Name: Profilage Redox cellulaire utilisant une microscopie haute teneur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez le profilage redox cellulaire par microscopie haute teneur pour quantifier simultanément les niveaux de ROS et la morphofonction mitochondriale dans les fibroblastes dermiques humains. Cette méthode permet d'établir des empreintes redox robustes.

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Cette recherche a été soutenue par l’Université d’Anvers (TTBOF/29267, TTBOF/30112), le Fonds spécial de recherche de l’Université de Gand (projet BOF/11267/09), NB-Photonics (code de projet 01-MR0110) et l’initiative CSBR (Centers for Systems Biology Research) de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO ; N° : CSBR09/013V). Certaines parties de ce manuscrit ont été adaptées d’une autre publication1, avec la permission de Springer. Les auteurs remercient Geert Meesen pour son aide avec le microscope à grand champ.

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</ol>

Les auteurs affirment qu&#39;il n&#39;y a pas d&#39;intérêts financiers concurrents ou d&#39;autres conflits d&#39;intérêts. L&#39;auteur correspondant veille également à ce que tous les auteurs aient été invités à divulguer tous les conflits d&#39;intérêts.

Cet article décrit une méthode de microscopie à contenu élevé pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires et de la morphofonction mitochondriale dans le NHDF. Sa performance a été démontrée avec une étude de cas sur le NHDF traité par SQV. Les résultats confirment des preuves antérieures de la littérature dans lesquelles des niveaux accrus de ROS ou un dysfonctionnement mitochondrial ont été observés après le traitement avec des inhibiteurs de la protéase du VIH de type 1, bien que dans des exp...

<html> La concentration de ROS intracellulaire est méticuleusement régulée par un jeu dynamique entre les systèmes ROS produisant et ROS désactivant. Le déséquilibre entre les deux provoque un état de stress oxydatif. Parmi les principales sources de ROS sont les mitochondries 1 . Compte tenu de leur rôle dans la respiration cellulaire, ils sont responsables de la majeure partie des molécules intracellulaires de superoxyde (O 2 • - ) 2 . Cela résulte principalement de la fuite d&#39;électrons vers O 2 au complexe 1 de la chaîne de transport d&#39;électrons dans des conditions de potentiel de membrane mitochondrial interne négatif fort (Δψ m ), c&#39;est-à-dire l&#39; hyperpolarisation mitochondriale. D&#39;autre part, la dépolarisation mitochondriale a également été corrélée avec une augmentation de la production de ROS indiquant de multiples modes d&#39;action 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . En outre, grâce à des modifications rédox dans les protéines de la machine de fusion de fission, les ROS co-régulent la morphologie mitochondriale 9. Par exemple, la fragmentation est corrélée avec l&#39;augmentation de la production de ROS et l&#39;apoptose 10 , 11 , alors que les mitochondries filamenteuses ont été liées à la famine et la protection des nutriments contre Mitophagie 12 . Compte tenu de la relation complexe entre les ROS cellulaires et la morphofonction mitochondriale, les deux devraient idéalement être quantifiés simultanément dans les cellules vivantes. Pour ce faire, un test d&#39;imagerie à contenu élevé a été développé sur la base d&#39;une microscopie à large champ automatisée et d&#39;une analyse d&#39;image de cultures de cellules adhérentes colorées avec les sondes fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) et TMRM (mitochondrial Δψ m et morphologie). L&#39;imagerie à contenu élevé se réfère à l&#39;extraction de spDes informations sur les phénotypes cellulaires à l&#39;aide de multiples marqueurs complémentaires et des analyses d&#39;images automatisées (notamment un grand nombre d&#39;éléments descriptifs). Lorsqu&#39;ils sont combinés avec un microscope automatisé, de nombreux échantillons peuvent être criblés en parallèle ( c.- à-d. Débit élevé), ce qui augmente la puissance statistique du dosage. En effet, un atout principal du protocole est qu&#39;il permet une quantification simultanée de plusieurs paramètres dans la même cellule, et ceci pour un grand nombre de cellules et de conditions. Le protocole est divisé en 8 parties (décrites en détail dans le protocole ci-dessous): 1) ensemencement de cellules dans une plaque à 96 puits; 2) Préparation de solutions stock, solutions de travail et tampon d&#39;imagerie; 3) Mise en place du microscope; 4) Chargement des cellules avec CM-H 2 DCFDA et TMRM; 5) Première image en direct pour mesurer les niveaux de ROS basaux et la morphofonction mitochondriale; 6) Deuxième cycle d&#39;imagerie en direct après addition de tert -butylePeroxyde (TBHP) pour mesurer les niveaux de ROS induits; 7) Analyse d&#39;image automatisée; 8) Analyse des données, contrôle de la qualité et visualisation. Le test a été développé à l&#39;origine pour les fibroblastes cutanés humains normaux (NHDF). Étant donné que ces cellules sont grandes et plates, elles sont bien adaptées pour évaluer la morphologie mitochondriale dans les images 2D widefield 13 , 14 . Cependant, avec des modifications mineures, cette méthode s&#39;applique à d&#39;autres types de cellules adhérentes. De plus, à côté de la combinaison de CM-H 2 DCFDA et TMRM, le flux de travail est conforme à une variété de paires de colorants fluorescents avec différentes spécificités moléculaires 1 , 15 .

<table><tbody><tr><td><Réactifs fort>s</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthylrhodamine, ester méthylique, perchlorate (TMRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (indicateur général de stress oxydatif)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde</td><td>Sigma)Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96 puits à fond en verre MicroWell Plate 630 & micro ; L-Black 0,17 mm Low Glass Lidded</td><td>Brooks life science systems</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS w/o Phenol Red 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose with L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca et Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-Versène (EDTA) Solution</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>Anticorps utilisé pour l’acquisition d’une image à champ plat</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>Anticorps utilisé pour l’acquisition d’une image à champ plat</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td>Microscope <td></td><td></td><td>à grand champ Nikon Ti eclipse</td></tr><tr><td>Nikon Perfect Focus System (PFS)</td>Basé sur le matériel <td>Nikon</td><td></td><td> système autofocus</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X objectif</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 avec module JOBS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Ce logiciel est utilisé pour diriger le microscope et programmer/effectuer l’acquisition automatique d’images prototocol</td></tr><tr><td>ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Version 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R version 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilage redox cellulaire utilisant une microscopie haute teneur

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Les espèces réactives d&#39;oxygène (ROS) régulent les processus cellulaires essentiels, y compris l&#39;expression des gènes, la migration, la différenciation et la prolifération. Cependant, les niveaux excessifs de ROS induisent un état de stress oxydatif, qui s&#39;accompagne de dommages oxydatifs irréversibles à l&#39;ADN, aux lipides et aux protéines. Ainsi, la quantification de ROS fournit une procuration directe pour l&#39;état de santé cellulaire. Étant donné que les mitochondries sont parmi les principales sources et cibles cellulaires des ROS, l&#39;analyse conjointe de la fonction mitochondriale et de la production de ROS dans les mêmes cellules est cruciale pour mieux comprendre l&#39;interconnexion dans les pathologies physiopathologiques. Par conséquent, une stratégie basée sur la microscopie à haut contenu a été développée pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, du potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨ m ) et de la morphologie mitochondriale. Il est basé sur la microscopie de fluorescence automatisée à large champ et l&#39;analyse d&#39;image de cellules adhérentes vivantes, cultivées dans des plaques multi-puits, et StaineD avec les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules CM-H 2 DCFDA (ROS) et TMRM (ΔΨ m et la morphologie mitochondriale). Contrairement à la fluorimétrie ou à la cytométrie en flux, cette stratégie permet de quantifier les paramètres subcellulaires au niveau de la cellule individuelle avec une résolution spatiotemporelle élevée, avant et après la stimulation expérimentale. Fait important, la nature basée sur l&#39;image de la méthode permet d&#39;extraire des paramètres morphologiques en plus des intensités de signal. Le jeu de caractéristiques combinées est utilisé pour l&#39;analyse de données multivariées exploratoire et statistique pour détecter les différences entre les sous-populations, les types de cellules et / ou les traitements. Ici, une description détaillée de l&#39;analyse est fournie, ainsi qu&#39;un exemple d&#39;expérience qui prouve son potentiel de discrimination sans équivoque entre les états cellulaires après une perturbation chimique.

L&#39;analyse a été comparée en utilisant plusieurs expériences de contrôle, dont les résultats sont décrits dans Sieprath et al. 1 . En bref, la réponse de fluorescence de CM-H 2 DCFDA et TMRM à des changements induits extraterrestre dans ROS intracellulaire et Δψ m, ont été quantifiés pour déterminer la gamme dynamique. Pour CM-H 2 DCFDA, le NHDF a montré une augmentation linéaire du signal de fluorescence lorsqu&#39;il ...

Cet article présente un flux de travail de microscopie à contenu élevé pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, ainsi que le potentiel de la membrane mitochondriale et la morphologie - communément appelée morphofonction mitochondriale - dans les cellules adhérentes vivantes en utilisant les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules 5- (et- 6) -chlorométhyl-2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluorescéine diacétate, ester acétylique (CM-H2RFDA) et tétraméthylrhodamine méthylester (TMRM).

Profilage Redox cellulaire utilisant une microscopie haute teneur

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

L'objectif général de cette méthode basée sur la microscopie à contenu élevé est de quantifier simultanément la morphofonction mitochondriale et les niveaux cellulaires d'espèces réactives de l'oxygène afin d'établir une empreinte redox robuste pour des lignées cellulaires exposées à différentes perturbations expérimentales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie redox, telles que savoir si des conditions pathogènes ou des traitements par des composés induisent un stress oxydatif, et dans quelle mesure la forme et la fonction mitochondriales sont affectées. Le principal avantage de cette technique est que tous les paramètres peuvent être mesurés au sein de la même cellule et en même temps.Pour commencer la procédure, ensemencer huit à 10 000 fibroblastes dermiques humains dans 60 puits intérieurs d'une plaque 96 puits noire ayant un fond en polystyrène ou en verre mince et continu. Lorsque différentes conditions, traitements ou lignées cellulaires sont utilisés, répartir leurs emplacements d'ensemencement de manière homogène sur la plaque afin de minimiser les effets de position. Ensuite, ensemencer huit à 10 000 cellules supplémentaires dans le puit B

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Réactif niveau de l'espèce d'oxygène est élevé lorsque les cellules rencontrent des conditions de stress. Ici, nous montrons l'exemple de la coloration diaminobenzidine 3'-3 'ainsi que l'étiquetage cysTMT et spectrométrie de masse pour établir le profil du protéome redox...

Profilage thiol redox du protéome par spectrométrie de masse isotopique de l&#39;étiquetage

Source : Katsalifis, A., et al. Imagerie en direct de l’état redox du glutathion mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo montre l’imagerie de l’état redox mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur fluorescent ratiométrique. En appliquant deux longueurs d’onde d’excitation au microscope à fluorescence, le rapport d’intensité de fluorescence est mesuré pour évaluer l’oxydation mitochondriale. Le...

Imagerie de l’état redox mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique

Ce manuscrit décrit l’utilisation de reporters fluorogène génétiquement encodé dans une application de l’imagerie de cellules vivantes pour l’examen du stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Cette approche expérimentale offre inégalée de résolution spatio-temporelle, sensibilité et spécificité tout en évitant beaucoup des défauts des méthodes conventionnelles utilisées pour la détection du stress oxydatif toxicologique.

Imagerie des approches pour les évaluations toxicologiques stress oxydatif, à l’aide de capteurs codés génétiquement fluorogène

Ici, nous présentons un protocole pour détecter l’espèce totale d’oxygène réactif cellulaire (ROS) à l’aide de 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). Cette méthode permet de visualiser la localisation cellulaire de ROS dans les cellules adhérentes avec un microscope à fluorescence et de quantifier l’intensité de ROS avec un lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable.

Détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacétate Staining

Ce protocole décrit l’évaluation de l’état redox subcellulaire spécifique au compartiment dans la cellule. Une sonde fluorescente sensible au redox permet une analyse ratiométrique pratique dans les cellules intactes.

Évaluation de l’oxydation cellulaire à l’aide d’une protéine fluorescente verte rougeox-sensible spécifique à compartiment subcellulaire

Nous décrivons des protocoles pour mesurer le pH, les événements oxydatifs et la digestion des protéines dans les macropinosomes individuels dans les cellules vivantes. L’accent est mis sur la microscopie ratiométrique à double fluorophore et les avantages qu’elle offre par rapport aux techniques basées sur la population.

Mesure du pH, de la chimie redox et de la capacité dégradative des macropinosomes à l’aide de la microscopie ratiométrique à double fluorophore

Cet article décrit un protocole pour déterminer les différences dans l’état redox basal et les réponses redox aux perturbations aiguës dans les neurones primaires de l’hippocampe et cortical en utilisant la microscopie vivante confocale. Le protocole peut être appliqué à d’autres types de cellules et de microscopes avec un minimum de modifications.

Imagerie en direct de l’état redox du glutathion mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique

Ce protocole décrit l’imagerie par fluorescence et l’analyse des coenzymes métaboliques endogènes, du dinucléotide réduit en nicotinamide adénine (phosphate) (NAD(P)H) et du dinucléotide de flavine adénine oxydé (FAD). L’imagerie par autofluorescence du NAD(P)H et du FAD fournit une méthode non destructive sans étiquette pour évaluer le métabolisme cellulaire.

Imagerie par autofluorescence pour évaluer le métabolisme cellulaire

Nous proposons ici un protocole systématisé, accessible et reproductible pour détecter les espèces réactives cellulaires de l’oxygène (ROS) à l’aide d’une sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) dans les cellules gliales de Müller (MGC). Cette méthode quantifie les niveaux de ROS cellulaires totaux à l’aide d’un cytomètre en flux. Ce protocole est très facile à utiliser, adapté et reproductible.

Quantification des espèces réactives de l’oxygène à l’aide de la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine 2′,7′-dichlorofluorescéine et de la cytométrie en flux dans les cellules gliales de Müller

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires en utilisant le dihydroéthidium (DHE) comme sonde de colorant de fluorescence en utilisant une approche de criblage à haut débit. Le protocole décrit les méthodes d’évaluation quantitative des espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires dans les trois lignées cellulaires différentes de carcinome hépatocellulaire.

Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)

À l’aide d’une plate-forme multimodale combinant des modalités d’imagerie optique sans marquage, nous avons développé un protocole pour visualiser et quantifier la dynamique cellulaire et le métabolisme. Grâce à l’imagerie par fluorescence multiphotonique, à la génération de secondes harmoniques et à la microscopie à diffusion Raman stimulée, nous pouvons générer une vue d’ensemble holistique de l’environnement cellulaire et moléculaire.

Plate-forme d’imagerie optique multimodale pour l’étude du métabolisme cellulaire

Découvrez le profilage redox cellulaire par microscopie haute teneur pour quantifier simultanément les niveaux de ROS et la morphofonction mitochondriale dans les fibroblastes dermiques humains. Cette méthode permet d'établir des empreintes redox robustes.

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