectionnez le répertoire du fichier image. Le temps de traitement peut être de plusieurs minutes par synapse. Après l’analyse, de nouveaux fichiers d’images pour chaque synapse analysée sont stockés dans le dossier parental et les mesures quantitatives en sont les résultats.

txt. Inspectez toutes les images et excluez les images présentant des erreurs de segmentation. Par exemple, certaines parties de la terminaison synaptique peuvent ne pas être incluses dans le contour jaune.

Des parties de l’arrière-plan peuvent être incluses dans le terminal synaptique. Une ligne squelette bleue peut s’étendre au-delà de la terminaison synaptique. Il se peut qu’il y ait trop de zones actives ou que certaines zones actives ne soient pas détectées.

Si plus de 5 % des images présentent des erreurs de segmentation, explorez différents algorithmes d’analyse pour améliorer le traitement de l’image. Les sections vidéo à venir décrivent comment définir un grand nombre de ces paramètres d’analyse de macros. Pour ajuster la valeur du rayon de la balle roulante de la macro, sélectionnez trois projections NMJ Z représentatives de l’ensemble de données d’image.

Supprimez le nom de l’image de résolution du résultat et le nom de l’image de la pile des deux zones actives, précédemment créés par l’analyse de sous-macro. Ouvrez les fichiers de nom d’image de pile pour chaque image sélectionnée, puis, dans la barre d’outils, sélectionnez Diviser les canaux pour créer une image du canal un et une image du canal deux et enregistrez ces fichiers. Ouvrez l’image appartenant au canal un, qui dans ce cas correspond à l’immunomarquage DLG un.

Maintenant, exécutez le filtre soustraire l’arrière-plan, qui se trouve sous l’onglet processus. Définissez le rayon de la balle roulante sur une valeur qui augmente le contraste entre la synapse et l’arrière-plan. Créez une projection Z avec un type de projection comme intensité maximale et enregistrez l’image.

Exécutez ensuite l’algorithme de soustraction d’arrière-plan avec le nouveau rayon de la balle roulante sur toutes les projections Z et enregistrez les résultats. Pour déterminer les meilleurs seuils automatiques pour la macro, ouvrez les projections C enregistrées et exécutez le seuil automatique avec l’option try all. À partir des images résultantes, trouvez l’algorithme le plus approprié pour les images et procédez à l’aide de ce paramètre de seuil lors de l’exécution de la macro pour d’autres images.

La définition des différents seuils automatiques est essentielle pour une bonne segmentation de l’image par la macro. Pour cette raison, pour quantifier correctement huit des paramètres de signalisation, il est important de se familiariser avec les 16 options de seuil automatique offertes par le logiciel. Appuyez sur le bouton plus pour zoomer sur l’image de résultat du seuil automatique.

Les noms des algorithmes se trouvent sous chaque image de résultat. Dans cet exemple, le meilleur algorithme de seuil automatique pour la définition du seuil de contour NMJ est Huang. Pour le seuil de squelette, le meilleur paramètre est Li et le meilleur paramètre pour le seuil de zone active est Huang.

Pour définir la valeur maximale de tolérance au bruit de la macro, revenez aux images NMJ représentatives d’origine. Ouvrez le canal BRP. Allez dans l’onglet des plugins dans le menu contextuel et sélectionnez 3D maximum.

Après un court instant, une nouvelle image apparaîtra, puis fermera l’image d’origine. Ensuite, utilisez la commande 3D minimale. Fermez ensuite le maximum de C2 stacks synapse une image et sélectionnez l’image nouvellement créée minimum de maximum C2 stack synapse one.

Utilisez maintenant la commande find maxima. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Aperçu de la sélection de points et réglez la tolérance au bruit sur 50. Les points maximaux sont alors indiqués par de petites croix, qui ne doivent couvrir que les zones actives des synapses.

Si trop de croix sont faites, augmentez la valeur de tolérance au bruit. Si certaines des zones actives ne sont pas annotées, diminuez la valeur de tolérance au bruit. Utilisez la valeur de seuil dérivée pour le champ de tolérance au bruit find maxima de la macro.

Pour choisir la valeur maximale de tolérance au bruit, il est important de quantifier correctement le nombre de zones actives. Parfois, il est nécessaire d’essayer différentes valeurs pour définir la bonne. Ajustez maintenant toutes les valeurs dérivées dans les algorithmes de seuil dans l’interface de macro et exécutez l’analyse de sous-macro sur les images représentatives qui ont été utilisées à l’origine pour définir les paramètres de macro.

Un nouveau fichier avec les zones actives indiquées par des points blancs sera créé. Ouvrez ce fichier en le faisant glisser et en le déposant dans la barre d’outils et en sélectionnant le projet Z avec un type de projection sous forme de tranches. Ainsi, un fichier de projection est réalisé.

L’étape suivante consiste à ajuster le seuil. Dans la nouvelle fenêtre de seuil, faites glisser la barre supérieure pour choisir une valeur de seuil où tous les foyers souhaités sont lus. Voici les points positifs de BRP.

Utilisez cette valeur comme seuil inférieur BRP puncta. Maintenant, réexécutez l’analyse sur les images NMJ représentatives d’origine à l’aide des valeurs et des algorithmes précédemment définis, puis de la nouvelle valeur de seuil inférieure BRP ponctuelle. Les images résultantes doivent répondre aux critères d’analyse critique.

Utilisez maintenant les paramètres définis pour exécuter la macro sur toutes les images NMJ obtenues dans les mêmes conditions. La macrométrie morphométrique de la NMJ de la drosophile a été utilisée pour valider différents défauts synaptiques connus dans trois génotypes mutants. Ankyrin deux mutants sont connus pour avoir des boutons fusionnés et des NMJ plus petits.

À l’aide de la macro, l’aire et le périmètre du panuronil et du quirin ont été mesurés et se sont révélés significativement plus petits que ceux des témoins. La GTPase Rab3 est nécessaire pour une bonne distribution de bruckpila. Lorsqu’il est perturbé, il y a moins de zones actives.

En utilisant le macro panuronil Rab 3, les mouches renversées avaient en moyenne 138 zones actives par terminal NMJ contre 290 détectées dans les témoins. Le fil haut est un régulateur important de la croissance des NMJ et, lorsqu’ils sont mutés, les NMJ ont une ramification étendue à leurs terminaux. À l’aide du macro panuronil, les lignes d’inactivation de l’ARNAI ont montré des augmentations significatives de plusieurs paramètres dérivés du squelette à leurs NMJ, y compris la longueur totale, la longueur de branche la plus longue, le nombre de branches et le nombre de points de ramification.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’utilisation et du réglage des paramètres de la macro morphométrique NMJ de la drosophile. Une fois maîtrisée, l’analyse de 50 synapses peut être effectuée en une heure. Cela permet d’économiser environ 15 minutes de temps de quantification par synapse.

Il est important d’acquérir des images de bonne qualité du NMJ. Plus les images sont bonnes, meilleures seront les performances de la macro. Cette technique aidera les chercheurs dans le domaine de la neurobiologie à quantifier efficacement les paramètres morphologiques de la NMJ de la drosophile.