Profilage Redox cellulaire utilisant une microscopie haute teneur

L'objectif général de cette méthode basée sur la microscopie à contenu élevé est de quantifier simultanément la morphofonction mitochondriale et les niveaux cellulaires d'espèces réactives de l'oxygène afin d'établir une empreinte redox robuste pour des lignées cellulaires exposées à différentes perturbations expérimentales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie redox, telles que savoir si des conditions pathogènes ou des traitements par des composés induisent un stress oxydatif, et dans quelle mesure la forme et la fonction mitochondriales sont affectées. Le principal avantage de cette technique est que tous les paramètres peuvent être mesurés au sein de la même cellule et en même temps.

Pour commencer la procédure, ensemencer huit à 10 000 fibroblastes dermiques humains dans 60 puits intérieurs d'une plaque 96 puits noire ayant un fond en polystyrène ou en verre mince et continu. Lorsque différentes conditions, traitements ou lignées cellulaires sont utilisés, répartir leurs emplacements d'ensemencement de manière homogène sur la plaque afin de minimiser les effets de position. Ensuite, ensemencer huit à 10 000 cellules supplémentaires dans le puit B01 afin de l'utiliser pour le réglage du focus.

Ensuite, remplir les puits externes vides avec du milieu afin de minimiser les gradients entre les puits et l'environnement. Tapoter doucement la plaque trois fois avant de la remettre dans l'incubateur pour éviter que les cellules ne poussent par plaques. Cultiver les cellules pendant 24 heures, ou jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 70 %.

Ensuite, enregistrez les informations relatives au traitement pour l'expérience dans un tableur appelé setup. Pour configurer le microscope, commencez par étalonner la platine XY à l'aide du logiciel. Ensuite, créez un protocole d'acquisition pour une plaque multipuits en utilisant le logiciel d'acquisition.

Ce protocole permet l'acquisition automatique de positions prédéfinies et de puits sélectionnés d'une plaque 96 puits. Sélectionnez maintenant le type correct de plaque multi-puits dans la liste des plaques disponibles fournie par le logiciel. Sinon, définissez le format de la plaque multi-puits à l'aide des dimensions de la plaque et des puits.

Ensuite, alignez la plaque de puits en définissant deux coins parmi les quatre puits situés aux coins extérieurs. Puis, sélectionnez les puits à acquérir et définissez un protocole d'acquisition composé d'une acquisition séquentielle selon les longueurs d'onde. Assurez-vous que le canal GFP est configuré en premier.

Ensuite, définir une boucle de plaque de culture pour acquérir quatre images régulièrement espacées et ne se chevauchant pas, positionnées autour du centre de chaque puits sélectionné, en utilisant le protocole d'acquisition défini. À cette étape, préparer la solution de coloration pour 60 puits en ajoutant les solutions mères de CM-H2DCFDA et de TMRM au tampon HBSS HEPES. Puis, éliminer le milieu de culture des cellules en retournant la plaque d'un seul mouvement fluide.

Lavez doucement les cellules deux fois avec le tampon HH. N'oubliez pas le puits A01 contenant les cellules utilisées pour le réglage du focus. Jetez le tampon HH entre les étapes de lavage.

Ensuite, chargez les cellules avec le CM-H2DCFDA et le TMRM en ajoutant 100 microlitres de la solution de marquage à chaque puits. N'oubliez pas à nouveau le puits A01. Incubez les cellules pendant 25 minutes à l'abri de la lumière et à température ambiante.

Après 25 minutes, laver les cellules deux fois avec 100 microlitres de tampon HH et ajouter 100 microlitres de tampon HH dans tous les 60 puits internes. Pour effectuer la mesure proprement dite, installer la plaque sur le microscope. Ensuite, activer le système de mise au point automatique matériel et régler le décalage de la mise au point automatique à l’aide du puit B01 et du canal TMRM jusqu’à l’obtention d’une image nette.

Ensuite, exécutez le protocole d'imagerie. Le jeu de données d'images obtenu fournira des informations sur les niveaux basaux de ROS, le potentiel de la membrane mitochondriale et la morphologie mitochondriale. Ensuite, pour mesurer les niveaux induits de ROS, retirez soigneusement la plaque de 96 puits du microscope.

Ajouter 100 microlitres de solution de TBHP à 40 micromolaire dans chaque puits et attendre au moins trois minutes pour permettre la réaction complète du TBHP avec le CM-H2DCFDA. Pendant ce temps, ajouter 100 microlitres de la solution d'anticorps working dans le puits A01. Ensuite, remettre la plaque sur le microscope et vérifier à nouveau la mise au point à l’aide du puits B01.

Ensuite, acquérez les mêmes positions qu'au cours du premier tour d'imagerie en utilisant le même protocole d'imagerie. Le jeu de données d'image obtenu fournira des informations sur les niveaux de ROS induits. Puis, acquérez des images de champ plat dans le puits A01.

Vérifiez que les signaux se situent bien dans la plage dynamique. En ajustant les paramètres d'acquisition. Ensuite, exportez les jeux de données acquis dans un dossier unique sous forme de fichiers TIFF individuels en utilisant une nomenclature normalisée.

Cela inclut la référence à la plaque, avant ou après le traitement par TBHP, le puits, le champ et le canal, séparés par des traits de soulignement. En outre, enregistrez les images de champ plat dans le même dossier sous forme de fichiers TIFF individuels en utilisant la nomenclature normalisée. Dans cette étape, ouvrez le logiciel de traitement d'images et installez le jeu de macros pour les indicateurs redox.

Ensuite, ouvrez l'interface de configuration pour définir les paramètres d'analyse en cliquant sur le bouton S. Sélectionnez le type d'image, le nombre de canaux et le puits utilisé pour l'acquisition des images de champ plat. Indiquez ensuite quel canal contient les cellules ou les mitochondries.

Cochez les cases « Background » et « Enhance » pour effectuer respectivement la soustraction du fond et l'égalisation d'histogramme adaptative avec limitation du contraste. Ensuite, définissez une valeur sigma pour le lissage gaussien des cellules et l'amélioration du laplacien des mitochondries. Sélectionnez un algorithme de seuillage automatique et indiquez les limites d'exclusion de taille.

Ensuite, testez les paramètres de segmentation sur quelques images sélectionnées des jeux de données acquis en les ouvrant et en cliquant sur les boutons C ou M du menu pour la segmentation des cellules ou des mitochondries, respectivement. Ensuite, effectuez l'analyse en lot sur le dossier d'intérêt en cliquant sur le bouton dièse et en sélectionnant le dossier contenant les images. Vérifiez les paramètres et appuyez sur OK.

Après l'analyse par lot, vérifiez visuellement les performances de la segmentation sur une pile de vérification en cliquant sur le bouton V et en sélectionnant le dossier contenant les images. Parcourez la pile de vérification pour confirmer si la segmentation a été réussie. L'analyse initiale des données extraites est effectuée automatiquement à l'aide d'une application Shiny fournie gratuitement.

Cela permet une interprétation rapide des résultats. Pour commencer, ouvrez l'application dans R Studio. Choisissez de l'exécuter dans un navigateur externe.

Sur la page d'entrée, sélectionnez le répertoire où se trouvent les fichiers de résultats. Assurez-vous que le fichier de configuration est également présent dans ce répertoire. Les fichiers de résultats et les informations de configuration sont automatiquement importés, compilés et visualisés.

La page de configuration de l'expérience montre l'agencement de l'expérience. La page suivante affiche les niveaux de ROS ainsi que plusieurs paramètres mitochondriaux pour chaque plaque séparément. Sélectionnez la plaque que vous souhaitez visualiser à l'aide du menu déroulant.

Les données sont présentées sous forme de plaque multipuits, ainsi que sous forme de diagrammes en boîte avec les valeurs aberrantes étiquetées par le numéro du puits et de l'image. La page des résultats de l'ensemble de l'expérience affiche les résultats normalisés issus de l'ensemble des plaques combinées, accompagnés d'une analyse statistique de base. Si un fichier de suppression est fourni via la page d'entrée, les points de données spécifiés seront exclus.

Sur la page d'analyse de regroupement, un profil redox sensible est établi à l'aide d'une analyse en composantes principales sur des données issues de cinq paramètres. Enfin, la page de téléchargement des données permet d'enregistrer les données traitées et réorganisées pour une utilisation ultérieure. Les résultats présentés ici proviennent d'une expérience dans laquelle des fibroblastes dermiques humains ont été traités avec l'inhibiteur de protéase du VIH Saquinavir.

À l'aide du protocole décrit, une augmentation significative a été détectée tant pour les niveaux de ROS basaux qu'induits, par rapport aux cellules témoins traitées au DMSO. La saquinavir a également affecté de manière significative la morphofonction mitochondriale.

Le potentiel de la membrane mitochondriale, mesuré comme le signal moyen de TMRM par pixel mitochondrial, a augmenté de manière significative. En outre, les mitochondries ont adopté un patron fortement fragmenté, indiqué quantitativement par une circularité plus élevée et une taille moyenne plus petite des mitochondries individuelles. En combinant les paramètres susmentionnés à l'aide d'une analyse en composantes principales, les conditions témoin et Saquinavir pouvaient être clairement séparées l'une de l'autre par leurs empreintes redox.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que l'illumination elle-même provoque un stress oxydatif. Par conséquent, les conditions d'exposition doivent être minimisées et maintenues constantes tout au long de l'expérience. Une fois la technique maîtrisée, jusqu'à 20 plaques de 96 puits peuvent être marquées et analysées en une seule journée.

Après le deuxième cycle d'imagerie, les cellules peuvent être fixées et utilisées pour une coloration immunofluorescente en aval. Cela augmente le nombre de paramètres mesurés sur les mêmes cellules exactes et permet de répondre à des questions supplémentaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'effectuer des mesures combinées de ROS et de la morphofonction mitochondriale dans des cultures cellulaires adhérentes en utilisant la microscopie à contenu élevé.