Visualiser les interactions protéine-ADN dans des cellules bactériennes vivantes en utilisant photoactivés suivi unique molécule

L'objectif général de cette procédure est de visualiser directement et de quantifier l'activité des protéines de liaison à l'ADN dans des cellules bactériennes vivantes. Cela est réalisé en observant des cellules exprimant une protéine fluorescente photoactivable fusionnée à une protéine de liaison à l'ADN d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à acquérir un film montrant des protéines individuelles qui sont photoactivées pendant leur observation.

Ensuite, les données sont analysées afin de déterminer la localisation des protéines et de suivre les protéines à l'intérieur de cellules individuelles. Les interactions avec l'ADN sont identifiées par un changement du coefficient de diffusion des protéines uniques lorsqu'elles entrent en contact avec les chromosomes. En définitive, les résultats peuvent fournir une mesure quantitative des interactions protéine-ADN au niveau de la cellule unique, en comptant le nombre de protéines liées et diffusantes par cellule.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réparation de l'ADN, telles que les taux de réparation in vivo et la distribution spatiale des sites de réparation. Nous allons maintenant démontrer la méthode en mesurant l'activité de réparation de la polymérase ADN une dans des cellules vivantes d’e coli. Préparez d'abord des lamelles dépourvues de particules fluorescentes de fond en les chauffant dans un four à 500 degrés Celsius pendant une heure. Brûlez un stock de lamelles d'épaisseur numéro 1,5 et conservez-les à température ambiante dans du papier d'aluminium.

Ils restent bons pendant plusieurs semaines. Ensuite, concentrer un millilitre de phase exponentielle précoce d’E. coli de la souche AB1157 poly A PA mCherry dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Centrifuger les cellules à 2 300 g pendant cinq minutes.

Éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 20 microlitres de milieu résiduel, puis vortexer les cellules pour les mettre en solution. Ensuite, préparer une solution d'agarose à 1,5 % à faible fluorescence dans de l'eau distillée. Mélanger 500 microlitres d'agarose fondue avec 500 microlitres de milieu minimal 2 x en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas pour les expériences de dommages de l'ADN utilisant le méthyl méthanesulfonate ou MMS, en prenant les précautions nécessaires.

Ajouter 8,3 microlitres de MMS aux 500 microlitres de milieu minimal avant de mélanger avec les aros avant que le mélange ne refroidisse. Étaler sur un lamelle chauffée. Répartir uniformément et de manière centrée sans former de bulles.

Aplatir le tampon avec une deuxième lame couvre-objet calcinée. Une fois refroidi, retirer la couverture supérieure du tampon et ajouter un microlitre de suspension cellulaire concentrée. Immobiliser les cellules en recouvrant le tampon avec une nouvelle lame couvre-objet calcinée et en appuyant très doucement vers le bas.

Les cellules doivent être observées en microscopie dans les 45 minutes précédant leur dessèchement. Pour prolonger ce délai, le tampon peut être scellé à l'intérieur d'un joint en silicone pour les expériences de dommages de l'ADN. Avant l'observation, incubez les cellules sur le tampon pendant 20 minutes.

Dans un contenant humidifié à température ambiante, le microscope est équipé d'un laser d'activation photo à 405 nanomètres et d'un laser d'excitation à 561 nanomètres. La sensibilité au niveau de la molécule unique est obtenue en excitant uniquement les fluorophores situés dans une fine section au-dessus de la surface du coverslip, à l'aide d'une illumination fortement inclinée ; l'émission de fluorescence est enregistrée sur une caméra CCD à multiplication électronique. Placez l'échantillon sur la platine du microscope et mettez les cellules au point.

Sous éclairage en lumière transmise, définissez un champ de vision recadré afin de réduire la taille des données et d'augmenter la vitesse de lecture de la caméra. Protégez l'échantillon de la lumière ambiante et activez le gain de la caméra CCD à multiplication électronique pour la détection unique de fluoro four. Réglez la fréquence d'images à 15,26 millisecondes par image.

Cela inclut le temps de lecture de la caméra de 0,26 milliseconde. Les temps d'exposition doivent être suffisamment courts pour observer des points fluorescents nets avec peu de flou de mouvement. D'autre part, les trajectoires doivent être échantillonnées à des intervalles de temps suffisamment longs pour distinguer clairement les molécules liées des molécules en diffusion. Affichez maintenant les données de la caméra pour vérifier le signal du fond noir.

Activez le laser de 561 nanomètres et vérifiez le signal de fond d'excitation. Activez le laser de 405 nanomètres pour la photoactivation des protéines de fusion Paul one PA mCherry et augmentez l'intensité jusqu'à l'apparition de points fluorescents correspondant à des molécules uniques. Réglez ensuite l'angle du faisceau d'excitation afin d'illuminer uniquement une fine section de l'échantillon.

Fermer la surface du couvre-objet. Cette méthode repose sur la détection et la localisation précise de protéines fluorescentes uniques, de sorte que l'alignement optimal et la sensibilité du microscope seront cruciaux pour la qualité des données. À cette fin, focaliser le faisceau laser dans le plan focal arrière d'un objectif 100 x à ouverture numérique 1,4.

Le déplacement perpendiculaire au faisceau de la lentille de focalisation éloigne le point focal du centre de l'objectif, ce qui fait sortir le faisceau de l'objectif selon un angle. Ajustez le faisceau de manière à maximiser l'intensité de fluorescence et à minimiser le fond. Recherchez un nouveau champ de cellules en mode microscopie en lumière transmise et mettez l'image au point.

Prendre une capture d'image à l'aide de la caméra pour enregistrer les contours des cellules. Activer le laser de 561 nanomètres et photoblanchir l'autofluorescence cellulaire ainsi que les taches de fond sur la lamelle. Attendre quelques secondes.

Avant de commencer l'acquisition de données, démarrez l'acquisition d'une vidéo PALM sous excitation continue à 561 nanomètres. Activez le laser à 405 nanomètres et augmentez progressivement l'intensité au cours de l'enregistrement jusqu'à atteindre un watt par centimètre carré. Évitez les intensités plus élevées à 405 nanomètres, qui provoqueraient une autofluorescence cellulaire.

Portez attention à la densité des molécules fluorescentes. Il est important de maintenir des taux d'activation faibles afin que les taches fluorescentes soient clairement isolées dans chaque image. Enregistrez environ 10 000 images par film, ce qui, avec un champ de vision recadré, prend généralement jusqu'à trois minutes et jusqu'à un gigaoctet d'espace sur le disque dur.

Notez que, une fois qu'un champ de vision a été imagé, les fluorophores pa m cherry sont irréversiblement photodétruits et ne peuvent plus être observés. Là encore, la procédure suivante utilise un logiciel personnalisé dans matlab. Les fluorophores uniques apparaissent sous forme de fonctions d'étalement du point ou psfs.

Dans le film, les PSF sont d'abord identifiées sur une image filtrée en bande passante à l'aide d'un noyau gaussien de sept pixels de diamètre ; les positions candidates correspondent aux PSF dont l'intensité du pixel de pic est 4,5 fois supérieure à l'écart type du fond. Le pixel localement le plus brillant pour chaque PSF candidate sert d'estimation initiale pour l'ajustement d'une fonction gaussienne elliptique. Les paramètres libres de l'ajustement sont la position en X, la position en Y, la largeur en X, la largeur en Y, l'angle de rotation, l'amplitude et le décalage du fond.

Le masque gaussien elliptique tient compte du déplacement des molécules pendant le temps d'exposition, ce qui floute et déforme le tracé de la PSF. Les localisations XY résultantes de toutes les images de la vidéo PALM sont superposées à l'image de microscopie en lumière transmise du même champ de vision ; les localisations de Paul une PAM Cherry devraient apparaître dans la zone centrale des cellules d’E. coli. Le suivi automatisé mesure le mouvement des protéines, mais le choix adéquat d'une fenêtre de suivi est crucial.

Tout d'abord, exécutez l'algorithme de suivi pour une gamme de paramètres de fenêtre de suivi. Tracez le nombre de trajectoires mesurées par cellule en fonction de la fenêtre de suivi afin d'identifier la plus petite fenêtre de suivi possible qui ne divise pas les trajectoires, puis affichez les trajectoires obtenues sur l'image de microscopie en lumière transmise du même champ de vision. Pour visualiser la distribution spatiale du mouvement des molécules au sein des cellules, les trajectoires P doivent montrer une diffusion confinée à l'intérieur de cellules individuelles ; si une fraction des trajectoires semble traverser entre les cellules, cela suggère que des molécules distinctes ont été reliées de manière erronée, car la fenêtre de suivi a été choisie trop grande et/ou le taux d'activation photochimique était trop élevé.

Tracer la distribution cumulative des longueurs de pas entre les localisations consécutives. La courbe monte et sature régulièrement pour des fenêtres de suivi suffisamment grandes, mais présente un bord de coupure si la fenêtre a été choisie trop petite. Une fois qu'une fenêtre de suivi appropriée a été choisie, les caractéristiques de diffusion de Paul one peuvent être analysées.

Calculez le déplacement quadratique moyen ou MSD entre les localisations consécutives pour chaque trajectoire comportant au total n pas, en utilisant uniquement les trajectoires comprenant au moins cinq localisations afin de réduire l'incertitude statistique du MSD. Ensuite, calculez le coefficient de diffusion apparent par trajectoire à partir du MSD. Le deuxième terme corrige l'erreur de localisation estimée.

Voici les valeurs du deuxième terme. Dans cet exemple, tracez maintenant un histogramme des valeurs mesurées du coefficient de diffusion provenant de toutes les trajectoires dans le champ de vision pour la pol un dans les cellules non endommagées et pour la pol un dans les cellules soumises à un traitement induisant des dommages de l'ADN avec du MMS ; les barres rouges identifient la population de molécules individuelles de la pol un qui semblent liées au chromosome et diffusent à moins de 0,15 micromètre carré par seconde. En revanche, les molécules en diffusion libre se déplacent à environ 0,9 micromètre carré par seconde.

Une fois que les molécules de Paul un liées ont été identifiées, les positions des sites de fixation peuvent être visualisées dans des cellules non endommagées ainsi que dans des cellules présentant des dégâts mm MS. La fraction des trajectoires liées par rapport au nombre total de trajectoires observées fournit une mesure quantitative directe de l'activité de réparation de l'ADN de la pol.

Une photo-activation in vivo de la protéine de fusion Pol I PA-mCherry a été réalisée dans des cellules vivantes d’E. coli. La photo-activation pouvait être limitée à un seul fluorophore PA-mCherry dans une cellule ; des taux de photo-activation plus élevés révélaient un plus grand nombre de molécules fluorescentes. Une analyse de localisation a été effectuée pour chaque image d’un film PALM.

La précision a été mesurée à l’aide de molécules immobiles dans des cellules fixées ou de molécules liées dans des cellules vivantes, et s’est révélée être de 40 nanomètres, en accord avec la prédiction théorique. Ensuite, le seuil de localisation a été défini lorsqu’il était trop bas. Des pics aléatoires dans le bruit de fond étaient alors erronément sélectionnés comme positions candidates, tandis que si le seuil était trop élevé, certaines taches étaient manquées.

Les localisations de Paul one résultantes occupaient la région centrale de la cellule, reproduisant globalement l'organisation spatiale du nucléoïde d’E. coli. La majorité des trajectoires de Paul one dans les cellules non endommagées présentent une diffusion. Une cellule typique contient plusieurs centaines de trajectoires de Paul one, en accord avec un nombre de copies d’environ 400 molécules de Paul one par cellule d’E. coli.

Different types de mouvement moléculaire peuvent être identifiés en calculant les valeurs MSD sur une gamme de temps de retard : un mouvement dirigé donne une courbe parabolique. Le mouvement brownien est caractérisé par une ligne droite. Une courbe de diffusion confinée atteint un plateau, et un décalage de la courbe MSD pour des particules immobiles représente l'incertitude de localisation.

La courbe MSD résultante pour Paul un a augmenté linéairement pour de courtes durées de latence, ce qui indique un mouvement brownien, et s'est saturée pour des durées de latence plus longues en raison du confinement cellulaire. À l'aide de ces méthodes, l'activité de réparation de l'ADN de Paul un a été mesurée en réponse à des dommages d'alkylation exogènes de l'ADN dans des cellules non endommagées. L'histogramme du coefficient de diffusion de Paul un montre une population dominante de molécules en diffusion.

Les rares molécules liées pourraient être impliquées dans la réplication de l'ADN et la réparation des dommages endogènes de l'ADN sous l'effet d'une exposition continue à 100 millimolaire de MMS. La fréquence des trajectoires présentant des coefficients de diffusion proches de zéro augmente de manière significative. Cela soutient le modèle selon lequel davantage de molécules Paul une doivent participer à la réparation de l'ADN en présence d'un agent mutagène suite à cette procédure.

D'autres méthodes d'analyse de données, telles que la localisation et le regroupement, peuvent être effectuées afin de quantifier la distribution spatiale des protéines dans la cellule et d'étudier la présence de complexes protéiques plus grands impliqués dans la réparation de l'ADN.