Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l'aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

L'objectif général de cette méthode multiplexe améliorée est d'augmenter le nombre d'échantillons protéiques pouvant être analysés simultanément tout en réduisant les erreurs d'échantillonnage et le temps d'utilisation de l'appareil. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du vieillissement, des maladies neurodégénératives, d'autres maladies liées à l'âge et du cancer, en lien avec la pathogenèse, la progression, le diagnostic, le pronostic et les cibles thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de générer un aperçu complet des modifications protéiques à travers de nombreuses conditions.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la maladie d'Alzheimer chez le modèle murin, elle peut également être appliquée à des échantillons de tissus provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer ou d'une variété d'autres troubles. En général, les personnes novices dans cette méthode la trouveront difficile, car plusieurs échantillons doivent être manipulés simultanément en peu de temps. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons reconnu que l'acétylation pouvait être combinée à l'étiquetage isobare pour la nitration des protéines, ce qui nous a incités à adapter la technique de manière globale à tous les peptides.

Cette étude analysera les tissus cérébral, cardiaque et hépatique provenant d'un modèle murin de la maladie d'Alzheimer et de témoins de type sauvage. Transférez de 60 à 90 milligrammes de chaque échantillon de tissu dans un tube de lyse, puis ajoutez 500 microlitres de PBS contenant huit molarités d'urée. Homogénéisez les échantillons à l'aide d'un homogénéisateur mécanique.

Retirer l'homogénat tissulaire du tube de lyse et le transférer dans un tube de microcentrifugation. Rincer le tube de lyse avec 100 à 500 microlitres de PBS contenant huit molarités d'urée, puis combiner la solution de rinçage avec l'homogénat tissulaire. Centrifuger l'homogénat tissulaire pendant 15 minutes.

Collectez le surnageant de chaque échantillon. Après avoir effectué le dosage BCA pour déterminer la concentration en protéines, ajoutez 100 microgrammes de protéine provenant de chaque échantillon dans des tubes microcentrifuges étiquetés individuellement. Ajoutez du dithiothréitol à chaque échantillon.

Et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ajouter de l’iodoacétamide (IAM) à chaque échantillon, puis incuber sur glace à l’abri de la lumière pendant deux heures. Ensuite, ajouter de la L-cystéine à chaque échantillon, et incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Au bout de 30 minutes, ajouter du tampon tris avec du chlorure de calcium pour diluer l'urée à une concentration finale de deux molaire. Ajouter de la trypsine traitée au L1 tosilimitotophénylethylcholorure de méthylcétone à chaque échantillon et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le jour suivant, arrêter la digestion des protéines en congelant rapidement l'échantillon dans de l'azote liquide et conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à un traitement ultérieur. Avant le marquage par diméthylation, les échantillons de peptides sont désalinisés, comme décrit dans le protocole textuel, puis séchés par centrifugation sous vide. Pour commencer la procédure de marquage par diméthylation, reconstituer les peptides dans de l'acide acétique à 1 % dissous dans de l'eau de qualité HPLC ou nanopure.

Prélvez une portion de 50 microgrammes de chaque échantillon dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Conservez le reste des peptides reconstitués à moins 80 degrés Celsius pour des expériences ultérieures. Dans les étapes qui seront démontrées ensuite, il est essentiel d'ajouter rapidement les réactifs afin que les réactions chimiques activatrices se produisent pendant la même durée pour tous les échantillons.

Ajouter huit microlitres d'une solution de formaldéhyde à 60 millimolaire aux échantillons destinés à l'étiquetage par diméthylation légère. Ajouter huit microlitres d'une solution de formaldéhyde marquée au carbone 13 et deutériée à 60 millimolaire aux échantillons destinés à l'étiquetage par diméthylation lourde. Ajouter huit microlitres de borohydrure de sodium à 24 millimolaire aux échantillons étiquetés par diméthylation légère.

Ajouter huit microlitres de cyanoboroduhydrure de sodium à 24 millimolaire aux échantillons marqués avec la diméthylation lourde. Vortexer les échantillons, puis les agiter doucement sur un agitateur de tubes pendant environ 10 minutes à température ambiante. Arrêter les réactions en ajoutant 16 microlitres d'ammoniaque à 1 % pendant cinq minutes.

Réacidifier les mélanges réactionnels en ajoutant huit microlitres d'acide formique à 5 %. Combiner les peptides diméthylés légers et lourds afin de générer un total de six échantillons. Effectuer le désalinage des échantillons comme décrit dans le protocole écrit.

Et séchez les échantillons par centrifugation sous vide. Pour commencer le marquage isobare des échantillons diméthylés, commencez par reconstituer 100 microgrammes de peptides diméthylés dans du bicarbonate de triéthylammonium, ou tampon TEAB. Ensuite, préparez les réactifs isobares selon le protocole du fabricant du kit de marquage isobare.

Ajoutez le volume approprié, dans ce cas 41 microlitres du réactif de marquage isobare solubilisé, à chacun des échantillons de peptides, puis vortexez pendant environ 10 secondes. Agitez les échantillons sur un agitateur pour tubes de microcentrifugeuse pendant environ une heure à température ambiante. Pour arrêter les réactions, ajoutez 8 microlitres d'hydroxylamine à chaque échantillon.

Et incuber les échantillons pendant 15 minutes à température ambiante. Rassembler les six échantillons marqués en un mélange unique et désaler. Préparer les peptides pour la chromatographie liquide en les reconstituant dans de l'eau de qualité spectrométrie de masse contenant 0,1 % d'acide formique.

Ajouter les peptides reconstitués dans un tube de microcentrifugation contenant un filtre de 0,65 micromètre. Et centrifuger à 12 000 ×g pendant une minute. Retirer et jeter le filtre.

Transférez les peptides filtrés dans un flacon d'auto-échantillonneur. Injectez six microlitres de chaque échantillon de fraction d'échange cationique forte sur une colonne de piégeage. Remplissez à deux centimètres avec du matériau carbone 18.

Exécutez les méthodes de spectrométrie de masse pour la séparation analytique et l'acquisition des données. Une analyse cPilot en 12-plex de tissus cérébraux, cardiaques et hépatiques provenant d'un modèle murin de la maladie d'Alzheimer et de témoins de type sauvage a été réalisée. Les données des précurseurs ont montré des peptides diméthylés légers et lourds, représentés par les pics à m/z 643,854 et 647,875.

Ces peptides ont été sélectionnés, isolés indépendamment et fragmentés par dissociation induite par collision afin de produire ces spectres. Les résultats de recherche ont indiqué que les pics appartenaient à un peptide de la protéine phosphoglycérate kinase une. Ces pics ont été isolés davantage pour une spectrométrie de masse tandem avec dissociation collisionnelle à haute énergie, et les ions rapporteurs sont observés comme indiqué.

Les deux séries de spectres de spectrométrie de masse en triple étage sont nécessaires pour obtenir des informations sur les 12 échantillons. Dans cet exemple, les rapports ioniques entre la maladie d'Alzheimer et le témoin de type sauvage sont similaires entre les deux réplicats biologiques pour les tissus cérébral, hépatique et cardiaque. Les valeurs de variation d'expression pour chaque comparaison suggèrent que les niveaux de la phosphoglycérate kinase 1 dans le cerveau et le cœur sont plus élevés chez les souris atteintes de la maladie d'Alzheimer, mais plus faibles dans le foie.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire attention à la manipulation des échantillons. Des méthodes de séparation telles que l'échange cationique fort ou la fractionnement à pH élevé peuvent être intégrées à cette procédure afin d'augmenter la profondeur et la couverture journalières.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'augmenter le multiplexage des échantillons à l'aide de C-Pilot.