Quantification de l'expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

L’objectif global de cette méthode est de quantifier objectivement l’expression et la co-localisation des protéines à l’aide de l’imagerie multispectrale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche fondamentale et de la pathologie diagnostique, telles que la façon dont les protéines modifient l’expression et la localisation après le traitement, ou dans la progression de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle supprime la subjectivité de l’opérateur inhérente aux méthodes de quantification traditionnelles.

Pour commencer le processus de quantification, ouvrez le logiciel d’imagerie multispectrale pour créer une bibliothèque spectrale à partir de lames de contrôle préalablement préparées et colorées avec des chromogènes individuels et la lame colorée à l’hématoxyline. Ensuite, ouvrez un cube d’image acquis à partir d’une diapositive de contrôle et sélectionnez quatre à cinq zones colorées positivement pour définir optiquement le chromogène. Répétez les étapes avec des cubes d’image à partir d’autres diapositives de contrôle jusqu’à ce qu’une bibliothèque spectrale complète représentant tous les chromogènes soit créée, puis enregistrez la bibliothèque spectrale.

Commencez un nouveau projet dans le logiciel d’imagerie multispectrale en sélectionnant Multispectral ou im3 pour l’option de format d’image et Brightfield pour le format d’échantillon. Configurez le projet en choisissant le segment de tissu, recherchez les caractéristiques, le phénotypage, notez et exportez. Modifiez la résolution de l’image pour accélérer le temps d’analyse, si vous le souhaitez.

Importez la bibliothèque spectrale précédemment créée et sélectionnez tous les chromogènes à inclure dans l’analyse. Ouvrez les cubes d’image à inclure dans l’ensemble de données d’entraînement en sélectionnant l’option Ouvrir le cube d’image. Sélectionnez au moins 18 % du nombre total d’images à analyser pour garantir la précision de l’entraînement.

Ensuite, choisissez l’ensemble d’images d’entraînement. Des images qui représentent tous les états de la maladie, afin d’augmenter la précision de la segmentation. Incluez de nombreuses images de coloration négative dans le kit d’apprentissage pour éviter les biais lors de cette étape.

Équilibrez les blancs des images du jeu d’apprentissage en sélectionnant l’outil Pipette et en choisissant une zone blanche dans une image. Sélectionnez le bouton d’avance pour déplacer la segmentation des tissus. Ensuite, utilisez le panneau des catégories de tissus pour choisir les types de tissus à analyser pour une localisation plus précise des tissus protéiques.

Commencez à créer l’algorithme et à définir les catégories de tissus à l’aide de l’outil stylo et en dessinant autour de groupes de cellules dans des images d’entraînement. Lorsque vous avez terminé avec une catégorie de tissus, répétez l’étape pour les autres catégories de tissus. Assurez-vous de choisir des groupes de cellules dans les images qui sont caractéristiques du type de catégorie de tissu.

Sélectionnez les composants à inclure dans la formation du segmenteur de tissus. Choisissez une échelle de motif appropriée pour entraîner le segmenteur de tissus. Sélectionnez ensuite le bouton du segmenteur de tissus entraîné.

Observez une fenêtre contextuelle affichant la précision de la proportion de pixels dans les régions d’entraînement correctement classées. Segmentez l’ensemble d’images d’entraînement en cliquant sur Segmenter les images. Lorsque vous avez terminé, passez en revue l’ensemble d’entraînement pour trouver tout tissu mal classé avec un algorithme d’entraînement actuel.

Lorsque vous êtes sûr des résultats de l’algorithme de segmentation tissulaire, sélectionnez le bouton d’avance. Assurez-vous que les noyaux sont déjà sélectionnés pour choisir le cytoplasme et/ou la membrane. Sélectionnez l’onglet noyaux et choisissez les paramètres appropriés pour la segmentation nucléaire.

Choisissez ensuite si une seule catégorie de tissus ou toutes les catégories de tissus seront incluses dans la segmentation. Sélectionnez l’approche de seuil basée sur l’objet de contrecoloration pour une méthode simplifiée afin d’obtenir de bons résultats. Ensuite, sélectionnez l’approche de seuil basée sur l’objet sur une contre-coloration nucléaire fiable.

Sélectionnez les paramètres en forme de cytoplasme en choisissant l’onglet cytoplasme. Ensuite, sélectionnez la distance extérieure au noyau. Sélectionnez ensuite la taille minimale.

Sélectionnez le composant d’option suivant avec primaire, secondaire et sélectionnez tertiaire comme options secondaires. Passez à l’onglet de la membrane. Choisissez d’abord le marqueur spécifique à la membrane utilisé.

Ajustez la densité optique ou OD à pleine échelle pour trouver un seuil minimum ou un positif pour chaque marqueur sur les membranes cellulaires. En continuant, sous l’onglet de la membrane, sélectionnez la taille maximale des cellules. Après avoir sélectionné toutes les options, sélectionnez Segmenter tout.

Appliquez les paramètres aux images et observez-les. Choisissez Avance pour passer à l’étape de score IHC et choisissez une catégorie de tissu à noter. Choisissez le type de score souhaité et choisissez le compartiment de cellule à utiliser dans l’analyse de score.

Ensuite, sélectionnez Afficher les données des composants et déplacez le curseur sur les images d’entraînement pour trouver le seuil minimal de coloration de densité optique approprié pour les cellules positives pour les composants d’intérêt. Exportez les données de l’ensemble d’entraînement pour tester l’algorithme créé par la segmentation tissulaire, la segmentation cellulaire et les valeurs de score, suivez les invites pour créer un nouveau dossier pour le répertoire d’exportation. Sélectionnez les images et les tableaux à créer et à inclure dans l’analyse.

Ensuite, effectuez l’analyse en sélectionnant Exporter pour tous. Une fois l’analyse terminée, affichez les données de segmentation et de score des cellules pour les images avec une coloration élevée et faible afin d’évaluer la précision des paramètres. Une fois satisfait des paramètres, cliquez sur l’onglet d’analyse par lots pour copier l’algorithme dans le projet actif.

Choisissez ensuite un nouveau répertoire d’exportation et sélectionnez les images et les tables à inclure dans l’analyse. Sous l’option Fichiers d’entrée, choisissez toutes les images à inclure dans l’analyse par lots. Sélectionnez l’option d’exécution pour effectuer l’analyse.

Une fois l’opération terminée, passez à l’onglet Vérifier la fusion. Sélectionnez Inclure tout, puis Fusionner pour créer des feuilles de données avec des données récapitulatives à des fins d’analyse. Un entraînement a été effectué sur des tissus prostatiques pour segmenter les images en parties épithéliales et stromales.

Avec un compartiment non tissulaire. Un ensemble d’images d’entraînement a été importé dans un logiciel d’imagerie multispectrale représentant les types de tissus et les états pathologiques de l’ensemble de l’ensemble des images. Des catégories de tissus ont été créées, y compris le stroma, l’épithélium et les non-tissus, et les catégories ont été définies en dessinant manuellement sur des images d’entraînement.

Un algorithme de segmentation tissulaire a été créé et appliqué à l’ensemble d’images d’entraînement. Segmenter avec précision les tissus. En utilisant la technique d’immunohistochimie multiplexe, les cellules positives pour l’expression nucléaire de ER-alpha observées en rouge et AR vues en brun ont été identifiées malgré le chevauchement des signaux colorimétriques et métriques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier l’expression et la co-localisation des protéines, d’informer et de réparer les tissus inclus dans la paraffine.