Mesure de la dynamique de la saillie du bord cellulaire pendant la propagation à l’aide de la microscopie à cellules vivantes

Il a été démontré que le test de saillie du bord cellulaire est directement corrélé à la migration cellulaire. Par conséquent, il peut être utilisé comme méthode préliminaire pour identifier les protéines critiques et les mécanismes de signalisation impliqués dans la motilité cellulaire. La méthode est rapide, simple, rentable et ne nécessite pas de marquage fluorescent ou d’utilisation d’un microscope fluorescent coûteux.

Michal Gendler, un étudiant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Ajouter deux millilitres d’une solution normale d’acide chlorhydrique au centre d’un plat à fond de verre et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez le plat trois fois avec deux millilitres de PBS.

Diluer la fibronectine à une concentration de 10 microgrammes par millilitre dans le PBS et ajouter 200 microlitres de la solution diluée à la boîte centrale en verre. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Préparez une solution 1% BSA et PBS et passez-la à travers un filtre de 0,2 micromètre.

Dénaturez la solution en incubant à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un bain-marie préchauffé. Lavez le plat de fond en verre enduit avec deux millilitres de PBS trois fois. Ajouter deux millilitres de solution de BSA dénaturée et incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Lavez le plat en verre avec deux millilitres de PBS trois fois. Avant 16 à 18 heures d’expérimentation à 0,7 million de cellules par plaque de culture tissulaire de 10 centimètres de diamètre pour atteindre une confluence de 70 à 80%. Le lendemain, ajoutez deux millilitres de solution de trypsine à la plaque de culture tissulaire et incubez pendant deux à trois minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent.

Ajouter cinq millilitres du milieu pour inactiver la trypsine. À l’aide d’un hémacytomètre, comptez les cellules et plaquez 20 000 cellules dans deux millilitres du milieu complet dans un plat inférieur. Ensuite, incubez le plat avec des cellules plaquées dans un incubateur pendant 15 minutes.

Allumez l’unité de chauffage et réglez-la à 37 degrés Celsius une heure avant l’imagerie. Allumez également l’unité de dioxyde de carbone et réglez-la à 5%10 minutes avant l’imagerie. Allumez le microscope et l’appareil photo.

Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel d’acquisition de microscope. Réglez le grossissement sur un contraste de phase de lentille sèche 40X. Définissez la durée totale du film sur 10 minutes avec un intervalle de temps de cinq secondes.

Après 15 minutes d’incubation, placez le plat à fond de verre avec les cellules adhérentes dans un adaptateur et fixez-le. Insérez l’adaptateur avec la parabole dans les fentes de l’étage du microscope. Retirez le couvercle de la vaisselle, placez le couvercle de dioxyde de carbone et ouvrez la valve de dioxyde de carbone.

Localisez une cellule appropriée pour l’imagerie. Commencez l’acquisition du film après vous être concentré sur la cellule. Pour effectuer l’analyse d’image, sélectionnez l’outil droit dans le logiciel d’analyse d’image et faites huit lignes de 20 unités arbitraires perpendiculaires aux protubérances dans un arrangement radial à tous les 45 degrés, y compris la lamelle et le bord de la cellule.

Dans la barre d’outils principale, allez à l’image, sélectionnez Piles, puis cliquez sur Retrancher pour générer une image kymographique décrivant le mouvement de points uniques dans la membrane cellulaire. À l’aide des images du kymographe, extrayez et comptez manuellement le nombre de protubérances, de rétractions et de volants dans chacune des huit régions de la cellule marquées par les lignes de la grille. Ces chiffres représentent la fréquence des protubérances, des rétractions et des volants par 10 minutes.

Déterminer la persistance de la saillie, la distance et la vitesse par analyse par kymographie. Pour déterminer la distance de saillie, tracez une ligne perpendiculaire de la base de la saillie jusqu’au sommet le plus élevé de la saillie. Appuyez sur M pour mesurer la longueur de la ligne en pixels et vous assurer que le rapport pixel/micromètre est connu pour convertir la longueur en micromètres.

La quantification des protubérances, des réactions et des volants a été effectuée manuellement toutes les 10 minutes et la fréquence moyenne obtenue pour les protubérances et les rétractions était de 5,1 et 2,1 pour les volants. Le kymographe représentatif avait une distance de saillie d’environ 4,8 micromètres et un temps de saillie d’environ 0,6 minute. Un exemple de cellule qui doit être exclue de l’analyse est représenté.

L’analyse par kymographie a révélé que la cellule n’était pas présente dans sa phase d’étalement et ne présentait aucune saillie membranaire claire. Le plus important est de choisir les bonnes cellules pour l’imagerie. Une cellule appropriée doit être dans sa phase de propagation et ne doit pas toucher d’autres cellules pour éviter la communication et la signalisation cellule-cellule.

La méthode peut être utilisée comme outil préliminaire pour tester la dynamique du cytosquelette impliquant la motilité cellulaire avant de décider d’effectuer plus de résultats exigeant des tests de migration cellulaire.