Profilage Redox cellulaire utilisant une microscopie haute teneur

L’objectif global de cette méthode basée sur la microscopie à haut contenu est de quantifier simultanément la morphofonction mitochondriale et les niveaux cellulaires des espèces réactives de l’oxygène afin d’établir une empreinte redox robuste pour les lignées cellulaires exposées à différentes perturbations expérimentales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie redox, telles que si les conditions pathogènes ou les traitements composés provoquent un stress oxydatif, et dans quelle mesure la forme et la fonction mitochondriales sont affectées. Le principal avantage de cette technique est que tous les paramètres peuvent être mesurés au sein d’une même cellule en même temps.

Pour commencer la procédure, ensemencez huit à 10 000 fibroblastes dermiques humains dans 60 puits internes d’une plaque noire à 96 puits avec un mince fond continu en polystyrène ou en verre. Lorsque vous utilisez différentes conditions, traitements ou lignées cellulaires, répartissez leurs emplacements d’ensemencement de manière homogène sur la plaque afin de minimiser les effets de la plaque. Ensuite, ensemencez huit à 10 000 cellules supplémentaires dans le puits B01 pour les utiliser pour le réglage de la mise au point.

Par la suite, remplissez les puits extérieurs vides avec du fluide pour minimiser les gradients entre les puits et l’environnement. Tapotez doucement la plaque trois fois avant de la remettre dans l’incubateur pour éviter que les cellules ne se développent en plaques. Cultivez les cellules pendant 24 heures, ou jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 % de confluence.

Ensuite, enregistrez les informations de traitement de l’expérience dans une feuille de calcul appelée setup. Pour configurer le microscope, calibrez d’abord la platine XY à l’aide du logiciel. Ensuite, créez un protocole d’imagerie pour une plaque multipuits à l’aide du logiciel d’acquisition.

Ce protocole permet l’acquisition automatique de positions définies et de puits sélectionnés d’une plaque de 96 puits. Maintenant, sélectionnez le bon type de plaque multipuits dans une liste de plaques disponibles fournie dans le logiciel. Vous pouvez également définir le format de la plaque multipuits à l’aide des dimensions de la plaque et du puits.

Ensuite, alignez la plaque de puits en définissant deux coins des quatre puits d’angle extérieurs. Ensuite, sélectionnez les puits à acquérir et définissez un protocole d’acquisition composé d’une acquisition séquentielle de longueur d’onde. Assurez-vous que le canal GFP est défini en premier.

Ensuite, définissez une boucle de plaque de puits pour acquérir quatre images régulièrement espacées et sans chevauchement positionnées autour du centre de chaque puits sélectionné en utilisant le protocole d’acquisition défini. Dans cette étape, préparez la solution de coloration pour 60 puits en ajoutant de la solution mère CM-H2DCFDA et TMRM au tampon HBSS HEPES. Ensuite, jetez le milieu de culture des cellules en retournant la plaque en un seul mouvement fluide.

Lavez doucement les cellules deux fois avec le tampon HH. N’oubliez pas bien A01 avec les cellules utilisées pour le réglage de la mise au point. Jetez le tampon HH entre les étapes de lavage.

Ensuite, chargez les cellules avec du CM-H2DCFDA et du TMRM en ajoutant 100 microlitres de la solution de coloration dans chaque puits. Encore une fois, n’oubliez pas bien A01. Incuber les cellules pendant 25 minutes dans l’obscurité à température ambiante.

Après 25 minutes, lavez les cellules deux fois avec 100 microlitres de tampon HH et ajoutez 100 microlitres de tampon HH dans les 60 puits intérieurs. Pour effectuer la mesure proprement dite, installez la plaque sur le microscope. Ensuite, activez le système de mise au point automatique basé sur le matériel et ajustez le décalage de la mise au point automatique en utilisant bien B01 et le canal TMRM jusqu’à ce que vous ayez une image nette.

Ensuite, exécutez le protocole d’imagerie. L’ensemble de données d’image qui en résultera fournira des informations sur les niveaux de ROS basaux, le potentiel de membrane mitochondriale et la morphologie mitochondriale. Ensuite, pour mesurer les niveaux de ROS induits, retirez soigneusement la plaque à 96 puits du microscope.

Ajouter 100 microlitres de solution de TBHP à 40 micromolaires dans chaque puits et attendre au moins trois minutes pour permettre une réaction complète du TBHP avec le CM-H2DCFDA. Pendant ce temps, ajoutez 100 microlitres de la solution de travail des anticorps dans le puits A01. Maintenant, remontez la plaque sur le microscope et vérifiez à nouveau la mise au point à l’aide du bien B01.

Ensuite, acquérez les mêmes positions que lors du premier tour d’imagerie en utilisant le même protocole d’imagerie. L’ensemble de données d’image résultant fournira des informations sur les niveaux de ROS induits. Ensuite, acquérez des images à champ plat dans le puits A01.

Assurez-vous que les signaux sont bien dans la plage dynamique. En ajustant les paramètres d’acquisition. Ensuite, exportez les ensembles de données acquis dans un seul dossier sous forme de fichiers TIFF individuels à l’aide d’une nomenclature standardisée.

Cela inclut la référence à la plaque, au pré ou post-traitement TBHP, au puits, au champ et au canal séparés par des traits de soulignement. Enregistrez également les images de champ plat dans le même dossier que les fichiers TIFF individuels en utilisant la nomenclature standardisée. Dans cette étape, ouvrez le logiciel de traitement d’images et installez le macroset de métriques redox.

Ensuite, ouvrez l’interface de configuration pour paramétrer les paramètres d’analyse en cliquant sur le bouton S. Sélectionnez le type d’image, le nombre de canaux et le puits utilisé pour l’acquisition des images à champ plat. Après cela, indiquez quel canal contient des cellules ou des mitochondries.

Cochez les cases d’arrière-plan et d’amélioration pour effectuer respectivement la soustraction de l’arrière-plan et l’égalisation d’histogramme adaptative de contraste limité. Ensuite, définissez un sigma pour la gaussienne et le floutage des cellules et l’amélioration laplacienne des mitochondries. Sélectionnez un algorithme de seuillage automatique et renseignez les limites d’exclusion de taille.

Ensuite, testez les paramètres de segmentation sur quelques images sélectionnées des ensembles de données acquis en les ouvrant et en cliquant sur les boutons C ou M dans le menu de segmentation des cellules ou des mitochondries respectivement. Ensuite, à partir de l’analyse par lots sur le dossier qui vous intéresse en cliquant sur le bouton de hachage et en sélectionnant le dossier contenant les images. Vérifiez les paramètres et appuyez sur OK.

Après l’analyse par lots, vérifiez visuellement les performances de segmentation sur une pile de vérification en cliquant sur le bouton V et en sélectionnant le dossier contenant les images. Parcourez la pile de vérification pour vérifier si la segmentation a réussi. L’analyse initiale des données extraites se fait automatiquement avec une application Shiny gratuite.

Cela permet une interprétation rapide des résultats. Pour commencer, ouvrez l’application dans R Studio. Choisissez de l’exécuter dans un navigateur externe.

Sur la page de saisie, sélectionnez le répertoire dans lequel se trouvent les fichiers de résultats. Assurez-vous que le fichier d’installation est également présent dans ce répertoire. Les fichiers de résultats et les informations de configuration sont automatiquement importés, compilés et visualisés.

La page de configuration de l’expérience affiche la présentation de l’expérience. La page suivante affiche les niveaux de ROS ainsi que plusieurs paramètres mitochondriaux pour chaque plaque séparément. Sélectionnez la plaque que vous souhaitez visualiser à l’aide du menu déroulant.

Les données sont présentées sous forme de plaques multi-puits, ainsi que dans des boîtes à moustaches avec des valeurs aberrantes étiquetées avec un puits et un numéro d’image. La page complète des résultats de l’expérience montre les résultats normalisés de toutes les plaques combinées, ainsi qu’une analyse statistique de base. Si un fichier de dépôt est fourni via la page de saisie, les points de données spécifiés seront exclus.

Sur la page d’analyse de cluster, un profil redox sensible est composé à l’aide d’un composant principal et d’une analyse sur des données à partir de cinq paramètres. Enfin, la page de téléchargement des données permet d’enregistrer les données traitées et réorganisées pour une utilisation ultérieure. Voici les résultats d’une expérience au cours de laquelle des fibroblastes dermiques humains ont été traités avec l’inhibiteur de la protéase du VIH, le saquinavir.

En utilisant le protocole décrit, une augmentation significative a été détectée pour les niveaux de ROS basaux et induits. Par rapport aux cellules témoins, traitées au DMSO. Le saquinavir a également affecté de façon significative la morphofonction mitochondriale.

Le potentiel de la membrane mitochondriale mesuré par le signal TMRM moyen par pixel mitochondrial a considérablement augmenté. De plus, les mitochondries ont acquis un modèle très fragmenté, indiqué quantitativement par une circularité plus élevée et une taille moyenne plus petite des mitochondries individuelles. En combinant les paramètres susmentionnés à l’aide de l’analyse en composantes principales, les conditions de contrôle et de saquinavir ont pu être clairement séparées l’une de l’autre par leurs empreintes redox.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que l’éclairage lui-même provoque un stress oxydatif. Par conséquent, les conditions d’exposition doivent être réduites au minimum et maintenues constantes tout au long de l’expérience. Une fois maîtrisées, jusqu’à 20 plaques à 96 puits peuvent être colorées et acquises en une journée.

Après le deuxième cycle d’imagerie, les cellules peuvent être fixées et utilisées pour une coloration immunofluorescente en aval. Cela augmente le nombre de paramètres mesurés sur les mêmes cellules et permet de répondre à des questions supplémentaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’effectuer les mesures combinées des ROS et de la morphofonction mitochondriale dans des cultures cellulaires adhérentes à l’aide de la microscopie à haut contenu.