Visualiser les interactions protéine-ADN dans des cellules bactériennes vivantes en utilisant photoactivés suivi unique molécule

L’objectif global de cette procédure est de visualiser et de quantifier directement l’activité des protéines de liaison à l’ADN dans les cellules bactériennes vivantes. Ceci est accompli en visualisant des cellules qui expriment une protéine fluorescente photo-activée fusionnée à une protéine de liaison à l’ADN d’intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à acquérir un film de protéines individuelles qui sont photoactivées pendant l’imagerie.

Ensuite, les données sont analysées pour déterminer la localisation des protéines et suivre les protéines à l’intérieur des cellules individuelles. Les événements de liaison à l’ADN sont identifiés par la modification du coefficient de diffusion des protéines individuelles lorsqu’elles entrent en contact avec les chromosomes. En fin de compte, les résultats peuvent fournir une mesure quantitative des interactions protéine-ADN au niveau de la cellule unique en comptant le nombre de protéines liées et diffusantes par cellule.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réparation de l’ADN, telles que les taux de réparation in vivo et la distribution spatiale des sites de réparation. Maintenant, nous allons démontrer la méthode en mesurant l’activité de réparation de l’ADN polymérase un dans la vie e coli cellules Tout d’abord, faites des lamelles de recouvrement sans particules fluorescentes de fond dans un four à 500 degrés Celsius pendant une heure. Gravez une réserve de lamelles de recouvrement d’épaisseur numéro 1,5, conservez-les à température ambiante dans du papier d’aluminium.

Ils sont bons pour les semaines à venir. Ensuite, concentrez un millilitre d’E coli en phase exponentielle précoce dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre de la souche. AB 1157 poly a PA m cherry centrifuger les cellules à 2, 300 G pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 20 microlitres de milieu résiduel et vortex les cellules en solution. Ensuite, préparez une solution d’aros à faible fluorescence à 1,5 % dans de l’eau distillée. Mélangez 500 microlitres d’aéros fondus avec 500 microlitres de deux x milieu minimal en pipetant doucement de haut en bas plusieurs fois pour des expériences sur les dommages à l’ADN en utilisant du sulfonate de méthylméthane ou du MMS en prenant des précautions.

Ajoutez 8,3 microlitres de MMS aux 500 microlitres de milieu minimal avant de le mélanger avec les aros avant que le mélange ne refroidisse. Étalez-le sur une lamelle brûlée. Étalez-le uniformément et centré sans faire de bulles.

Aplatissez le tampon avec une deuxième lamelle de couverture brûlée. Une fois refroidi, retirez le couvercle supérieur du tampon et ajoutez un microlitre de suspension cellulaire concentrée. Immobilisez les cellules en recouvrant le tampon d’une nouvelle lamelle de protection brûlée et en appuyant très doucement.

Les cellules doivent être imagées dans les 45 minutes avant de se dessécher. Pour prolonger ce temps, le tampon peut être scellé à l’intérieur d’un joint en silicone pour les expériences sur les dommages à l’ADN. Avant d’imager les cellules, incubez-les sur le tampon pendant 20 minutes.

Dans un récipient humidifié à température ambiante, le microscope est équipé d’un laser d’activation photographique de 405 nanomètres et d’un laser d’excitation de 561 nanomètres. La sensibilité d’une seule molécule est atteinte en excitant uniquement des quatre fluoros dans une section mince au-dessus de la surface de la lamelle de recouvrement à l’aide d’un éclairage très incliné, l’émission de fluorescence est enregistrée sur une caméra CCD multiplicatrice d’électrons. Placez l’échantillon sur la platine du microscope et faites la mise au point sur les cellules.

Sous l’éclairage en lumière transmise, définissez un champ de vision recadré pour réduire la taille des données et augmenter la vitesse de lecture de la caméra. Couvrez l’échantillon de la lumière ambiante et activez le gain de la caméra CCD multiplicatrice d’électrons pour une détection unique fluoro quatre. Réglez la fréquence d’images sur 15,26 millisecondes par image.

Cela inclut la lecture de l’appareil photo de 0,26 milliseconde Temps d’exposition Les temps d’exposition doivent être suffisamment courts pour observer des points fluorescents nets avec peu de mouvement. D’autre part, les traces doivent être échantillonnées à des intervalles de temps suffisamment longs pour distinguer clairement les molécules liées des molécules diffusantes. Affichez maintenant les données de la caméra pour vérifier le signal de fond sombre.

Allumez le laser de 561 nanomètres et vérifiez le signal de fond d’excitation. Allumez le laser de 405 nanomètres pour la photo-activation des protéines de fusion de cerise Paul one PA M et augmentez l’intensité jusqu’à ce que des taches fluorescentes de molécules uniques apparaissent. Ajustez maintenant l’angle du faisceau d’excitation pour n’éclairer qu’une section mince de l’échantillon.

Fermez la surface de la lamelle. Cette méthode repose sur la détection et la localisation précise de protéines fluorescentes uniques, de sorte que l’alignement et la sensibilité optimaux du microscope seront cruciaux pour la qualité des données. À cette fin, focalisez le faisceau laser dans le plan focal arrière d’un objectif à ouverture numérique 1,4 x 100

La translation de la lentille de focalisation perpendiculairement au faisceau éloigne le foyer du centre de l’objectif, ce qui fait sortir le faisceau de l’objectif sous un angle. Visez que le faisceau maximise l’intensité de fluorescence et minimise le bruit de fond. Trouvez un nouveau champ de vision des cellules en mode microscopie en lumière transmise et faites la mise au point de l’image.

Prenez un instantané de l’appareil photo pour enregistrer les contours des cellules. Allumez le laser de 561 nanomètres et blanchissez l’autofluorescence cellulaire et les taches d’arrière-plan sur le couvercle. Glissez pendant quelques secondes.

Avant de commencer l’acquisition des données, commencez l’acquisition d’un film de paume sous excitation continue de 561 nanomètres. Allumez le laser de 405 nanomètres et augmentez progressivement l’intensité au cours du film, jusqu’à atteindre jusqu’à un watt par centimètre carré. Évitez les intensités plus élevées de 405 nanomètres qui provoquent l’autofluorescence cellulaire.

Faites attention à la densité des molécules fluorescentes. Il est important de maintenir des taux d’activation bas afin que les points fluorescents soient clairement isolés dans chaque image. Enregistrez environ 10 000 images par film, ce qui, avec un champ de vision recadré, prend généralement jusqu’à trois minutes et jusqu’à un gigaoctet d’espace sur le disque dur.

Notez qu’une fois qu’un champ de vision a été imagé, les fluorophores de la cerise pa m sont blanchis de manière irréversible et ne peuvent pas être observés. Là encore, la procédure suivante utilise un logiciel personnalisé dans matlab. Les fluorophores simples apparaissent sous forme de fonctions d’étalement de points ou psf.

Dans le film, les psfs sont d’abord identifiés dans une image filtrée par passe-bande à l’aide d’un noyau gaussien de sept pixels de diamètre. Les positions candidates correspondent à P SFS avec des intensités de pixels de crête 4,5 fois supérieures à l’écart-type de l’arrière-plan. Le pixel localement le plus brillant par PSF candidat sert de supposition initiale pour l’ajustement d’une fonction gaussienne elliptique. Les paramètres d’ajustement libre sont la position X y, la position X largeur, la rotation Y largeur, l’angle, l’amplitude et le décalage d’arrière-plan.

Le masque gaussien elliptique tient compte du mouvement des molécules pendant le temps d’exposition, ce qui floute et déforme le tracé PSF. Les localisations XY résultantes de toutes les images du film de paume sur l’image de microscopie à lumière transmise du même champ de vision des localisations de Paul un PAM Cherry devraient apparaître dans la zone centrale des cellules e coli. Le suivi automatisé mesure le mouvement des protéines, mais le choix réussi d’une fenêtre de suivi est crucial.

Tout d’abord, exécutez l’algorithme de suivi pour une plage de paramètres de fenêtre de suivi. Tracez le nombre de traces mesurées par cellule par rapport à la fenêtre de suivi pour identifier la plus petite fenêtre de suivi possible qui ne divise pas les pistes, affichez les traces résultantes sur l’image de microscopie en lumière transmise du même champ de vision. Pour visualiser la distribution spatiale du mouvement des molécules à l’intérieur des cellules, les traces P one doivent afficher une diffusion confinée dans des cellules individuelles si une fraction des pistes semble se croiser entre les cellules, ce qui suggère que des molécules distinctes ont été liées par erreur parce que la fenêtre de suivi a été choisie trop grande et/ou que le taux d’activation de la photo était trop élevé.

Tracez la distribution cumulative des longueurs de pas entre des localisations consécutives. La courbe s’élève et sature doucement pour des fenêtres de suivi suffisamment grandes, mais présente un bord de coupure si la fenêtre a été choisie trop petite. Une fois qu’une fenêtre de suivi appropriée a été choisie, les caractéristiques de diffusion de Paul one peuvent être analysées.

Calculez le déplacement quadratique moyen ou MSD entre des localisations consécutives pour chaque piste avec un total de n pas, n’utilisez que des pistes avec au moins cinq localisations pour réduire l’incertitude statistique de la MSD. Ensuite, calculez le coefficient de diffusion apparent par piste à partir du MSD. Le deuxième terme corrige l’erreur de localisation estimée.

Ce sont les valeurs du deuxième terme. Dans cet exemple, tracez maintenant un histogramme des valeurs de coefficient de diffusion mesurées à partir de toutes les pistes dans le champ de vision pour pol one dans les cellules non endommagées et pour pol one dans les cellules sous traitement des dommages à l’ADN avec MMS, les barres rouges identifient la population de molécules individuelles de pol one qui semblent liées au chromosome et diffusent à moins de 0,15 micron carré par seconde. Alors que les molécules à diffusion libre se déplacent d’environ 0,9 micron carré par seconde.

Après la liaison de Paul, des molécules ont été identifiées. Les positions des sites de liaison peuvent être visualisées dans les cellules non endommagées et dans les cellules présentant des lésions de MS mm. La fraction de traces liées par rapport au nombre total de traces observées fournit une mesure quantitative directe de l’activité de réparation de l’ADN de pol.

Une photo-activation in vivo des protéines de fusion de cerise pol one PA m a été réalisée dans des cellules e-coli vivantes. La photo-activation pourrait être limitée à un seul fluorophore de cerise PA m dans une cellule, des taux de photo-activation plus élevés ont révélé plus de molécules fluorescentes. Une analyse de localisation a été effectuée pour chaque image d’un film de palmier.

La précision a été mesurée à l’aide de molécules immobiles dans des cellules fixes ou de molécules liées dans des cellules vivantes, et s’est avérée être de 40 nanomètres, en accord avec la prédiction théorique. Ensuite, le seuil de localisation a été défini lorsqu’il était trop bas. Des pics aléatoires dans le bruit de fond ont été sélectionnés par erreur comme positions candidates, alors que si le seuil était trop élevé, certains points étaient manqués.

Les localisations de Paul one qui en ont résulté ont occupé la zone centrale de la cellule, récapitulant largement l’organisation spatiale du nucléoïde e coli. La majorité des traces de Paul one dans des cellules intactes affichent une diffusion. Une cellule typique contient plusieurs centaines de traces de Paul, ce qui correspond au nombre de copies d’environ 400 molécules de Paul par cellule e.

Différents types de mouvement moléculaire peuvent être identifiés en calculant les valeurs MSD sur une plage de temps de latence, le mouvement dirigé donne une courbe parabolique. Le mouvement brownien est caractérisé par une ligne droite. Une courbe de diffusion confinée atteint un plateau et un décalage de la courbe MSD pour les particules immobiles représente l’incertitude de localisation.

La courbe MSD résultante pour Paul 1 a augmenté linéairement pendant de courts temps de latence indiquant un mouvement brownien et saturée à des temps de décalage plus longs en raison du confinement cellulaire. À l’aide de ces méthodes, l’activité de réparation de l’ADN de Paul, on a mesuré en réponse à des dommages exogènes de l’alkylation de l’ADN dans des cellules non endommagées. L’histogramme du coefficient de diffusion de Paul un montre une population dominante de molécules diffusantes.

Les quelques molécules liées pourraient être impliquées dans la réplication de l’ADN et la réparation des dommages endogènes à l’ADN sous des dommages MMS continus de 100 millimolaires. La fréquence des traces avec des coefficients de diffusion proches de zéro augmente considérablement. Cela soutient le modèle selon lequel plus de molécules doivent être impliquées dans la réparation de l’ADN avec des mutagènes présents après cette procédure.

D’autres méthodes d’analyse de données telles que la localisation, le clustering peuvent être effectuées afin de quantifier la distribution spatiale des protéines dans la cellule et d’étudier la présence de complexes protéiques plus grands impliqués dans la réparation de l’ADN.