Name: Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse d'images semi-automatisée pour quantifier la dynamique des protrusions filopodiales et la concentration protéique en cellules vivantes. Cette approche permet une évaluation spatiale précise des protéines impliquées dans l'extension et la rétraction cellulaire.

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Les auteurs reconnaissent le financement du DFG (EXC-1003 à MG).

1. Culture cellulaire <ol><li> Culture HeLa ou cellules COS dans le milieu Eagle Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 4,5 g / L de D-glucose, dipeptide L-alanine-L-glutamine, pyruvate, 10% de sérum bovin fœtal et 10 unités / ml de pénicilline / streptomycine. Les neurones de la culture dans les milieux de culture sans L-glutamine, l&#39;acide glutamique ou l&#39;acide aspartique, additionnés de 0,5 mM de dipeptide L-alanine-L-glutamine, de suppléments neuronaux exempts de sérum et 10 unités / ml de pénicilline / streptomycine. </li><li> Une fois que la concentration de 40% est atteinte, transférez les cellules avec des constructions de choix en utilisant un réactif de transfection selon les instructions du fabricant. Garder les cellules transfectées dans l&#39;incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 15-18 h. </li><li> Pour réduire les variations de pH et d&#39;osmolarité (due à l&#39;évaporation) pendant l&#39;acquisition de l&#39;image, remplissez les chambres de culture cellulaire (avant l&#39;imagerie) jusqu&#39;à 90% avec un milieu préchauffé à 37 ° C contenant 20 mM de 4- (2-hydroxyéthyl) -1 -pipérazine-éthanesulfonique (HEPES). À scellerLe couvercle, appliquer une fine couche de graisse sous vide à l&#39;intérieur du couvercle et appuyer doucement sur la chambre de culture contenant les cellules transfectées. </li></ol> 2. Acquisition d&#39;image NOTE: La longueur de filopodia varie de 2 à 10 μm 13 . Filopodia se développe à une vitesse moyenne de 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 . <ol><li> Acquérir des images à l&#39;aide d&#39;un microscope avec objectif 60X ou 100X et sans binage de pixels (ici, un microscope confocal à disque tournant). Utilisez des taux d&#39;acquisition supérieurs à 1 Hertz (Hz) pour suivre la dynamique des filopodies. Pour minimiser les artefacts hors focus, image filopodia près de la membrane basale ( c&#39;est-à-dire la surface du substrat). </li><li> Pour assurer un suivi en douceur, ajustez le temps d&#39;exposition de l&#39;appareil photo et l&#39;intensité du laser de telle sorte que le rapport signal / bruit (SNR) soit supérieur à 4. Évitez la saturation des canaux individuels ( c.-à-d. Valeurs de pixels de255 pour les images 8 bits et 65 535 pour les images 16 bits), car cela empêchera l&#39;analyse d&#39;image ultérieure. </li><li> Pour éviter la purge, utilisez uniquement des étiquettes de fluorescence compatibles avec les lignes laser et les filtres du microscope (pour plus de détails, voir la référence 15 ). </li></ol> 3. Prétraitement de l&#39;image REMARQUE: utilisez ImageJ ou autre logiciel disponible pour prétraiter les images 16 , 17 . <ol><li> Si l&#39;échantillon se déplace, corrigez la dérive latérale à l&#39;aide du logiciel disponible ( par exemple https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) avant l&#39;analyse. Exclure les films avec une dérive axiale (c&#39;est-à-dire un mouvement en direction z). </li><li> L&#39;arrière-plan correct ( c.-à-d. Les valeurs de gris des zones en dehors de la cellule), le blanchiment ( c.- à-d. Une perte continue si l&#39;intensité de fluorescence due aux effets des protéines de fluorescence) et une purge possible ( c&#39;est -à- dire le signal d&#39;une grippeSonde d&#39;orescence dans les deux canaux) en utilisant le logiciel disponible ( p. Ex. Http://imagej.net/Category:Plugins et 16 , 17 ). Remarque: Les intensités de fluorescence des canaux individuels ne sont pas modifiées par le logiciel. </li><li> Pour assurer une analyse d&#39;image ultérieure, enregistrez les films correspondant à des chaînes de protéines particulières en échelle de gris sous forme de fichier empilé .tiff dans le dossier de travail. REMARQUE: les dimensions ( c&#39;est-à-dire la taille, la longueur) des piles doivent être identiques pour tous les canaux. </li></ol> 4. Analyse d&#39;image - Étape 1: Charger des images REMARQUE: Le logiciel décrit ici a été écrit dans Matlab (appelé logiciel de programmation) et fonctionnera uniquement avec ce programme. <ol><li> Téléchargez le dossier zippé contenant tous les fichiers requis pour l&#39;analyse d&#39;image à partir du site suivant: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwsont/. Décompressez et copiez les fichiers dans le dossier de travail. </li><li> Une fois installé, ouvrez le logiciel de programmation et exécutez &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39;. La fenêtre GUI n ° 1 s&#39;ouvrira comme indiqué sur la figure 2A . </li><li> Chargez les fichiers &quot;.tiff&quot; empilés sauvegardés correspondant à une protéine particulière d&#39;intérêt dans la fenêtre GUI # 1 en utilisant les boutons &lt;1b&gt; pour la protéine A, &lt;1c&gt; pour la protéine B, &lt;1d&gt; pour la protéine C. Voir la figure 2 et la table 1 pour plus de détails. REMARQUE: la protéine A présentée dans la fenêtre GUI # 1 sert de chaîne de référence pour l&#39;analyse ratiométrique finale. </li><li> Créez une image superposée de la cellule à partir des canaux protéiques en cliquant &lt;1a&gt;. </li><li> Cliquez sur &lt;2a&gt; pour attribuer la première image et &lt;2b&gt; pour la dernière image utilisée pour l&#39;analyse. </li><li> En option, recadrer la région d&#39;intérêt (ROI) contenant le filopodium d&#39;intérêt en utilisant le bouton &lt;2h&gt;, faire pivoter l&#39;image.Chanter le bouton &lt;2i&gt;, ou supprimer des régions indésirables à l&#39;aide de l&#39;outil de dessin gratuit &lt;2j&gt;. REMARQUE: pour rationaliser l&#39;analyse d&#39;image, il est recommandé d&#39;isoler le ROI ( c.-à-d. Recadrer, faire pivoter, supprimer) avec les autres étapes de prétraitement (soustraction d&#39;arrière-plan, corrections de blanchiment, etc.) en utilisant ImageJ. </li><li> Déplacez le curseur &lt;2c&gt; pour chaque image pour le contrôle de la qualité et pour vérifier si le filopodium reste visible sur tout le film. </li></ol> 5. Analyse d&#39;image - Étape 2: générer une trace <ol><li> Cliquez sur le bouton &lt;3a&gt; dans la fenêtre GUI # 1 pour ouvrir la fenêtre GUI # 2 (voir la figure 2B ). </li><li> Cliquez sur le bouton &lt;4&gt; dans la fenêtre GUI # 2 pour générer le masque du corps cellulaire superposé (généré dans la fenêtre GUI # 1 après avoir cliqué sur &lt;1a&gt;). Le programme génère également la limite du masque, où la coque convexe est implémentée pour obtenir les points de vertex. </li><li> CliTouche ck &lt;5&gt;; Un curseur apparaîtra. Utilisez le curseur pour sélectionner la base (à partir de laquelle la distance de la pointe du filopodie est mesurée) suivie de la pointe du filopodia dans le cadre où elle apparaît pour la première fois. Pour ce faire, déplacez le curseur dans la fenêtre n ° 2). REMARQUE: Pour minimiser les erreurs dans la sortie de données, placez le point de base verticalement sous le pointage filopodique le long de l&#39;axe. Le positionnement du point de base sur d&#39;autres endroits ( par exemple déplacé latéralement) peut introduire une polarisation directionnelle dans les valeurs de fluorescence dans le corps de la cellule. </li><li> Sélectionnez la longueur de seuil (ci-dessus que le filopodia se pliera) en utilisant &lt;6c&gt;. Remarque: Cette longueur est définie comme la distance entre le point de base (sélectionné en utilisant &lt;5&gt;) et la limite du corps de la cellule ( c. -à- d. La région d&#39;où le filopodia commence à croître). La distance mesurée est en pixels. </li><li> Spécifiez le nombre de segments utilisés pour approximer la forme des filopodes dans la case &lt;6a&gt;. REMARQUE: le mLe nombre minimum de segments dépend de la longueur maximale atteinte par le filopodium, mais aussi de la façon dont le filopodium se penche. Ne sélectionnez pas un nombre de segments supérieur au nombre de pixels entre la base et la pointe ( c&#39;est -à- dire la longueur de seuil). Sélection de plus de segments que la longueur de seuil définie à l&#39;étape 5.4. (C&#39;est-à- dire le nombre de pixels entre la base et la pointe) entraînera une surestimation de la longueur du filopodium. </li><li> Spécifiez la largeur de numérisation, qui agit comme un scanner horizontal pour placer les noeuds, en &lt;6b&gt;. REMARQUE: ces noeuds sont utilisés par le programme pour s&#39;adapter à la ligne qui relie la base et la pointe avec le corps du filopodium ( c.- à- d. Pour créer l&#39;ossature). Comme point de départ, mettez une valeur en pixels égale à la longueur maximale multipliée par un facteur de <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> Spécifiez le rayon de balayage (en pixels) dans la zone &lt;6d&gt;. Utilisez une valeur qui est environ 50% plus grande que l&#39;obA servi de déplacement d&#39;extrémité entre les cadres. REMARQUE: l&#39;utilisation d&#39;un rayon de balayage très important pourrait prendre des points de coque convexe indésirables dans des cadres où il n&#39;y a pas de pointe filopodique réelle ( p. Ex. Mouvement hors-plan ou faible SNR). </li><li> Spécifiez l&#39;angle de flexion dans la zone &lt;6e&gt;. NOTE: Le seuil d&#39;angle est déterminé par l&#39;angle maximal que le filopodium se penche pendant toute l&#39;analyse. La spécification du seuil d&#39;angle aide le logiciel à exclure le suivi des structures indésirables qui croissent du côté des filopodes lorsque le filopodia se penche vers le corps de la cellule. Le programme fonctionne de manière fiable pour les filopodes avec des angles basculants inférieurs à 45 degrés par rapport à l&#39;axe vertical. </li><li> Pour commencer le suivi, cliquez sur le bouton &lt;Suivre et analyser&gt; dans la fenêtre GUI # 2. Cliquez sur la case &quot;Historique trace&quot; dans la fenêtre GUI # 2 pour enregistrer tout le protocole de suivi pour une référence ultérieure. REMARQUE: Une fois la procédure de suivi terminée, la longueur du filopodium dans chaque image est stockée dansLa feuille nommée &#39;length_vel&#39; de &#39;dynamics.xlsx&#39; pour les références futures. De même, tous les autres paramètres de suivi sont mémorisés dans la feuille appelée «paramètres» de «dynamics.xlsx». </li><li> En option, si le filopodia n&#39;est pas automatiquement détecté dans toutes les images, utilisez les étapes suivantes pour corriger manuellement. <ol><li> Visitez le cadre respectif à l&#39;aide du curseur dans la fenêtre n ° 2 et sélectionnez manuellement la pointe du filopodium. Remarque: Les cadres, où aucun point de coque convexe n&#39;est détecté, seront représentés par une région bleue dans la fenêtre de suivi de la fenêtre GUI # 2. Il est obligatoire de vérifier le bouton &#39;Historique trace&#39; avant que le programme de suivi ne soit lancé pour accéder aux coordonnées nodales dans cette image. </li><li> Sélectionnez les points de référence (base suivie d&#39;un conseil) en utilisant &lt;6f&gt; dans la fenêtre GUI # 2. Spécifiez les autres paramètres tels que «longueur de balayage», «Mesure précise après» et «Angle de flexion maximal»; Pour ce cadre comme décrit aux étapes 5.4-5.8. </li><li> Cliquez sur le bouton &lt;6i&gt; pour enregistrer les nouveaux paramètres (spécifiques à cette image). Les étapes doivent être répétées pour tous les cadres indiqués par la région bleue. </li><li> Une fois terminé, réinitialisez la procédure de suivi en utilisant &lt;7&gt;. NOTE: Cette correction peut également être utilisée si le programme passe brusquement d&#39;un filopodie à l&#39;autre dans un film. En alternative, envisagez de recadrer des films contenant plusieurs filopodes. </li></ol></li></ol> 6. Analyse d&#39;image - Étape 3: analyse spatio-temporelle des protéines <ol><li> Pour l&#39;analyse spatio-temporelle, sélectionnez la case représentée par &lt;8b&gt; suivie du canal protéique d&#39;intérêt (&lt;8c&gt; et / ou &lt;8d&gt; et / ou &lt;8e&gt;). Remarque: Il est obligatoire de sélectionner la protéine A avant l&#39;analyse ratiométrique (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; et / ou &lt;9c&gt;) puisque la protéine A est utilisée comme référence. </li><li> Cliquez sur &lt;8a&gt;Pour initier le suivi des protéines le long de la longueur du filopodie en utilisant la trace générée à l&#39;étape 5.9. </li></ol> 7. Analyse d&#39;image - Étape 4: Analyse de protéines métriques <ol><li> Cochez la case &lt;9b&gt; ou &lt;9c&gt; et cliquez sur le bouton &lt;9a&gt; pour obtenir la trame ratiométrique spatio-temporelle. REMARQUE: pour éviter une représentation inexacte de la concentration relative de protéines, l&#39;image ratiométrique n&#39;est pas tracée comme X / Y mais comme log (X / Y). Pour une utilisation future, le tracé ratiométrique est exporté dans les fichiers au format &#39;.png&#39; et &#39;.fig&#39;, et les données du tracé brut sont stockées dans le fichier &#39;dynamics.xlsx&#39;. </li></ol> 8. Analyse d&#39;image - Étape 5: analyse de pointe de filopodie <ol><li> Cochez la case &lt;8f&gt; et spécifiez la longueur de la pointe et la longueur de seuil à partir de la base en utilisant &lt;8g&gt; et &lt;8h&gt;. Cliquez sur &lt;bouton&gt; pour enregistrer les données dans le fichier &#39;dynamics.xlsx&#39;. Cliquez sur &lt;Analyser les intensités de protéines&gt; pour générer leTrace des intensités de protéines de la pointe de la filopodie et pour économiser pour l&#39;analyse ratiométrique. REMARQUE: la longueur de l&#39;embout détermine le nombre de pixels à la pointe utilisée pour l&#39;analyse. Le logiciel renverra la valeur d&#39;intensité moyenne des pixels à la pointe sur chaque image. La longueur de seuil détermine la distance minimale de la base à la pointe au-dessus de laquelle le filopodium (pointe filopodique) commence à croître (et lorsque le programme commence à suivre la valeur d&#39;intensité de la pointe). La longueur de la pointe doit donc être inférieure à la longueur de seuil. </li><li> Cliquez sur le ratio souhaité à analyser en utilisant &lt;9d&gt; ou &lt;9e&gt;. </li><li> Cliquez sur le bouton de comparaison &lt;9a&gt; pour générer les données ratiométriques. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour le suivi de la dynamique de croissance filopodiale et l&#39;analyse des concentrations protéiques relatives dans ces structures dynamiques via l&#39;algorithme de coque convexe. En utilisant le logiciel, jusqu&#39;à 3 canaux peuvent être comparés par paire dans une seule opération, de sorte que les concentrations relatives de deux canaux ( c&#39;est-à-dire les protéines) sont déterminées tout au long du cycle d&#39;extension / rétractation et stockées sous forme de...

Le contrôle spatio-temporel des protéines régulatrices d&#39;actine est associé à la dynamique du filopodium 1 , 2 . Le suivi de la concentration de protéines spatialement résolue tout au long de la longueur filopodiale dans le temps est donc crucial pour faire progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l&#39;initiation, l&#39;allongement, la stabilisation ou l&#39;effondrement de ces structures dynamiques 3 , 4 . Contrairement à l&#39;analyse des protéines dans le cytosol, où de nombreux changements de forme cellulaire se produisent à plus grande échelle, les filopodes sont des micro structures dynamiques qui bouclent constamment 5 et se courbent, ce qui exclut l&#39;analyse en utilisant une approche simple telle qu&#39;une analyse de ligne. Différentes solutions logicielles pour le suivi de la forme filopodique sont disponibles 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, un logiciel pour le suivi ratitimétrique de la dynamique des protéines dans le corps cellulaire a été développé 10 , 11 . Pour combiner le suivi automatique de la forme filopodique et l&#39;analyse spatio-temporelle des protéines, nous avons récemment développé un logiciel d&#39;analyse d&#39;image basé sur l&#39;algorithme de la coque convexe 12 . Cette nouvelle méthode d&#39;analyse, qui fonctionne via une interface utilisateur graphique (GUI), combine pour la première fois, la concentration relative de protéines le long de la longueur et de la vitesse de croissance filopodiales, permettant ainsi une mesure précise de la répartition spatio-temporelle des protéines indépendamment du mouvement de ces Structures dynamiques 12 . L&#39;idée derrière le logiciel (le code source est disponible gratuitement, voir ci-dessous) est que l&#39;un des sommets de la coque convexe coïncide avec la pointe du filopodium ( Figure 1A ). En regardant dans le cadre ultérieur pourLe sommet le plus proche de la coque convexe, la pointe mobile peut être suivie tout au long du film. Une fois que la pointe est détectée dans chaque cadre, sa position est utilisée pour dessiner un axe en joignant la pointe avec un point de référence à la base du filopodium ( figure 1B ). Enfin, en utilisant des points nodaux équidistants, dont les positions sont déterminées par le pixel médian avec une intensité maximale le long de la ligne orthogonale à l&#39;axe, sont utilisés pour déterminer un squelette qui suit la forme filopodique. Profitant de ce squelette adaptatif, un kymographe est généré pour tracer la croissance filopodiale et les concentrations de protéines pour jusqu&#39;à trois canaux le long de la longueur filopodique ( figure 1C ). <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Figure 1: Principe de fonctionnement du logiciel d&#39;analyse d&#39;image. ( A ) L&#39;algorithme derrièreles logiciels. À l&#39;étape 1, l&#39;utilisateur spécifie la référence (base) et le sommet (la pointe) du filopodium. À l&#39;étape 2-1, l&#39;ossature du filopodium est obtenue en utilisant le pixel médian avec une valeur d&#39;intensité maximale. À l&#39;étape 3, l&#39;ossature est utilisée pour le profil d&#39;intensité de protéine spatiale. À l&#39;étape 2-2, le logiciel suit automatiquement la pointe dans la trame suivante. La procédure entière itère. ( B ) Instantané de l&#39;algorithme avec du filopodium réel présentant des éléments importants tels que la coque convexe qui est utilisée pour le suivi. ( C ) Vue d&#39;ensemble des paramètres qui peuvent être mesurés avec l&#39;algorithme. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> Le logiciel d&#39;analyse d&#39;image est utilisé dans Matlab (appelé logiciel de programmation) par une utilisation graphiqueR interface. Pour maximiser la flexibilité et la robustesse pour le réglage expérimental particulier, l&#39;utilisateur peut ajuster une série de paramètres de suivi ( p. Ex. Angle de flexion autorisé et mouvement entre images) et effectuer également des corrections aux films ( p. Ex., Recadrage, rotation, élimination des objets indésirables) ( Figure 2A et tableau 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> Non. </td><td> Obligatoire </td><td colspan="5"> La description </td><td> Nom (en GUI) </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Chargement du fichier .tiff empilé représentant le corps de la cellule (avec la case cochée) ou créez le corps cellulaire superposé à partir des canaux </td><td> Corps cellulaire </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Chargement d&#39;un fichier d&#39;image empilé correspondant à la protéine 1 </td><td> Protéines 1 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Chargement d&#39;un fichier d&#39;image empilé correspondant à la protéine 2 </td><td> Protéines 2 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Chargement du fichier d&#39;image empilé correspondant à la protéine 3 </td><td> Protéines 3 </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5"> Réinitialise tout à précharger les fichiers d&#39;images empilés </td><td> Réinitialiser </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barre de défilement pour déterminer la trame initiale pour l&#39;analyse dans la fenêtre GUI n ° 2 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barre de défilement pour déterminer le cadre final pour l&#39;analyse dans la fenêtre GUI n ° 2 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barre de défilement représentant le curreCadre nt </td><td> N / A </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2d </td><td> N </td><td colspan="5"> La valeur grise des pixels au-dessous de laquelle tous les pixels seront mis à zéro </td><td> N / A </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5"> La valeur grise des pixels au-dessus de laquelle tous les pixels seront définis sur les valeurs maximales </td><td> N / A </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2f </td><td> N </td><td colspan="5"> Définissez les valeurs d&#39;intensité des pixels spécifiées par &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; </td><td> Ensemble </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2 g </td><td> N </td><td colspan="5"> Jouez le film ajusté en intensité </td><td> Jouer </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2h </td><td> N </td><td colspan="5"> Image de culture </td><td> Surgir </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5"> Faire pivoter l&#39;image </td><td> Tourner </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 2j </td><td> N </td><td colspan="5">Supprimer les régions dans l&#39;ensemble de la pile </td><td> Supprimer les régions </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 3a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Cliquez pour ouvrir la «fenêtre d&#39;analyse» (fenêtre GUI n ° 2) </td><td> Fenêtre de suivi </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Entrez la taille d&#39;un pixel en microns </td><td> Entrer la taille du pixel </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Cliquez pour générer l&#39;image limite / bord du corps cellulaire superposé </td><td> Frontière </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Cliquez pour sélectionner la base et la pointe du filopodia </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Entrez le nombre de segments ou de nœuds </td><td> Nombre de segments </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Entrez la longueur de balayage (perpendiculaire à l&#39;axe) </td><td> Largeur de numérisation </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Entrez la longueur au-dessus de laquelle filopodia commence à se pencher </td><td> Mes exacte après </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Entrez le rayon du cercle de détection de la pointe (c&#39;est-à-dire la zone où le sommet peut être localisé dans la prochaine image) </td><td> Radius de détection de pointe </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Entrez l&#39;angle maximum que le filopodium peut se pencher de l&#39;axe vertical </td><td> Seuil d&#39;angle </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6f </td><td> N </td><td colspan="5"> Ajouter des points de référence pour la base et la pointe pour ce cadre spécifique </td><td> Sélectionnez la référence </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 g </td><td> N </td><td colspan="5"> Entrez la longueur au-dessus de laquelle filopodia commence à se plier pour ce cadre spécifique </td><td> Mes exacte après </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5"> Entrez le rayon du cercle de détection pour ce cadre spécifique </td><td> Radius de détection de pointe </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5"> Après avoir entré tous les paramètres pour le cadre spécifique, cliquez pour enregistrer les valeurs dans la mémoire et le fichier pour plus d&#39;informations. </td><td> Ajouter </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6j </td><td> N </td><td colspan="5"> Cliquez pour supprimer les paramètres manuellement définis pour cette image </td><td> Effacer </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6k </td><td> N </td><td colspan="5"> Cliquez pour supprimer tous les paramètres stockés manuellement à l&#39;aide du «panneau des fonctions optionnelles» pour tous les cadres </td><td> Réinitialiser </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6l </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in avant le suivi pour stocker tous les résultats de suivi en mémoire pour référence future </td><td> Histoire trace </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Cliquez pour commencer le suivi </td><td> Suivre et analyser </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8a </td><td> N </td><td colspan="5"> Cliquez pour commencer le suivi de l&#39;intensité du canal protéique </td><td> Analyser les intensités de protéines </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8b </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in pour suivre l&#39;intensité du canal protéique le long de la longueur filopodiale </td><td> Filopodes entiers </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8c </td><td> N </td><td colspan="5"> Vérifier le suivi de la protéine de référence ou de la protéine A </td><td> ProteinA </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8d </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in pour le suivi de la protéine B </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in pour le suivi de la protéine C </td><td> Protéines </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8f </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in pour suivre l&#39;intensité moyenne de la protéine dansE tip </td><td> Conseil principal </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8 g </td><td> N </td><td colspan="5"> Entrez la longueur de la pointe </td><td> Longueur des embouts </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8h </td><td> N </td><td colspan="5"> Entrez la distance minimale à partir de la base au-dessus de laquelle la pointe commence à former </td><td> seuil </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5"> Cliquez pour enregistrer les résultats de l&#39;analyse de pointe avant de déposer </td><td> Bouton poussoir </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9a </td><td> N </td><td colspan="5"> Cliquez pour lancer l&#39;analyse de la protéine ratiométrique </td><td> Comparer </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in pour comparer la protéine B par rapport à A </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9c </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in pour comparer la protéine C par rapport à A </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in pour comparer la protéine B par rapport à A à la pointe </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5"> Check in pour comparer la protéine C par rapport à A à la pointe </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10a </td><td> N </td><td colspan="5"> Choisissez d&#39;autres cartes de couleurs (par défaut: Jetplot) </td><td> Carte de couleur </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10b </td><td> N </td><td colspan="5"> Modifier la couleur </td><td> Modifier la couleur </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Vue d&#39;ensemble de toutes les fonctions Présentes dans la GUI Windows n ° 1 et n ° 2. Une fois que cela est accompli, le programme crée une coque convexe et suit automatiquement la pointe tout au long du film. Paramètres extraits du film, tels qu&#39;un kymographe ratiométrique, une vitesse de croissance et une longueur filopodique aSont affichés et enregistrés dans le dossier de travail sous forme d&#39;images et de fichiers de données. D&#39;autres paramètres tels que la durée de vie filopodiale, le taux de croissance et le taux de retrait peuvent ensuite être extraits et analysés plus avant à partir des fichiers de données stockés ( Figure 2B ). <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Figure 2: Interface utilisateur graphique pour l&#39;utilisation du logiciel d&#39;analyse d&#39;image. ( A ) La fenêtre GUI # 1 est utilisée pour charger et traiter des images. Le programme peut charger jusqu&#39;à 3 canaux de protéines, par lequel 2 canaux sont comparés par paire. La fenêtre est livrée avec des fonctions obligatoires (bleu) et optionnelles (vert) pour prétraiter les images avant le suivi ( B ). La fenêtre GUI # 2 est utilisée pour suivre l&#39;analyse des protéines filopodium ainsi que spatio-temporelles et proportionnelles. Encore une fois, les fonctionnalités facultatives sont marquées en vert. Ce chiffre a été modifiDe la référence 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la préparation des échantillons et la gestion du logiciel. Nous commençons par des instructions détaillées sur la culture des cellules et l&#39;acquisition de films optimisés pour l&#39;analyse d&#39;image. Cette section sur l&#39;acquisition de données est suivie d&#39;une description détaillée pour l&#39;utilisation du logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Tout au long du protocole, nous présentons des étapes critiques et des fonctionnalités facultatives qui devraient être prises en compte lors de la collecte et du traitement des données. Enfin, nous analysons filopodia à partir de différents modèles de systèmes avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image, avant de terminer avec une comparaison du logiciel d&#39;analyse d&#39;image décrit avec d&#39;autres programmes disponibles pour la quantification filopodiale et une discussion sur les limites et les orientations futures.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>10 % sérum de veau fœtal</td><td>Biochrom AG</td><td>L11-044</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>1 % pénicilline/streptomycine</td><td>Biochrom AG</td><td>12212</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium Life</td><td>Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (solution mère 1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Citrine-N1</td><td>Addgene</td><td>54593</td><td></td></tr><tr><td>Labtech</td><td>Thermo</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Thermo</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>COS 7</td><td>Leibniz Institut DSMZ</td><td>ACC-60</td><td></td></tr><tr><td>3T3 cellules</td><td>Institut Leibniz DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nicon Eclipse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>DU888 Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Unit</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr></tbody></table>

une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia sont des protrusions cellulaires dynamiques, semblables à des doigts associées à la migration et à la communication cellule-cellule. Afin de mieux comprendre les mécanismes de signalisation complexes sous-jacents à l&#39;initiation filopodiale, à l&#39;allongement et à la stabilisation ou à la rétraction ultérieure, il est crucial de déterminer l&#39;activité spatio-temporelle de la protéine dans ces structures dynamiques. Pour analyser la fonction des protéines dans filopodia, nous avons récemment développé un algorithme de suivi semi-automatisé qui s&#39;adapte aux changements de forme filopodique, permettant ainsi une analyse parallèle de la dynamique de protrusion et de la concentration relative de protéines sur toute la longueur de la filopodie. Nous présentons ici un protocole détaillé étape par étape pour la gestion optimisée des cellules, l&#39;acquisition d&#39;images et l&#39;analyse de logiciels. Nous fournissons également des instructions pour l&#39;utilisation de fonctionnalités facultatives lors de l&#39;analyse d&#39;image et de la représentation des données, ainsi que des directives de dépannage pour toutes les étapes critiques en cours de route. Enfin, nous incluons également une comparaison de la dLogiciel d&#39;analyse d&#39;image écrited avec d&#39;autres programmes disponibles pour la quantification de filopodia. Ensemble, le protocole présenté fournit un cadre pour une analyse précise de la dynamique des protéines dans les protubérances filopodiales à l&#39;aide d&#39;un logiciel d&#39;analyse d&#39;image.

En utilisant des cellules COS transfectées avec un marqueur pour l&#39;actine filamenteuse (f-tractine 18 , rouge) et une référence cytosolique (vert), nous avons trouvé des protrusions filopodiales riches en actine ( figure 3A , panneau supérieur). Les séries chronologiques ont montré que les filopodes se prolongent et se rétractent rapidement ( figure 3A , panneau central). En utilisant le logiciel d&#3...

Nous présentons une solution logicielle pour le suivi semi automatisé de la concentration relative de protéines sur toute la longueur des protrusions cellulaires dynamiques.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

L’objectif global de ce logiciel d’analyse d’images est l’analyse parallèle de la dynamique de protrusion et de la concentration relative en protéines sur toute la longueur du filopodial. Cette méthode peut vraiment nous aider à comprendre des questions clés en biologie cellulaire, en particulier les protéines individuelles impliquées dans l’extension et la rétraction des filopodes. Le principal avantage de la technique est que l’algorithme de suivi de forme adaptatif fourni permet une évaluation quantitative de la dynamique de la saillie et la localisation des protéines résolue dans l’espace.Pour commencer, cultivez des neurones, des cellules HeLa ou COS, dans un milieu supplémenté comme détaillé dans le protocole de texte. Une fois que la confluence de 40 % est atteinte, transvectez les cellules avec les constructions de votre choix, à l’aide d’un réactif de transvection selon les instructions du fabricant. Conservez les cellules transvectées dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 15 à 18 heures.Après l’incubation, remplissez les chambres de culture cellulaire jusqu’à 90 % avec un milieu préchauffé à 37 degrés Celsius, contenant 20 milli molaires HEPES, afin de réduire les changements de pH et d’osmolarité dus à l’évaporation lors de l’acquisition de l’image. Pour sceller le couvercle, appliquez une fine couche de graisse sous vide à l’intérieur du couvercle et appuyez doucement sur la chambre de culture contenant les cellules transvectionnées. La partie la plus importante pour l’analyse d’image est peut-être la qualité de l’image.Une chose dont nous devons faire attention est le rapport signal/bruit, qui doit être supérieur à quatre et nous pouvons nous assurer qu’en ajustant le temps d’exposition de la caméra et l’intensité et la force du laser, la fréquence d’images doit être supérieure à un hertz. Acquérez les images à l’aide d’un microscope avec un objectif 60x ou 100x et sans flexion des pixels. Utilisez des taux d’acquisition d’au moins un hertz pour suivre la dynamique des filopodes.Pour minimiser les artefacts flous, imagez le filopodial près de la membrane du basilic. Pour assurer un suivi fluide, ajustez le temps d’exposition de la caméra et l’intensité du laser de sorte que le rapport signal/bruit soit supérieur à quatre. Une fois cette opération terminée, lancez l’acquisition de l’image.Après le prétraitement de l’image, comme décrit dans le protocole texte, chargez les images en téléchargeant le dossier compressé contenant tous les fichiers requis pour l’analyse d’image. Décompressez et copiez les fichiers dans le dossier de travail. Une fois installé, démarrez l’interface utilisateur graphique en ouvrant le fichier nommé filopodiaAnalysisM3.fig.Chargez les fichiers TIFF de pile enregistrés pour les protéines individuelles dans l’interface utilisateur graphique ou l’interface graphique. À l’aide des boutons 1B pour la protéine A, 1C pour la protéine B et éventuellement, 1D pour la protéine C.Créez une image superposée de la cellule à partir des canaux protéiques en cliquant sur 1A. Ensuite, cliquez sur 2A, pour attribuer la première image et cliquez sur 2B, pour attribuer la dernière image à l’analyse.Si vous le souhaitez, recadrez la région d’intérêt ou le ROI, contenant le filopodium d’intérêt à l’aide du bouton 2H. Faites pivoter l’image à l’aide du bouton 2I ou supprimez les régions indésirables à l’aide de l’outil de dessin à main levée, 2J. Déplacez le curseur, 2C pour chaque image pour le contrôle de la qualité et pour vérifier si le filopodium reste bien visible tout au long du film.Pour générer la trace, cliquez d’abord sur le bouton 3A dans la fenêtre de l’interface graphique, pour ouvrir la fenêtre de l’interface graphique deux. Cliquez sur le bouton quatre dans la fenêtre deux de l’interface graphique, pour générer la masse du corps de cellule superposé qui a été générée dans la fenêtre 1 de l’interface graphique, après avoir cliqué sur 1A. Nous vous recommandons de consacrer un peu de temps à l’optimisation de paramètres tels que le nombre de segments, la largeur de balayage et le rayon de balayage de votre ensemble de données expérimentales.Déplacez le curseur dans la fenêtre numéro deux pour vérifier où l’extrémité du filopodial apparaît pour la première fois. Ensuite, cliquez sur le bouton cinq et le curseur apparaîtra. Utilisez le curseur pour sélectionner la base à partir de laquelle la distance de l’extrémité du filopodial est mesurée.Suivi de l’extrémité de la filopode dans le cadre où elle apparaît pour la première fois. Ensuite, sélectionnez la longueur seuil au-dessus de laquelle le filopodia se pliera, à l’aide de 6C. Ensuite, spécifiez le nombre de segments utilisés pour approximer la forme des filopodes dans la case 6A.Spécifiez la largeur de balayage, qui agit comme un scanner horizontal, pour placer les nœuds dans 6B. Spécifiez le rayon de balayage dans la zone 6D, utilisez une valeur supérieure d’environ 50 % au déplacement observé entre les pointes d’image. Spécifiez ensuite l’angle de pliage dans la case 6E.Cochez la trace de l’historique de la boîte dans la deuxième fenêtre de l’interface graphique, pour enregistrer l’ensemble du protocole de suivi pour référence future, puis cliquez sur le bouton suivre et analyser pour commencer le suivi. Pour l’analyse spatio-temporelle, sélectionnez la case représentée par 8B, suivie du canal protéique d’intérêt. Cliquez sur 8A, pour lancer le suivi des protéines le long de la longueur filopodiale, en utilisant la trace précédemment générée.Pour l’analyse ratiométrique des protéines, cochez la case 9B ou 9C et cliquez sur le bouton 9A pour obtenir le tracé ratiométrique spatio-temporel. Pour effectuer l’analyse de l’extrémité filopodiale, cochez la case 8F et spécifiez la longueur de l’extrémité et la longueur du seuil à partir de la base, à l’aide de 8G et 8H. Cliquez sur le bouton-poussoir pour enregistrer les données dans un fichier Excel nommé dynamics.xlsx.Ensuite, cliquez sur analyser les intensités protéiques pour générer la trace des intensités protéiques de l’extrémité filopodiale et pour l’enregistrer pour l’analyse ratiométrique. Cliquez sur le rapport souhaité à analyser, à l’aide de 9D ou 9E. Enfin, cliquez sur le bouton de comparaison, 9A pour générer les données ratiométriques.L’analyse des cellules COS transvectées avec un marqueur d’actine filamenteuse en rouge, et une référence cytosolique en vert révèlent des protubérances filopodiales riches en actine. Une série chronologique montre que les protubérances filopodiales riches en actine s’étendent et se rétractent rapidement. À l’aide du logiciel d’analyse d’images, les filopodes individuels ont été tracés.Les logiciels d’analyse d’images suivent de manière fiable l’extension des filopodes, en plus des taux de croissance et de rétraction d’un filopodie individuel, les chimigraphies décrivent également la concentration d’actine normalisée à la référence cytosolique. Si elle est utilisée correctement, cette technique permet une analyse quantitative de la dynamique de protrusion et de la concentration en protéines résolue dans l’espace le long des filopodes. Lors de la tentative de la procédure, il est important de se rappeler la vitesse d’acquisition et de maintenir le rapport signal/bruit supérieur à quatre, sans saturer les images individuelles.

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Visualiser les interactions protéine-ADN dans des cellules bactériennes vivantes en utilisant photoactivés suivi unique molécule

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Suivi des particules sensibles à la masse pour caractériser la dynamique des macromolécules associées à la membrane

Cet article fournit une description détaillée de la création d’échantillons pour le suivi d’une seule protéine dans les bicouches lipidiques soutenues par des solides. Il explique aussi un microscope à fluorescence simple avec une sensibilité à une seule molécule et un taux d’images rapide. Enfin, nous exposons la procédure d’extraction des trajectoires à une seule protéine.

Suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence

Découvrez une méthode d'analyse d'images semi-automatisée pour quantifier la dynamique des protrusions filopodiales et la concentration protéique en cellules vivantes. Cette approche permet une évaluation spatiale précise des protéines impliquées dans l'extension et la rétraction cellulaire.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques (Vidéo) | JoVE Journal

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

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