Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

L’objectif global de ce logiciel d’analyse d’images est l’analyse parallèle de la dynamique de protrusion et de la concentration relative en protéines sur toute la longueur du filopodial. Cette méthode peut vraiment nous aider à comprendre des questions clés en biologie cellulaire, en particulier les protéines individuelles impliquées dans l’extension et la rétraction des filopodes. Le principal avantage de la technique est que l’algorithme de suivi de forme adaptatif fourni permet une évaluation quantitative de la dynamique de la saillie et la localisation des protéines résolue dans l’espace.

Pour commencer, cultivez des neurones, des cellules HeLa ou COS, dans un milieu supplémenté comme détaillé dans le protocole de texte. Une fois que la confluence de 40 % est atteinte, transvectez les cellules avec les constructions de votre choix, à l’aide d’un réactif de transvection selon les instructions du fabricant. Conservez les cellules transvectées dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 15 à 18 heures.

Après l’incubation, remplissez les chambres de culture cellulaire jusqu’à 90 % avec un milieu préchauffé à 37 degrés Celsius, contenant 20 milli molaires HEPES, afin de réduire les changements de pH et d’osmolarité dus à l’évaporation lors de l’acquisition de l’image. Pour sceller le couvercle, appliquez une fine couche de graisse sous vide à l’intérieur du couvercle et appuyez doucement sur la chambre de culture contenant les cellules transvectionnées. La partie la plus importante pour l’analyse d’image est peut-être la qualité de l’image.

Une chose dont nous devons faire attention est le rapport signal/bruit, qui doit être supérieur à quatre et nous pouvons nous assurer qu’en ajustant le temps d’exposition de la caméra et l’intensité et la force du laser, la fréquence d’images doit être supérieure à un hertz. Acquérez les images à l’aide d’un microscope avec un objectif 60x ou 100x et sans flexion des pixels. Utilisez des taux d’acquisition d’au moins un hertz pour suivre la dynamique des filopodes.

Pour minimiser les artefacts flous, imagez le filopodial près de la membrane du basilic. Pour assurer un suivi fluide, ajustez le temps d’exposition de la caméra et l’intensité du laser de sorte que le rapport signal/bruit soit supérieur à quatre. Une fois cette opération terminée, lancez l’acquisition de l’image.

Après le prétraitement de l’image, comme décrit dans le protocole texte, chargez les images en téléchargeant le dossier compressé contenant tous les fichiers requis pour l’analyse d’image. Décompressez et copiez les fichiers dans le dossier de travail. Une fois installé, démarrez l’interface utilisateur graphique en ouvrant le fichier nommé filopodiaAnalysisM3.fig.

Chargez les fichiers TIFF de pile enregistrés pour les protéines individuelles dans l’interface utilisateur graphique ou l’interface graphique. À l’aide des boutons 1B pour la protéine A, 1C pour la protéine B et éventuellement, 1D pour la protéine C.Créez une image superposée de la cellule à partir des canaux protéiques en cliquant sur 1A. Ensuite, cliquez sur 2A, pour attribuer la première image et cliquez sur 2B, pour attribuer la dernière image à l’analyse.

Si vous le souhaitez, recadrez la région d’intérêt ou le ROI, contenant le filopodium d’intérêt à l’aide du bouton 2H. Faites pivoter l’image à l’aide du bouton 2I ou supprimez les régions indésirables à l’aide de l’outil de dessin à main levée, 2J. Déplacez le curseur, 2C pour chaque image pour le contrôle de la qualité et pour vérifier si le filopodium reste bien visible tout au long du film.

Pour générer la trace, cliquez d’abord sur le bouton 3A dans la fenêtre de l’interface graphique, pour ouvrir la fenêtre de l’interface graphique deux. Cliquez sur le bouton quatre dans la fenêtre deux de l’interface graphique, pour générer la masse du corps de cellule superposé qui a été générée dans la fenêtre 1 de l’interface graphique, après avoir cliqué sur 1A. Nous vous recommandons de consacrer un peu de temps à l’optimisation de paramètres tels que le nombre de segments, la largeur de balayage et le rayon de balayage de votre ensemble de données expérimentales.

Déplacez le curseur dans la fenêtre numéro deux pour vérifier où l’extrémité du filopodial apparaît pour la première fois. Ensuite, cliquez sur le bouton cinq et le curseur apparaîtra. Utilisez le curseur pour sélectionner la base à partir de laquelle la distance de l’extrémité du filopodial est mesurée.

Suivi de l’extrémité de la filopode dans le cadre où elle apparaît pour la première fois. Ensuite, sélectionnez la longueur seuil au-dessus de laquelle le filopodia se pliera, à l’aide de 6C. Ensuite, spécifiez le nombre de segments utilisés pour approximer la forme des filopodes dans la case 6A.

Spécifiez la largeur de balayage, qui agit comme un scanner horizontal, pour placer les nœuds dans 6B. Spécifiez le rayon de balayage dans la zone 6D, utilisez une valeur supérieure d’environ 50 % au déplacement observé entre les pointes d’image. Spécifiez ensuite l’angle de pliage dans la case 6E.

Cochez la trace de l’historique de la boîte dans la deuxième fenêtre de l’interface graphique, pour enregistrer l’ensemble du protocole de suivi pour référence future, puis cliquez sur le bouton suivre et analyser pour commencer le suivi. Pour l’analyse spatio-temporelle, sélectionnez la case représentée par 8B, suivie du canal protéique d’intérêt. Cliquez sur 8A, pour lancer le suivi des protéines le long de la longueur filopodiale, en utilisant la trace précédemment générée.

Pour l’analyse ratiométrique des protéines, cochez la case 9B ou 9C et cliquez sur le bouton 9A pour obtenir le tracé ratiométrique spatio-temporel. Pour effectuer l’analyse de l’extrémité filopodiale, cochez la case 8F et spécifiez la longueur de l’extrémité et la longueur du seuil à partir de la base, à l’aide de 8G et 8H. Cliquez sur le bouton-poussoir pour enregistrer les données dans un fichier Excel nommé dynamics.xlsx.

Ensuite, cliquez sur analyser les intensités protéiques pour générer la trace des intensités protéiques de l’extrémité filopodiale et pour l’enregistrer pour l’analyse ratiométrique. Cliquez sur le rapport souhaité à analyser, à l’aide de 9D ou 9E. Enfin, cliquez sur le bouton de comparaison, 9A pour générer les données ratiométriques.

L’analyse des cellules COS transvectées avec un marqueur d’actine filamenteuse en rouge, et une référence cytosolique en vert révèlent des protubérances filopodiales riches en actine. Une série chronologique montre que les protubérances filopodiales riches en actine s’étendent et se rétractent rapidement. À l’aide du logiciel d’analyse d’images, les filopodes individuels ont été tracés.

Les logiciels d’analyse d’images suivent de manière fiable l’extension des filopodes, en plus des taux de croissance et de rétraction d’un filopodie individuel, les chimigraphies décrivent également la concentration d’actine normalisée à la référence cytosolique. Si elle est utilisée correctement, cette technique permet une analyse quantitative de la dynamique de protrusion et de la concentration en protéines résolue dans l’espace le long des filopodes. Lors de la tentative de la procédure, il est important de se rappeler la vitesse d’acquisition et de maintenir le rapport signal/bruit supérieur à quatre, sans saturer les images individuelles.