Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au Drosophila Larvaire jonction neuromusculaire

La morphologie, la taille et l’emplacement des organites intracellulaires sont conservés au cours de l’évolution et semblent affecter directement leur fonction. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces processus est devenu un objectif important de la biologie moderne. Nous montrons ici comment ces études peuvent être facilitées par l’application de techniques quantitatives.

L’objectif général de cette méthodologie est de montrer comment effectuer des analyses quantitatives de traits anatomiques. La quantification des phénotypes affectant la morphologie, la taille et la position des noyaux avec les muscles striés des larves de drosophile est démontrée. Comprendre le mécanisme moléculaire contrôlant la morphologie, la taille et la distribution des organites intracellulaires est l’une des questions les plus importantes de la biologie moderne.

Dans le passé, les variations morphologiques entre et au sein des groupes expérimentaux n’étaient soumises qu’à une analyse qualitative. Ici, nous proposons, dans une analyse quantitative qui combine la génétique de la drosophile avec l’analyse quantitative morphométrique pour identifier les gènes contrôlant la taille, la forme et la distribution des noyaux dans les muscles. Leire Ledahawski, une étudiante diplômée de mon laboratoire, aidera à la démonstration de la procédure.

Après avoir disséqué et coloré les jonctions neuromusculaires larvaires conformément au protocole de texte, utilisez une pince pour retirer les échantillons du tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et déposez-les sur une lame de traitement. À l’aide de ciseaux de micro-dissection, coupez la tête et la queue des filets et maintenez leurs surfaces internes vers le haut. Maintenant, préparez une diapositive de montage en enroulant trois bandes de ruban de cellulose autour d’une diapositive propre, espacée d’un centimètre.

Posez la lamelle sur cet espace prévu afin qu’elle n’aplatisse pas les échantillons. Ensuite, déposez environ 20 microlitres de support de montage entre les bandes de ruban de cellulose et étalez le support avec une pince propre. Retirez maintenant le tissu supplémentaire des préparations.

Faites glisser les larves disséquées de la lame de traitement sur la glissière de montage et dans le support de montage, en maintenant la surface interne vers le haut. Ensuite, appliquez doucement une lamelle en prenant soin d’éviter de retenir l’air. Scellez ensuite la lame avec du vernis à ongles transparent et laissez sécher la lame pendant au moins 10 minutes avant l’imagerie.

Pour cette analyse, utilisez des images confocales montrant des muscles de la paroi corporelle larvaire colorés avec des anticorps DeVAP, des anticorps anti-lamin et un marqueur nucléaire. Ensuite, faites glisser et déposez les images confocales de la pile Z dans l’arène. Double-cliquez sur les images pour les ouvrir automatiquement dans la vue Surpass, accessible par une icône de barre d’outils.

La vue Surpass comporte trois panneaux principaux d’espace de travail. Zone de vue, liste d’objets et zone Propriétés de l’objet. Ensuite, cliquez sur l’icône de la vue 3D pour créer une image à trois canaux rendue en volume.

Sélectionnez ensuite Ajouter de nouveaux points de mesure dans la barre d’outils Objets et suivez l’assistant de création dans la zone Propriétés de l’objet. Sélectionnez d’abord l’onglet Édition, puis, dans Canal spécifique, sélectionnez soit le marqueur nucléaire, soit le canal de lamine pour mettre en évidence les noyaux. Ensuite, réglez le pointeur sur le mode Sélection en appuyant sur l’onglet Échap, puis ajustez la taille de la boîte de curseur 3D avec la molette de la souris pour contenir un noyau donné dans l’image.

Ajoutez un point de mesure en maintenant la touche Maj enfoncée et en faisant un clic gauche sur le même noyau. Ensuite, ajoutez le deuxième point sur un noyau voisin du même muscle en utilisant la même technique. Une ligne sera automatiquement tracée entre les deux points et la distance entre les deux noyaux sera affichée et enregistrée sous forme de variable statistique.

Répétez la procédure pour tous les noyaux entourant un noyau donné. Ensuite, parmi tous les points de mesure collectés, qui se trouvent sous Données de distance détaillées des statistiques, sélectionnez la distance la plus courte. Dans la zone Propriétés de l’objet, sélectionnez l’option Exporter les statistiques avec l’affichage par onglet dans un fichier disponible.

Cela permet d’enregistrer les données dans une feuille de calcul. Pour cette analyse, utilisez des images confocales de muscles de la paroi corporelle colorés au lamin et d’un marqueur nucléaire pour visualiser les noyaux. Pour évaluer la forme des myonoyaux, il faut mesurer leur sphéricité, ce qui compare la surface nucléaire à celle d’une sphère de même volume.

Alternativement, mesurez l’ellipticité qui distingue les prolates, les aplatis ou les ellipsoïdes et les sphéroïdes. Ouvrez l’image comme décrit précédemment. Ensuite, cliquez sur l’icône de la barre d’outils Objets Ajouter de nouvelles surfaces.

Dans l’assistant de création qui s’affiche dans la zone Propriétés de l’objet, sélectionnez le marqueur nucléaire colorant comme canal source pour afficher les noyaux. Définissez l’option Intensité absolue comme seuil. Assurez-vous que la plupart des noyaux présentent un rendu lisse et non surchargé en modifiant la valeur sur la courbe de seuil.

Dans le même temps, évitez la présence de trous ou de masques incomplets de tout noyau. Ensuite, utilisez l’outil Filtre pour supprimer le bruit du rendu de surface. Sous l’onglet Modifier de la couche de surface nouvellement créée, divisez les surfaces des noyaux dont le rendu est incorrect.

Une autre option consiste à fusionner les surfaces des noyaux qui sont mal rendues. Les valeurs d’ellipticité et de sphéricité des noyaux rendus en surface sont disponibles sous l’onglet Statistiques. Exportez ces données à des fins d’analyse.

Pour ce protocole, utilisez des images confocales montrant des muscles de la paroi corporelle colorés avec un marqueur nucléaire et avec des anticorps spécifiques à la lamine et au DeVAP. Ouvrez l’image qui vous intéresse à partir de l’élément du menu principal, puis Recadrer 3D. Suivez l’assistant de création de surface à l’aide du canal de lamine comme décrit dans la section précédente.

Une fois la surface créée, cliquez sur Modifier dans la zone Propriétés des objets, puis sélectionnez Masquer tout pour isoler un signal à l’intérieur du noyau. Ensuite, sélectionnez le signal DeVAP. Dans le menu déroulant Sélectionner un canal, cliquez sur l’option Définir les voxels à l’extérieur de la surface et mettez cette valeur à zéro.

Cela crée un nouveau canal masqué disponible dans la fenêtre Réglage de l’affichage. Pour visualiser la présence d’un signal à l’intérieur du noyau, créez un plan de contour en cliquant sur l’icône Ajouter un nouveau plan de coupe dans la barre d’outils Objets. Ensuite, ajustez de manière interactive l’angle du plan d’écrêtage et sa position pour visualiser la distribution du signal à l’intérieur du noyau.

Des mutations faux-sens dans la protéine B associée au VAMP humain sont impliquées dans la pathogenèse de la SLA. En utilisant la méthode décrite, les muscles striés exprimant le gène orthologue de la mouche DeVAP hébergeant la mutation V2601 causant la SLA ont été comparés à des témoins, exprimant des niveaux comparables de DeVAP de type sauvage ou des niveaux plus élevés de DeVAP de type sauvage. L’analyse du voisin le plus proche a été utilisée pour évaluer la distribution des noyaux le long des fibres musculaires.

Par rapport aux muscles témoins exprimant le transgène DeVAP muté, ou à ceux exprimant surexprimant la protéine de type sauvage, la mutation d’intérêt a provoqué une réduction spectaculaire de la distance moyenne la plus courte entre les noyaux. Ensuite, la sphéricité des noyaux a été examinée. Il a été constaté que les transgènes qui réduisaient l’espacement des noyaux augmentaient également le volume des noyaux.

Les reconstructions 3D et les rendus volumiques des noyaux ont révélé que les muscles exprimant la mutation d’intérêt forment des amas localisés dans les noyaux. Cette méthode peut également être étendue à l’analyse quantitative des caractéristiques morphologiques associées à d’autres organites, tels que les mitochondries. Des changements dans l’architecture, la position et la taille nucléaires ont été associés au vieillissement et à un certain nombre de troubles neurodégénératifs, tels que la maladie de Parkinson et la SLA.

La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la dyspraxie peut conduire à l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques pour des interventions thérapeutiques efficaces.