Suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence

Les protéines opèrent dans un espace d’états complexe et une grande partie de celui-ci est cachée. Nous utilisons l’imagerie par molécule unique pour révéler ces états. Lors du suivi de protéines membranaires simples dans une bicouche lipidique, les principaux défis sont la préparation de l’échantillon, le photoblanchiment et la résolution temporelle.

Pour commencer, retirez les solutions de tige lipidique du congélateur et laissez-les atteindre la température ambiante. Sortez une fiole propre de 10 millilitres du four et laissez-la refroidir à température ambiante. Ajoutez 900 microlitres de chloroforme de qualité spectroscopique et 100 microlitres de méthanol de qualité spectroscopique dans la fiole à fond arrondi refroidi.

Ensuite, ajoutez la quantité appropriée de chaque lipide à la fiole et faites tourner pour bien mélanger. Placez maintenant un connecteur de distillation sous vide sur le dessus de la fiole ronde inférieure et fixez-la à la conduite de séchage à l’azote. Ensuite, allumez l’azote et ajustez la pression jusqu’à ce que le flux soit à peine ressenti sur le dos de la main.

Pipeter un millilitre de tampon pour chaque cinq micromoles de lipide total dans la fiole à fond rond. Placez un bouchon en verre sur la fiole et scellez-la avec un film de paraffine. Positionnez la fiole et une pince sur un support à anneaux et plongez son bas dans un bain sonique à 60 degrés Celsius.

Confirmez que la solution devient opaque et qu’aucun lipide ne reste attaché à la paroi interne de la fiole. Après l’incubation d’une heure, allumez le sonater et réglez l’amplitude à son niveau maximal. Déplacez la fiole dans le bain pour localiser l’endroit le plus agité où la solution bouscule et gicle visiblement à l’intérieur de la flasque.

Sonicez la solution pendant 30 minutes. Observation de la transition de l’opaque à la transparence et légèrement opalescente. Retirez la solution lipidique de la fiole et transférez-la dans un tube microcentrifugeuse.

Centrifugez le tube à 100 000 G pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirez et transférez le surnageant dans un nouveau tube centrifugeuse. Placez le couvercle de quartz de 25 millimètres dans un bécher et ajoutez des volumes égaux d’eau nanopure, 30 % de peroxyde d’hydrogène et acide nitrique concentré.

Chauffez le couvercle glisse dans la solution préparée pendant 30 minutes jusqu’à ce que la bulle commence. Vérifiez la solution toutes les 10 minutes et faites doucement tourner pour éviter que les couvercles ne collent entre elles. Observez la housse glisser et se séparer pendant le tourbillon.

Une fois séparés, réduisez progressivement la vitesse de rotation pour maintenir leur séparation et laissez la solution bouillonnante recouvrir le couvercle de manière uniforme. Ensuite, rince la housse en profondeur avec de l’eau purifiée tout en faisant doucement tourner pour enlever tout résidu chimique. Sinon, nettoyez les engourdies de recouvrement en quartz à l’aide de n-hexane suivi de méthanol, en essuyant chaque solvant avec du papier de cristalline.

Placez les couvercles à l’intérieur d’un nettoyant UV à la couche d’ozone, la surface à traiter étant orientée vers la lampe. Laissez l’oxygène entrer dans la chambre à cinq livres par pouce carré pendant cinq minutes. Ensuite, coupez le flux d’oxygène.

Allumez maintenant les lumières ultraviolettes pendant 15 minutes, puis laissez reposer les couvercles pendant au moins 10 minutes pour permettre à l’ozone de se dissiper. Placez une gaine de couvercle fraîchement nettoyée dans un porte-échantillons de 25 millimètres. À l’aide d’un tube SM d’un quart de pouce à un seul objectif, découpez un joint de film par double couche de huit millimètres de diamètre et positionnez-le au centre du porte-échantillon.

Appliquez une gouttelette de 50 microlitres des petites vésicules unilamellaires au centre du joint de huit millimètres. Après avoir scellé la chambre, incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, utilisez une pipette pour rincer la solution.

Ajoutez 50 microlitres de tampon frais à la bicouche et répétez ce processus un total de 10 fois. Après le rinçage final, retirez le tampon du porte-échantillon. Ajoutez une aliquote de 50 microlitres de la protéine désirée dans un détergent, en veillant à ce que la concentration soit égale ou inférieure à la concentration critique de micella.

Incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure pour permettre l’incorporation des protéines, rincez l’échantillon avec un tampon pour éliminer toute protéine et détergent non incorporés. Réglez la vitesse verticale de décalage des pixels à environ 600 nanosecondes et augmentez la tension d’horloge verticale en mode overclock. Ensuite, configurez la lecture horizontale des pixels à sa vitesse maximale.

Ajustez le gain du préamplificateur à deux. Réglez la sortie de l’amplificateur pour la multiplication des électrons et réglez le gain du multiplicateur électronique à son niveau maximal. Ensuite, réglez le temps d’exposition à 25 millisecondes.

Confirmez que le taux d’images par seconde dépasse légèrement le temps d’exposition. Ajustez maintenant la puissance du laser jusqu’à ce que le signal se démarque clairement du bruit de fond. Collectez suffisamment de données d’imagerie pour obtenir un minimum de 1000 traces par échantillon.

Pour l’analyse de suivi, recadrez tous les ensembles de données à une taille cohérente et effectuez une correction de fond en utilisant Image J.In Fiji, glissez-déposer le fichier TIFF du film ou empilez dans l’interface. Pour entrer les détails de calibration des pixels, allez dans l’onglet analyser, sélectionnez définir l’échelle, et appliquez la calibration pixel à distance spécifique à l’instrument. Ensuite, sauvegardez une copie du jeu de données pour préserver l’original et suivre les modifications effectuées.

Soustrayez l’arrière-plan d’une région d’intérêt sélectionnée et appliquez-le à la copie sauvegardée des données originales. Allez dans l’onglet processus et choisissez soustraire arrière-plan. Dans l’onglet plugins, sélectionnez tracking, suivi de trackmate pour lancer la fenêtre de dialogue trackmate pour l’analyse de trackmate.

Le degré de marquage pour les quatre tétramères AQP a été calculé à 4,12 grâce à la spectrométrie UV-visible et l’analyse de distribution de Poisson a indiqué que 98 % des tétramères portaient au moins une molécule de colorant fluorescent. L’histogramme montre une large distribution des tailles de pas cohérente avec la diffusion de réseaux orthogonaux de particules de tailles différentes, et le coefficient de diffusion moyen calculé était de 0,0143 micromètre carré par seconde. Dans cette vidéo, nous avons identifié des états clés importants pour la régulation de l’aquaporine quatre et leurs forces thermodynamiques associées.

Ce protocole élimine la confusion dans la création de membranes biomimétiques avec des protéines transmembranaires purifiées, adaptées au suivi de molécules uniques en accéléré. Machines à protéines fonctionnant aux points d’inflexion : le suivi d’une seule protéine en accéléré permet l’observation directe des voies stochastiques, des branches et des impasses.