Quantification de l'expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

L'objectif général de cette méthode est de quantifier de manière objective l'expression protéique et la co-localisation à l'aide de l'imagerie multispectrale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la recherche fondamentale et de la pathologie diagnostique, telles que l'évolution de l'expression et de la localisation des protéines après un traitement ou au cours de la progression d'une maladie. Le principal avantage de cette technique réside dans l'élimination de la subjectivité de l'opérateur inhérente aux méthodes de quantification traditionnelles.

Pour commencer le processus de quantification, ouvrez le logiciel d'imagerie multispectrale afin de créer une bibliothèque spectrale à partir de lames témoins préparées précédemment, colorées avec des chromogènes individuels et une lame colorée à l'hématoxyline. Ensuite, ouvrez un cube d'image obtenu à partir d'une lame témoin et sélectionnez quatre à cinq zones positivement colorées pour définir optiquement le chromogène. Répétez ces étapes avec les cubes d'image provenant d'autres lames témoins jusqu'à ce qu'une bibliothèque spectrale complète représentant tous les chromogènes soit créée, puis enregistrez la bibliothèque spectrale.

Démarrez un nouveau projet dans le logiciel d'imagerie multispectrale en sélectionnant Multispectral ou im3 comme option de format d'image, et Brightfield comme format d'échantillon. Configurez le projet en choisissant les options segmenter le tissu, détecter les caractéristiques, phénotyper, attribuer un score et exporter. Modifiez la résolution de l'image pour accélérer le temps d'analyse, si souhaité.

Importez la bibliothèque spectrale créée précédemment et sélectionnez tous les chromogènes à inclure dans l'analyse. Ouvrez les cubes d'image devant faire partie du jeu de données d'apprentissage en choisissant l'option Ouvrir le cube d'image. Sélectionnez au moins 18 % du nombre total d'images à analyser afin de garantir la précision de l'apprentissage.

Ensuite, choisissez le jeu d'images d'apprentissage. Des images représentant tous les états pathologiques afin d'améliorer la précision de la segmentation. Incluez un grand nombre d'images avec une coloration négative dans le jeu d'apprentissage pour éviter tout biais durant cette étape.

Équilibrez la balance des blancs des images dans l'ensemble d'apprentissage en sélectionnant l'outil pipette et en choisissant une zone blanche sur une image. Sélectionnez le bouton de progression pour passer à la segmentation des tissus. Ensuite, utilisez le panneau des catégories de tissus pour choisir les types de tissus à analyser ; des catégories de tissus spécifiques peuvent être utilisées afin d'obtenir une localisation protéique plus précise dans les tissus.

Commencez par créer l'algorithme et définir les catégories de tissus à l'aide de l'outil de dessin, en traçant autour des groupes de cellules présents dans les images d'apprentissage. Une fois qu'une catégorie de tissu est terminée, répétez l'étape pour les autres catégories de tissus. Veillez à choisir des groupes de cellules dans les images qui sont caractéristiques du type de catégorie de tissu.

Sélectionnez les composants à inclure dans l'entraînement du segmenteur de tissu. Choisissez une échelle de motif appropriée pour entraîner le segmenteur de tissu. Ensuite, sélectionnez le bouton du segmenteur de tissu entraîné.

Observez une fenêtre contextuelle affichant la précision de la proportion de pixels situés dans les régions d'apprentissage correctement classifiées. Segmentez l'ensemble complet d'images d'apprentissage en cliquant sur « segmenter les images ». Une fois terminé, examinez l'ensemble d'apprentissage afin d'identifier tout tissu mal classifié selon l'algorithme d'apprentissage actuel.

Lorsque vous êtes satisfait des résultats de l'algorithme de segmentation tissulaire, sélectionnez le bouton de progression. Assurez-vous que les noyaux sont déjà sélectionnés pour choisir le cytoplasme et/ou la membrane. Sélectionnez l'onglet noyaux et choisissez les paramètres appropriés pour la segmentation nucléaire.

Ensuite, choisissez si les catégories de tissus individuelles ou toutes les catégories seront incluses dans la segmentation. Sélectionnez l'approche par seuil basée sur les objets de contre-coloration pour une méthode simplifiée permettant d'obtenir de bons résultats. Ensuite, sélectionnez l'approche par seuil basée sur les objets à partir d'une contre-coloration nucléaire fiable.

Sélectionnez les paramètres de forme du cytoplasme en choisissant l'onglet cytoplasme. Ensuite, sélectionnez la distance externe par rapport au noyau. Puis sélectionnez la taille minimale.

Sélectionnez le composant d'option suivant avec primaire, secondaire et tertiaire à sélectionner comme options secondaires. Passez à l'onglet membrane. Choisissez premier pour le marqueur spécifique de membrane utilisé.

Régler la densité optique à échelle complète ou OD pour déterminer un seuil minimal ou un résultat positif pour chaque marqueur sur les membranes cellulaires. Poursuivre sous l'onglet membrane et sélectionner la taille maximale des cellules. Après avoir sélectionné toutes les options, choisir « segmenter tout ».

Appliquez les paramètres aux images et observez-les. Choisissez « avancer » pour passer à l'étape de score IHC et sélectionnez une catégorie de tissu à évaluer. Choisissez un type de score souhaité et sélectionnez le compartiment cellulaire à utiliser dans l'analyse de score.

Ensuite, sélectionnez les données du composant de visualisation et déplacez le curseur sur les images d'apprentissage pour déterminer le seuil minimal de densité optique de la coloration permettant d'identifier les cellules positives pour les composants d'intérêt. Exportez les données du jeu d'apprentissage afin de tester l'algorithme créé par la segmentation du tissu, la segmentation cellulaire et les valeurs de score ; suivez les invites pour créer un nouveau dossier destiné au répertoire d'exportation. Sélectionnez les images et tableaux à produire et à inclure dans l'analyse.

Ensuite, effectuez l'analyse en sélectionnant l'exportation pour tous. Une fois l'analyse terminée, examinez les données de segmentation cellulaire et de scoring pour les images présentant à la fois une coloration forte et faible afin d'évaluer la précision des paramètres. Une fois les paramètres jugés satisfaisants, cliquez sur l'onglet d'analyse par lot pour copier l'algorithme dans le projet actif.

Ensuite, choisissez un nouveau répertoire d'exportation et sélectionnez les images et les tableaux à inclure dans l'analyse. Sous l'option des fichiers d'entrée, sélectionnez toutes les images à inclure dans l'analyse par lots. Sélectionnez l'option exécuter pour effectuer l'analyse.

Lorsque l'opération est terminée, passez à l'onglet de fusion de relecture. Sélectionnez « inclure tout » puis choisissez « fusionner » pour créer des fiches de données contenant les données récapitulatives destinées à l'analyse. L'entraînement a été effectué sur des tissus prostatiques afin de segmenter les images en portions épithéliales et stromales.

Avec un compartiment non tissulaire. Un ensemble d'images d'apprentissage a été importé dans un logiciel d'imagerie multispectrale représentant les types de tissus et les états pathologiques de l'ensemble complet d'images. Des catégories de tissus ont été créées, incluant le stroma, les épithéliums et le non-tissu, et ces catégories ont été définies en dessinant manuellement par-dessus les images d'apprentissage.

Un algorithme de segmentation des tissus a été créé et appliqué à l'ensemble d'apprentissage d'images. Segmentation précise des tissus. À l'aide de la technique d'immunohistochimie multiplexe, les cellules positives pour l'expression nucléaire de ER-alpha, visibles en rouge, et de AR, visibles en marron, ont été identifiées malgré les signaux colorimétriques et métriques superposés. L'expression spécifique de la membrane cellulaire de CD-147 a été quantifiée en utilisant E-cadhérine, visible en noir, comme protéine marqueur.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la quantification de l'expression protéique et de la co-localisation, ainsi que des méthodes pour traiter et fixer les tissus inclus en paraffine.