Name: Suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez le suivi de protéines individuelles dans les bicouches lipidiques par microscopie à fluorescence. Cette méthode révèle les états cachés des protéines membranaires et leurs dynamiques thermodynamiques.

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<table><tbody><tr><td>Plaque d’onde 1/4</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-633</td><td>Assurez-vous d’aligner le laser</td></tr><tr><td>Objectif 100X Oil</td><td>Olympe</td><td>12-563-659</td><td>1,45 N/D apochromatique</td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>Lipides polaires avanti</td><td>850457</td><td>Phospholipides POPC</td></tr><tr><td>18:0 PEG2000 PE</td><td>Lipides polaires avanti</td><td>880210</td><td>Sel d’ammonium</td></tr><tr><td>Objectif 300mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Laser He :Ne 633 nm</td><td>Melles Griot</td><td>05-LHP-927</td><td>Peut être modifié vers d’autres sources et vers d’autres longueurs d’onde</td></tr><tr><td>Filtre passe-bande 633 nm</td><td>Chroma Tech</td><td>633/10X</td><td>Correspondance au laser utilisé</td></tr><tr><td>Filtre passe-long 655 nm</td><td>Chroma Tech</td><td>ET655lp</td><td>Modifier pour correspondre aux longueurs d’onde du colorant/laser</td></tr><tr><td>Andor Solis I</td><td>Andor&nbsp ;</td><td>Andor Solis I</td><td>Logiciels pour la capture d’images</td></tr><tr><td>ATTO 655&nbsp ;</td><td>ATTO-TEC</td><td>655 ap. J.-C.</td><td>Modification NHS-Ester, tout colorant adapté à un travail sur une seule molécule peut être utilisé. ATTO est recommandé mais Cy5/7 peut être utilisé</td></tr><tr><td>Biobilles SM-2 Résine</td><td>BioRad</td><td>1523922</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155-50MG</td><td>du foie bovin, de la soltion aqueuse et de GE ; 30 000 unités/mg</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>C547-1</td><td>HPLC ou de qualité spectroscopique</td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Couvertures</td><td>ESCO Optique</td><td>R525000</td><td>Quartz 25 mm</td></tr><tr><td>Séparateur de faisceau dichroïque</td><td>Semrock</td><td>FF545/650-Di01-25x36</td><td>Modifier pour correspondre aux longueurs d’onde du colorant/laser</td></tr><tr><td>Caméra EMCCD</td><td>Andor&nbsp ;</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes 15 mL & nbsp ;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Tubes de culture cellulaire Cellestar</td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133-50KU</td><td>de Aspergillus niger, typer VII, &ge ; 100 000 unités/g de solide (sans oxygène ajouté)</td></tr><tr><td>Pistolet à air chaud</td><td>Fret portuaire</td><td>56434</td><td>Utilisé pour le chauffage du parafilm, en général n’importe quel pistolet à air chaud pouvait être utilisé</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioréactifs de Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion à faible autofluorescence</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-30</td><td></td></tr><tr><td>Methonal</td><td>Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>A452-1</td><td>HPLC ou de qualité spectroscopique</td></tr><tr><td>Tube microcentrifugeuse</td><td>VMR</td><td>525-1126</td><td>1,5 mL&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micro-Pipetters</td><td>Ependorf</td><td></td><td>Divers ; 1000 & micro ; L, 100 & micro ; L et 10 & micro ; L sont suggérés</td></tr><tr><td>& Oslash ; Tubes d’objectif 1,5"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1.5L10</td><td>Le filetage externe est raclé pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Table optique</td><td>Newport</td><td>Dépendance RPR</td><td>La taille de la table dépend de l’espace disponible</td></tr><tr><td>Tissus optiques</td><td>Thorlabs</td><td>MC-50E</td><td>Nettoyage de divers composants</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7669</td><td>Vérifiez que rien ne présente de gaz fluorescents pendant le processus</td></tr><tr><td>Actionneur piézoélectrique</td><td>Newport</td><td>PZA12</td><td></td></tr><tr><td>Isolateurs pneumatiques de vibrations</td><td>Newport</td><td>Série I-2000</td><td>utilisé pour stabiliser la table optique en cas d’irrégularité &nbsp ;</td></tr><tr><td>Bain réfrigéré</td><td>Fisher Scientific & nbsp ;</td><td>Isotemp 3016</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur d’obturateur</td><td>Thorlabs</td><td>SC10</td><td>Lien avec le logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Millipore Sigma</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Steritop</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Pilote et contrôleur de boîte à interrupteurs &nbsp ;</td><td>Newport</td><td>PZC200</td><td>Contrôleur de scène</td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>J.T. Baker</td><td>SF01-98</td><td>PES 25mm 0.2 & micro ; M</td></tr><tr><td>Élément TEC</td><td>Thorlabs</td><td>TEC3-2.5</td><td>Utilisé pour connecter la pompe à chaleur Peltirer au porte-échantillon et au collier objectif</td></tr><tr><td>Régulateur de température</td><td>Ingénierie de Meerstetter</td><td>TEC-1091</td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de température</td><td>Thorlabs</td><td>TH100PT</td><td></td></tr><tr><td>Thermistor</td><td>Thorlabs</td><td>TH10K</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseur à tubes</td><td>G Biosciences</td><td>786-611</td><td>MWCO 4K</td></tr><tr><td>Nettoyant UV à l’ozone</td><td>Novascan</td><td>PSDP_UV</td><td>Pro Series - Digital & nbsp ;</td></tr><tr><td>Zoom Optics&nbsp ;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1NR1</td><td></td></tr></tbody></table>

suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence

Tracking Single Proteins in Lipid Bilayers Using Fluorescence Microscopy

Suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence

Direct observation is a fundamental method for scientific discovery and understanding. Time-lapse single-molecule fluorescence imaging allows the ...

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour visualiser et suivre des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et ainsi analyser la mobilité latérale des récepteurs, la taille des complexes récepteurs, ainsi que pour visualiser les interactions transitoires récepteur-récepteur. Ce protocole peut être étendu à d’autres protéines membranaires.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

La distribution spatiale et la dynamique temporelle des protéines et des lipides de la membrane plasmique sont un sujet brûlant en biologie. Ici, cette question est abordée par une analyse de fluctuation d’image spatio-temporelle qui fournit conceptuellement les mêmes quantités physiques de suivi de particules uniques, mais elle utilise de petits marqueurs moléculaires et des configurations de microscopie standard.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

Nous présentons une méthode de préparation de mica soutenu bicouches lipidiques pour microscopie à haute résolution. Mica est transparent et plat à l'échelle atomique, mais rarement utilisé dans l'imagerie en raison des difficultés de manipulation; notre préparation résulte en un dépôt régulier de la feuille de mica, et de réduire la matière utilisée dans la préparation de bicouche.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

La préparation de bicouches lipidiques planes fonctionnalisées par du verre, la détermination de la mobilité des protéines à l’intérieur et la mesure des densités de protéines sont présentées ici. Une feuille de route pour la construction d’un microscope à réflexion interne totale à bruit réduit est esquissée, qui permet de visualiser des fluorochromes résidents d’une seule bicouche avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

Ici, nous présentons un protocole pour détecter un seul, les événements de fusion SNARE médiation entre liposomes et bicouches pris en charge dans des canaux microfluidiques utilisant TIRFM polarisée, avec une sensibilité et une seule molécule ~ 15 résolution temporelle msec. Lipid et la libération de la cargaison soluble peuvent être détectés simultanément. la taille des liposomes, des lipides diffusivité et la fusion des pores propriétés sont mesurées.

Fusion SNARE-médiée de Single protéoliposomes avec bicouches supportées Tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par Polarized FRBR Microscopie

Nous présentons ici un protocole pour une seule particule suivi d’analyse d’images qui permet une évaluation quantitative des coefficients de diffusion, types de tailles de motion et cluster de simples particules détectées par microscopie à fluorescence.

Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence

La microscopie de localisation simple molécule 3D est utilisée pour sonder les positions spatiales et les trajectoires de mouvement des protéines étiquetées fluorescentes dans les cellules bactériennes vivantes. Le protocole expérimental et d'analyse de données décrit ci-dessus détermine les comportements diffusifs répandus des protéines cytosoliques basées sur des trajectoires monomolécules mises en commun.

Microscopie de suivi à molécule unique - Outil pour déterminer les états diffusifs des molécules cytosoliques

Ce protocole décrit une approche de traitement d’image et de suivi d’une seule particule basée sur iSCAT qui permet d’étudier simultanément la masse moléculaire et le comportement diffusif des macromolécules interagissant avec les membranes lipidiques. Des instructions étape par étape pour la préparation des échantillons, la conversion masse-contraste, l’acquisition de films et le post-traitement sont fournies ainsi que des instructions pour éviter les pièges potentiels.

Suivi des particules sensibles à la masse pour caractériser la dynamique des macromolécules associées à la membrane

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie TIRF pour suivre les canaux ioniques individuels et déterminer leur activité dans les membranes lipidiques soutenues, définissant ainsi l’interaction entre le mouvement de la membrane latérale et la fonction des canaux. Il décrit comment préparer les membranes, enregistrer les données et analyser les résultats.

Imagerie à molécule unique de la mobilité latérale et de l’activité des canaux ioniques dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Découvrez le suivi de protéines individuelles dans les bicouches lipidiques par microscopie à fluorescence. Cette méthode révèle les états cachés des protéines membranaires et leurs dynamiques thermodynamiques.

Suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence

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