Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

L’objectif général de cette procédure est d’illustrer comment suivre des organites se déplaçant rapidement tels que les lysosomes se déplaçant en 3D au sein d’une cellule vivante. Ceci est accompli en colorant d’abord les lysosomes et les microtubules à l’aide de colorants commerciaux spécifiques à l’intérieur de cellules vivantes cultivées. La deuxième étape consiste à utiliser un microscope à balayage laser et à utiliser la méthode de suivi orbital pour suivre le mouvement du lysosome à grande vitesse, la taille de l’orbite et d’autres paramètres, tels que la réponse en fréquence du système, sont ensuite sélectionnés pour effectuer des expériences de suivi.

En fin de compte, les résultats montrent qu’il est possible de suivre des lysosomes se déplaçant rapidement en trois dimensions et de détecter des interactions avec d’autres organites colorés par fluorescence rencontrés le long de l’orbite du laser pendant le suivi. Le principal avantage de la méthode de suivi 3D par rapport aux autres méthodes existantes, qui sont basées, par exemple, sur les Astigmats, est que la méthode de suivi 3D ou totale nous permet de suivre une très large gamme de la démence. Cette méthode peut aider à poser une question clé dans le domaine du transport vésiculaire, comme la façon dont les vésicules se déplacent le long des microtubes.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier la dynamique endosomale. Il peut également être utilisé dans d’autres systèmes où il est possible de marquer par fluorescence des particules isolées telles que les nanoparticules go, les récepteurs membranaires, les complexes de ports nucléaires agrégés ou les locus génétiques, les cellules ovariennes de hamster chinois maintenues ou les cellules CH K one, comme décrit dans le protocole de texte. Après avoir récolté les cellules, placez-les sur un diamètre de 14 millimètres.

Micro puits d’une épaisseur de surface de 0,16 millimètre Cellules de semence pour une densité optimale pour l’imagerie autour de 60 à 70 % de fluidité Co Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius 5 % CO2 le lendemain, laver les cellules trois fois dans la solution saline tamponnée de Hank ou H-B-S-S-H-B-S-S est utilisé pour éliminer les cellules mortes ou les débris de la plaque de culture et pour préparer les cellules à l’étape de coloration. Ensuite, incubez les cellules dans une solution HBSS contenant une concentration finale de 50 traqueurs de lyo molaires ano et de 150 molaires ano molaires de traqueur de tubuline verte pendant une heure à 37 degrés Celsius après l’incubation. Lavez les cellules trois fois dans HBSS pour enlever tout colorant non lié.

Ajoutez du milieu de croissance DMEM frais avant d’imager les cellules. Le microscope pour le suivi des particules décrit dans le protocole vidéo est assemblé sur le cadre d’un microscope inversé disponible dans le commerce. Une source lumineuse d’excitation laser femtoseconde saphir saphir titane cohérente caméléon ultra deux titane est utilisée avec une gamme de longueurs d’onde de sortie accordable entre 690 nanomètres et 1040 nanomètres.

Assurez-vous que le faisceau laser est aligné dans l’orifice arrière du microscope. À l’aide de miroirs à revêtement infrarouge, le faisceau laser est atténué à l’aide d’une plaque demi-onde rotative placée devant un polariseur de calcite, atténuez le faisceau de sorte que la puissance moyenne de l’échantillon soit comprise entre 0,5 et deux milliwatts. Collectez la lumière de fluorescence de l’échantillon en plaçant un objectif à eau à grande ouverture numérique dans le trajet de la lumière.

Ensuite, placez l’échantillon sur une platine motorisée et ajustez le mouvement fin de l’objectif du microscope. À l’aide d’un contrôleur pizo objectif. Choisissez un cube de filtre de fluorescence en fonction des longueurs d’onde d’émission souhaitées dans une configuration à un ou deux canaux.

Utiliser des filtres passés par la bande d’émission. Pour sélectionner davantage la plage spectrale de la fluorescence émise, dirigez la lumière du cube de filtre dans des tubes photomultiplicateurs où le signal est amplifié et discriminé et envoyé à une carte d’acquisition de données d’entrée et de sortie numérique pour imager les cellules, les positionner sur la scène et faire la mise au point à l’aide d’un éclairage en lumière transmise. Passez à l’imagerie par balayage matriciel pour identifier les cellules qui ont incorporé le colorant et, pour visualiser les microtubules sous-jacents, identifiez la zone initiale où le mouvement de la vésicule est présent.

Une fois qu’une vésicule isolée est identifiée, définissez les paramètres de suivi orbital. Tout d’abord, sélectionnez le rayon de l’orbite pour définir la taille du balayage circulaire en fonction de la taille de la particule suivie. Pour un émetteur ponctuel, définissez le rayon de l’orbite égal à la taille de la fonction d’étalement du point ou PSF du faisceau d’excitation.

Pour maximiser la sensibilité et la réponse. Définissez la distance axiale pour définir la distance entre les deux orbites qui sont effectuées pour localiser la position des particules le long de la direction axiale. Réglez la distance axiale sur 1,5 à trois fois les déchets PSF.

Définissez le temps de séjour en fonction de la luminosité de la particule, pour définir le temps passé sur chaque point de l’orbite, ce qui déterminera également le taux de blanchiment des photos. Utilisez un temps d’arrêt compris entre 10 et 100 microsecondes. Définissez le nombre de points sur chaque orbite sur 64 ou 128 pour obtenir des périodes d’orbite de l’ordre de quatre à 32 millisecondes et fournir une résolution temporelle élevée pour déterminer la position des particules.

Modifiez le signal de décalage CC envoyé aux miroirs afin de centrer le faisceau sur la particule via l’interface utilisateur graphique via une sélection de curseur dans l’image numérisée raster. Commencez le suivi en basculant le mode microscope de l’imagerie matricielle au balayage orbital. Activez le retour d’information et la collecte de données pour l’analyse de trajectoire.

Utilisez le logiciel pour afficher la fluorescence collectée à chaque point de l’orbite et à chaque point temporel sous la forme d’un tapis d’intensité. L’intensité recueillie le long du tapis fournit des informations sur l’interaction de la particule avec d’autres objets brillants. Affichez à la fois les informations de trajectoire ainsi que l’intensité de fluorescence collectée à partir du tube photomultiplicateur au fil du temps sous forme de séries chronologiques.

Utilisez la représentation de la série chronologique et les informations du tapis d’intensité pour sélectionner uniquement une région d’intérêt dans la trajectoire. Affichez ensuite une projection 2D de la partie sélectionnée de la trajectoire de la particule. Sélectionnez les commandes appropriées pour coder par couleur la trajectoire en fonction de l’intensité de fluorescence des particules.

Sélectionnez l’option permettant d’afficher la trajectoire des particules en 3D et de la coder en couleur en fonction de l’intensité de fluorescence. Faites pivoter la trajectoire en 3D à l’aide des commandes pour visualiser les caractéristiques du mouvement du lysosome le long du microtubule. À l’aide d’une coloration verte fluorescente des lysosomes et des microtubules, il est possible d’imager le mouvement à grande vitesse des vésicules le long des microtubules avec un microscope à balayage laser à deux photons.

Cependant, l’imagerie par balayage matriciel n’a pas la résolution temporelle nécessaire pour suivre avec précision le mouvement des endosomes les plus rapides si le suivi orbital est utilisé. Au lieu de cela, les données montrent qu’il est possible d’obtenir des trajectoires de déplacement x, y, Z avec une résolution temporelle de 32 millisecondes. Dans ces trajectoires de déplacement en fonction du temps, l’analyse du tapis affiche l’intensité enregistrée le long de chaque orbite.

Au fil du temps, la trajectoire d’intensité fournit des informations sur l’environnement fluorescent de la particule. La région encadrée correspond à la portion de la trajectoire entre deux sauts. Les points lumineux à l’extérieur de la région encadrée correspondent aux interactions de la particule avec d’autres objets brillants et sont associés à des sauts dans la trajectoire lorsque les orbites se recentre sur la source fluorescente la plus brillante

Pendant le suivi, l’intensité intégrée de la fluorescence émise peut être enregistrée. La trajectoire 3D reconstruite affiche un mouvement dirigé comme on peut s’y attendre d’une vésicule se déplaçant sur le réseau de microtubules. De plus, il est possible de corréler la trajectoire 3D à un RA ou à une image numérisée de la région environnante.

Cela confirme le mouvement de la particule dans la direction d’un faisceau de microtubes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle a fonctionné correctement lors de la tentative. Cette procédure est importante pour se rappeler d’utiliser des niveaux de puissance laser qui ne sont pas nocifs pour votre échantillon lors de l’utilisation de citation photonique comme illustré dans ce protocole, les niveaux de puissance environ deux millivolts après les objectifs doivent être maintenus.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la mise en place d’une expérience en utilisant la méthode de suivi orbital 3D, qui permet de suivre des objets d’une très grande portée Z.