Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF

L’objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier la dynamique des fosses individuelles enrobées de clathrine dans des cellules vivantes. Ceci est accompli en transectant d’abord des protéines endocytaires et cargo marquées par fluorescence dans une lignée cellulaire d’adhérence. L’étape suivante consiste à imager les cellules par réflexion interne totale, en fluorescence ou en microscopie sur gazon.

La durée de vie de petits ensembles de fosses recouvertes de clathrine est ensuite quantifiée manuellement à l’aide d’un programme de traitement et d’analyse d’images. La dernière étape consiste à quantifier la durée de vie des fosses revêtues de clathrine par une détection et une analyse automatisées objectives. En fin de compte, la microscopie du gazon est utilisée pour quantifier la dynamique des fosses individuelles recouvertes de clathrine à une résolution d’événement unique afin d’étudier l’endocytose médiée par la clathrine des récepteurs couplés aux protéines G.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du trafic membranaire, telles que la façon dont l’assemblage et la dynamique de l’endocytose peuvent changer en fonction des différentes protéines endocytaires et protéines cargo présentes. Pour commencer, transfectez HEC 2 93 cellules avec des plasmides codant pour des récepteurs couplés aux protéines G, ou RCPG, et/ou des composants de la machinerie Claro. Dans une plaque à 12 puits, comme détaillé dans le protocole de texte, le lendemain de la transfection, ajoutez 0,5 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS avec un millimolaire d’EDTA à chacun.

Ensuite, placez trois ronds stériles de 25 millimètres dans des puits séparés d’un six. Remplissez chaque puits avec deux millilitres de média. Poussez doucement la lamelle vers le bas du puits pour empêcher les cellules de se développer sur la face inférieure de la lamelle.

Ensuite, agitez manuellement un puits de la plaque à 12 puits pour soulever les cellules du fond du puits. Ajoutez un millilitre de DM EM avec 10 % FBS à renvoyer. Ensuite, répartissez uniformément les cellules soulevées d’un puits entre les trois lamelles.

Laissez les cellules se développer sur les lamelles pendant au moins 48 heures avant l’imagerie. Assurez-vous également que les cellules sont étalées et plates pour l’imagerie de la dynamique de la fosse et de la cargaison recouvertes de clathrine. Tout d’abord, pré-incubez les cellules avec des anticorps comme décrit dans le protocole de texte.

Ensuite, préparez-vous à transférer la lamelle dans une chambre d’imagerie de cellules vivantes à l’aide d’une paire de pinces et d’une aiguille de calibre 25 pliée à la pointe en un crochet. Tenez la paire de pinces dans la main dominante. Tenez l’aiguille pliée dans l’autre.

Tournez l’aiguille jusqu’à ce que le crochet se courbe vers le bas vers le verre. Faites glisser doucement le crochet de l’aiguille vers le bas sur le fond d’une plaque à six puits jusqu’à ce qu’il s’accroche à la lamelle. Veillez à ne pas rayer la surface de la lamelle car cela détacherait les cellules.

Soulevez doucement le couvercle du fond du puits. Équilibrez la lamelle de recouvrement contre la paroi du puits pour le soutenir. À l’aide de la pince, saisissez près du bord de la lamelle et déplacez la lamelle vers le haut jusqu’à la chambre d’imagerie.

Assemblez la chambre et ajoutez 700 microlitres de support d’imagerie préchauffé. Après avoir transféré la chambre sur le microscope, faites la mise au point à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile de gazon, imagez les cellules en mode d’éclairage épi, de fluorescence ou confocal conventionnel pour identifier les cellules exprimant les constructions appropriées par mesure de précaution de sécurité importante. Soyez toujours conscient de l’angle du faisceau laser et dirigez-le toujours loin de l’observateur.

Ensuite, concentrez-vous sur la surface inférieure d’une cellule exprimant jusqu’à ce que le contour de la membrane plasmique autour de la cellule disparaisse et que la surface inférieure de la cellule apparaisse. Cela est le plus apparent avec une protéine cargo localisée par membrane plasmique telle que le récepteur opioïde mu. Si vous utilisez les mêmes lasers pour l’imagerie en épifluorescence conventionnelle, augmentez l’angle d’incidence du laser jusqu’à ce qu’il soit hors foyer.

La fluorescence à l’intérieur de la cellule disparaît et aucun contour de membrane plasmique autour de la cellule n’est visible. Une fois dans le gazon m, assurez-vous que le laser d’excitation se réfléchit à travers l’objectif et n’est pas visible au-dessus de l’objectif. En vérifiant si le point laser est visible, affinez la mise au point pour obtenir une image nette.

Une fois les cellules identifiées, acquérez des images au moins toutes les trois secondes pendant 10 minutes. Répétez toutes les étapes pour imager des cellules supplémentaires. Pour commencer l’analyse de la dynamique endocytaire, ouvrez le fichier dans l’image J.Les images sont stockées sous la forme d’une seule pile de fichiers TIFF.

Avec canaux intercalaires. Convertissez les images en hyper-piles en sélectionnant les hyper-piles d’images et Empiler en hyper-pile dans la fenêtre contextuelle. Entrez le nombre de chaînes acquises.

Saisissez-en une pour Zack et entrez le nombre d’images de la vidéo. Le format hyper stack génère une fenêtre avec deux barres de défilement. Utilisez la barre supérieure pour vous déplacer dans les canaux et la barre inférieure pour vous déplacer dans le temps.

Faites défiler jusqu’au canal de la protéine dont la durée de vie sera dosée. Allez au-delà de la première image du film pour réduire l’inclusion de piqûres ou de CCP préexistants recouverts de clathrine dont les durées entières ne sont pas visibles. Dessinez une région d’intérêt ou un ROI autour d’un endroit choisi au hasard.

Comptez le nombre d’images qu’un spot est visible. Pour commencer l’analyse avec la reconnaissance d’objets, ouvrez le fichier d’image brute dans le logiciel d’analyse d’images par défaut qui a émergé. Une image couleur apparaît.

Utilisez la fenêtre de réglage de l’affichage pour régler la luminosité d’une chaîne. Cliquez sur le nom d’une chaîne pour changer la couleur affichée. Décochez la case à côté de la chaîne pour empêcher son affichage.

Créez des taches en cliquant sur l’icône avec des taches orange. Sélectionnez une zone d’intérêt autour de la cellule à l’aide de celle-ci pour exclure les zones qui détecteront de manière incorrecte les bords d’attaque et les plaques brillants. Mesurez le diamètre d’une tache pour fournir des estimations initiales à l’algorithme.

Passez en mode tranche et cliquez sur les extrémités polaires d’un point pour mesurer son diamètre. Faites cela pour quatre ou cinq taches rondes qui semblent indiquer un CCP à la hauteur de sa stabilité après sa formation avant cession, utilisez ces mesures pour calculer le diamètre moyen jusqu’au 10e de micron le plus proche. Pour détecter les taches qui reviennent en mode de dépassement, sélectionnez le canal approprié pour la détection.

Entrez le diamètre moyen mesuré, généralement 0,3 ou 0,4 micron. Cliquez sur la flèche bleue vers l’avant pour quantifier les taches. Filtrez les spots par qualité en ajustant le filtre pour capturer autant de spots que possible sans arrière-plan.

Le filtre de qualité est sélectionné par défaut. Utilisez la courbe de qualité comme guide pour définir un seuil approprié. Déplacez le seuil inférieur du filtre avec le bouton gauche de la souris jusqu’à ce premier creux de la courbe.

C’est un bon point de départ pour le filtre. Comme cette position affine généralement la détection aux seuls points visibles. Supprimer les taches d’arant dans le point d’édition Écran passer en mode de sélection et cliquer sur le point Une fois qu’il devient jaune, cliquez sur supprimer.

Cliquez ensuite sur la flèche bleue pour continuer à construire l’algorithme. Mesurez les pistes en les mettant en mouvement pour brownie. Le CCP ne doit présenter aucun mouvement dirigé, seulement une dérive minimale à travers la membrane plasmique.

Cet algorithme est le plus approprié pour ce mouvement. Ensuite, réglez la distance maximale sur une petite valeur telle que 0,7 micron. Le réglage d’une petite distance minimise la connexion des points adjacents et permet toujours le suivi continu d’un point cellulaire par CCP ou mouvement de cellule.

Réglez ensuite la taille maximale de l’écart sur un. Cela permet à la piste de continuer s’il ne manque qu’une image. Dans des espaces successifs de plus de trois, différentes pistes sont mal reliées entre elles.

L’étape suivante consiste à basculer l’affichage des pistes en queue de dragon. Faites défiler la vidéo en observant la qualité de détection. Si des points adjacents sont connectés, diminuez la distance maximale en dessous de 0,7 micron.

Si les taches sont brisées trop facilement, augmentez la taille maximale de l’espace. Cliquez sur la flèche bleue pour créer des pistes. Cela conduit à l’écran de filtrage des pistes pour filtrer les pistes.

Utilisez un filtre d’intensité pour supprimer les plaques lumineuses supplémentaires. Utilisez ensuite un filtre de déplacement pour éliminer les endosomes qui pénètrent dans le terrain en gazon. Soyez prudent car les taches plus longues auront également un déplacement plus long.

Cliquez sur la double flèche verte pour terminer le protocole. Pour exporter des données, rendez-vous dans l’onglet statistiques. Cliquez sur l’icône de la disquette pour exporter la statistique sélectionnée.

Cliquez sur l’icône qui ressemble à une série de disquettes pour exporter toutes les statistiques. En se concentrant sur la membrane plasmique adhérente A et le mode confocal, on découvre une cellule remplie d’une faible fluorescence. En revanche, en se concentrant sur le centre de la cellule, la membrane plasmique se présente sous la forme d’un anneau de fluorescence autour de la cellule.

La fluorescence hors foyer devient apparente lors du passage à l’épi conventionnel, à la fluorescence ou au gazon avec un angle incorrect. Lorsque l’angle du gazon est correct, la membrane plasmique est très nette, claire et brillante, et floue. La fluorescence ne perturbe plus l’image.

Lorsque la bêta-arrestine se trouve dans un bassin cytosolique, il y en a très peu dans le champ de gazon et il semble flou et focalisé vers l’extérieur. Une fois que le MOR est activé par l’agoniste, la bêta, l’arrestine est recrutée dans la membrane plasmique et la bêta-arrestine et le récepteur se redistribuent aux CCP. La durée de vie de ces clusters est quantifiée manuellement.

En utilisant les trois paramètres de l’endocytose terminée, les taches qui dénotent des CCP peuvent disparaître complètement, cligner des yeux ou pincer une structure plus grande. Montré ici, un CCP détecté à l’aide d’une MAs Après filtrage pour éliminer les structures de plaque non dynamiques, les sphères blanches superposées indiquent les points détectés, les points plus faibles qui n’ont pas pu être détectés pendant toute leur durée de vie ont également été exclus avec le filtre de qualité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon de visualiser des fosses codées par cathéter individuel à l’aide de la microscopie sur gazon.