Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l'aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

L’objectif global de cette méthode de multiplexage améliorée est d’augmenter le nombre d’échantillons de protéines pouvant être analysés simultanément tout en réduisant les erreurs d’échantillonnage et le temps passé par l’instrument. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du vieillissement, des maladies neurodégénératives, d’autres maladies liées à l’âge et du cancer qui sont liées à la pathogenèse, à la progression, au diagnostic, au pronostic et aux cibles thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible de générer un instantané complet des changements protéiques dans de nombreuses conditions.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin, elle peut également être appliquée à des échantillons de tissus de patients atteints d’Alzheimer ou d’une gamme d’autres troubles. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode la trouveront difficile car il y a plusieurs échantillons à manipuler simultanément dans un court laps de temps. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons reconnu que l’acétylation pouvait être combinée avec le marquage isobire pour la nitration des protéines, ce qui nous a motivés à faire fonctionner la technique à l’échelle mondiale pour tous les peptides.

Cette étude analysera les tissus du cerveau, du cœur et du foie à partir d’un modèle murin de la maladie d’Alzheimer et de témoins de type sauvage. Transférez 60 à 90 milligrammes de chaque échantillon de tissu dans un tube de lyse et ajoutez 500 microlitres de PBS avec huit molaires d’urée. Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur mécanique.

Retirez l’homogénat de tissu du tube de lyse et transférez-le dans un tube de microcentrifugation. Rincez le tube de lyse avec 100 à 500 microlitres de PBS avec huit molaires d’urée et combinez la solution de rinçage avec l’homogénat de tissu. Centrifuger l’homogénat de tissu pendant 15 minutes.

Saisissez le surnageant de chaque échantillon. Après avoir effectué le test BCA pour déterminer la concentration en protéines, ajoutez 100 microgrammes de protéines de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugation étiquetés individuellement. Ajouter du dithiothréitol à chaque échantillon.

Et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez de l’iodoacétamide (IAM) à chaque échantillon et laissez incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant deux heures. Ensuite, ajoutez de la L-cystéine à chaque échantillon et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, ajoutez du tampon tris avec du chlorure de calcium pour diluer l’urée à une concentration finale de deux molaires. Ajouter la trypsine traitée à la méthylcétone L1 tosilimitotophénophénylcholer à chaque échantillon. Et incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, arrêtez la digestion des protéines en congelant rapidement l’échantillon dans de l’azote liquide et stockez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit traité ultérieurement. Avant le marquage par diméthylation, les échantillons de peptides sont dessalés, comme décrit dans le protocole textuel, et séchés par centrifugation sous vide. Pour commencer la procédure de marquage par diméthylation, reconstituez les peptides dans de l’acide acétique à 1 % dissous dans de l’eau HPLC ou nanopure.

Prélever une portion de 50 microgrammes de chaque échantillon dans un nouveau tube à microcentrifuger de 1,5 millilitre. Stockez le reste des peptides reconstitués à moins 80 degrés Celsius pour les expériences futures. Dans les étapes qui seront démontrées ci-dessous, il est essentiel d’ajouter rapidement des réactifs afin que les réactions chimiques habilitantes aient lieu pendant la même durée pour tous les échantillons.

Ajouter huit microlitres d’une solution de formaldéhyde de 60 millimolaires aux échantillons pour le marquage par diméthylation légère. Ajoutez huit microlitres d’une solution de formaldéhyde marquée au carbone 13 deutérium de 60 millimolaires aux échantillons pour le marquage avec une forte diméthylation. Ajoutez huit microlitres de cyanoborohydrure de sodium de 24 millimolaires aux échantillons étiquetés avec une diméthylation légère.

Ajouter huit mircoliters de cyanoboroduderide de sodium de 24 millimolaires aux échantillons marqués avec une forte diméthylation. Vortex les échantillons, puis agitez-les doucement sur un agitateur à tube pendant environ 10 minutes à température ambiante. Éteignez les réactions en ajoutant 16 microlitres d’ammoniac à 1 % pendant cinq minutes.

Réacidifiez les mélanges réactionnels en ajoutant huit microlitres d’acide formique à 5 %. Combinez les peptides diméthylés légers et lourds pour générer un total de six échantillons. Effectuez le dessalage de l’échantillon comme décrit dans le protocole texte.

Et sécher les échantillons par centrifugation sous vide. Pour être un marquage isobare des échantillons diméthylés, reconstituez d’abord 100 microgrammes de peptides diméthylés et de bicarbonate de triéthylammonium, ou tampon TEAB. Ensuite, préparez les réactifs isobares selon le protocole du fabricant du kit de marquage isobare.

Ajoutez le volume approprié, dans ce cas, 41 microlitres du réactif de marquage isobare solubilisé à chacun des échantillons peptidiques, et agitez pendant environ 10 secondes. Agitez les échantillons sur un agitateur à tube de microcentrifugation pendant environ une heure à température ambiante. Pour éteindre les réactions, ajoutez 8 microlitres d’hydroxylamine à chaque échantillon.

Et incubez les échantillons pendant 15 minutes à température ambiante. Regroupez les six échantillons étiquetés en un seul mélange et dessalez. Préparez les peptides pour la chromatogrophie liquide en reconstituant les peptides dans de l’eau de qualité spectrométrie de masse avec de l’acide formique à 0,1 %.

Ajoutez des peptides reconstitués dans un tube de microcentrifugation contenant un filtre de 0,65 micromètre. Et centrifuger à 12 000 fois g pendant une minute. Retirez et jetez le filtre.

Transférez les peptides filtrés dans un flacon d’échantillonneur automatique. Injectez six microlitres de chaque échantillon de faction échangeuse de cations forts sur une colonne de piège. Emballage à deux centimètres avec un matériau en carbone 18.

Exécutez les méthodes de séparation analytique et de spectromètre de masse d’acquisition de données. Une analyse pilote 12-plex des tissus du cerveau, du cœur et du foie à partir d’un modèle murin de la maladie d’Alzheimer et de témoins de type sauvage a été effectuée. Les données précurseurs ont montré des peptides diméthylés légers et lourds représentés par les pics à m/z 643,854 et 647,875.

Ces peptides ont été sélectionnés, isolés indépendamment et fragmentés par dissociation induite par la collusion pour générer ces spectres. Les résultats de la recherche ont indiqué que les pics appartenaient à un peptide de la protéine phosphoglycérate kinase un. Ces pics ont été isolés davantage pour la spectrométrie de masse en tandem de dissociation collusionnelle de plus haute énergie et les ions rapporteurs sont observés comme indiqué.

Les deux ensembles de spectres de spectrométrie de masse à trois étages sont nécessaires pour obtenir des informations sur les 12 échantillons. Dans cet exemple, les rapports d’ions de contrôle de la maladie d’Alzheimer par rapport à ceux de type sauvage sont similaires dans les deux réplicats biologiques pour les tissus cérébraux, hépatiques et cardiaques. Les valeurs de changement de pli pour chaque comparaison suggèrent que les niveaux de phosphophoglyérate kinase un dans le cerveau et le cœur sont plus élevés chez les souris atteintes de la maladie d’Alzheimer, mais plus faibles dans le foie.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de faire attention à la manipulation des échantillons. Incorporées dans cette procédure, des méthodes de séparation telles qu’un fort échange de cations ou un fractionnement à pH élevé peuvent être effectuées afin d’augmenter la profondeur et la couverture par journal.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’améliorer le multiplexage d’échantillons à l’aide de C-Pilot.