Name: Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Découvrez le suivi orbital 3D de lysosomes rapides dans des cellules vivantes par microscopie à deux photons. Cette méthode permet d'observer les interactions organellaires avec haute résolution temporelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce projet a été soutenu par les subventions NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 et P50-GM076516

Préparation de l&#39;échantillon 1 <ol><li> Maintenir des cellules CHOK1 dans des flacons de culture de tissus à l&#39;aide de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal et 100 UI / ml de pénicilline 50 pg / ml de streptomycine. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 ° C. </li><li> Récolte et ensuite sur l&#39;assiette cellules CHOK1 un diamètre de micro-puits de 14 mm avec une épaisseur de 0,16 mm de surface. cellules de semences pour la densité optimale pour l&#39;imagerie, environ 60-70% de confluence. </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C, 5% CO 2. Laver les cellules trois fois dans du HBSS (solution saline tamponnée de Hank), et incuber les cellules dans une solution contenant 50 nM de Lysotracker DND26 vert et 150 nM de la tubuline traqueur vert. Incuber les cellules pendant 1 heure à 37 ° C. Etape facultative: Avant l&#39;incubation, effectuer une tache supplémentaire avec un colorant matrice de coloration mitochondriale (25 nM). </li><li> Laver les cellules trois fois dans du HBSS pour éliminer tout colorant non lié. Ajouter milieu de croissance DMEM frais avant imagtion des cellules. </li></ol> 2. Configurations microscope Le microscope pour le suivi des particules décrites dans le protocole vidéo est montée sur le châssis d&#39;un microscope inversé disponible dans le commerce (Figure 4). Cependant modules commerciaux pour le suivi des particules orbitale 3D sont maintenant disponibles. <ol><li> Utilisez un II cohérente Chameleon Ultra-Ti: source de lumière d&#39;excitation laser femtoseconde Sa, avec une gamme accordable sortie d&#39;onde comprise entre 690 nm-1040 nm. </li><li> Assurez-vous que le faisceau laser soit aligné sur l&#39;orifice arrière du microscope en utilisant un miroir à revêtement IR. Le faisceau laser est atténué à l&#39;aide d&#39;une lame demi-onde tournante suivie d&#39;un polariseur linéaire de calcite. Atténuer le faisceau de telle sorte que la puissance moyenne de l&#39;échantillon est compris entre 0,5 et 2 mW. NOTE: Le faisceau laser est réfléchi par une paire de miroirs actionnés galvanomètre moteurs qui permettent le contrôle de la position et de la trajectoire du faisceau focalisé dans le plan de l&#39;échantillon. Dans unconfiguration typique du faisceau laser collimaté sortant de miroirs de galvanomètre agrandi (10X) passant à travers un élargisseur de faisceau, avant d&#39;entrer à l&#39;arrière de l&#39;objectif de microscope, après réflexion sur courte passe-miroir dichroïque. </li><li> Collecter la lumière de fluorescence provenant de l&#39;échantillon en plaçant un objectif de l&#39;eau à grande ouverture numérique (60X, NA 1,2) dans le trajet de la lumière. Choisir un cube de filtre de fluorescence en fonction de la longueur d&#39;onde d&#39;émission souhaitées dans une ou l&#39;autre configuration d&#39;un ou deux canaux. Utiliser des filtres passe-bande d&#39;émission pour sélectionner en outre la gamme spectrale de la fluorescence émise. </li><li> Placer l&#39;échantillon sur une platine motorisée, et ajuster l&#39;amende mouvement de l&#39;objectif de microscope à l&#39;aide d&#39;un piézo-contrôleur objectif. </li><li> Diriger la lumière à partir du cube de filtre dans des tubes photomultiplicateurs où le signal est discriminé et envoyé à une carte E / S d&#39;acquisition de données numériques. REMARQUE: Ordinateur généré des formes d&#39;onde sont la sortie analogique de la carte E / S et sont provided pour les scanners de contrôle électronique. L&#39;entrée de comptage de photons à partir des photomultiplicateurs et le signal de sortie pour les scanners sont mesurés et contrôlés par l&#39;intermédiaire de la carte d&#39;E / S par le Laboratoire de logiciel de dynamique de fluorescence SimFCS. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Placez les cellules sur la scène et de se concentrer en utilisant un éclairage lumière transmise. </li><li> Mettre à balayage de trame imagerie pour identifier les cellules qui ont incorporé le colorant et de visualiser les microtubules sous-jacents. Identifier la zone initiale où le mouvement des vésicules est présent. </li><li> Une fois une vésicule isolé est identifié, définissez les paramètres suivants pour le suivi orbital: <ol><li> Sélectionner le rayon de l&#39;orbite de définir la taille du balayage circulaire en fonction de la taille de la particule est suivie. Pour un émetteur ponctuel, définir le rayon de l&#39;orbite égale à la taille de la fonction de flou (PSF) du faisceau d&#39;excitation pour maximiser la sensibilité et la réponse. </li><li> Réglez le axialdistance pour définir la distance entre les deux orbites qui sont exécutées pour localiser la position de la particule suivant la direction axiale. Réglez la distance axiale à 1,5-3 fois la taille de la PSF. </li><li> Définir la durée de séjour en fonction de la luminosité de la particule pour définir le temps consacré à chaque point de l&#39;orbite, ce qui permettra également de déterminer le taux de photo-blanchiment. Utilisez un temps d&#39;arrêt entre 10-100 microsecondes. </li><li> Définissez le nombre de points dans chaque orbite à 64 ou 128 pour obtenir des périodes orbitales de l&#39;ordre de 4-32 ms et fournir une haute résolution temporelle pour déterminer la position de la particule. </li></ol></li><li> Changer le signal de décalage à courant continu envoyée à miroirs afin de centrer le faisceau sur la particule par l&#39;intermédiaire de l&#39;interface utilisateur graphique par l&#39;intermédiaire d&#39;un curseur de sélection dans l&#39;image de balayage de trame. </li><li> Commencer à suivre en changeant de mode de raster-imagerie microscope à balayage orbital. </li><li> Activer la collecte de commentaires et données. </li></ol> 4. TrajectAnalyse ory <ol><li> Utilisez le logiciel pour afficher la fluorescence collectées à chaque point le long de l&#39;orbite et à chaque point de temps sous la forme d&#39;un «tapis d&#39;intensité». L&#39;intensité recueillie sur le tapis contient des informations sur l&#39;interaction de la particule avec d&#39;autres objets lumineux. Utiliser le logiciel pour afficher à la fois les informations de trajectoire (c&#39;est à dire le déplacement continu au cours du temps de la x, scanners y et des z -piezo) ainsi que l&#39;intensité de fluorescence collecté par le tube photomultiplicateur au cours du temps sous forme de séries chronologiques. </li><li> Utiliser la représentation de série de temps et l&#39;information &quot;d&#39;intensité de tapis» à sélectionner uniquement une région d&#39;intérêt dans la trajectoire. </li><li> Utiliser le logiciel pour afficher une projection 2D de la partie sélectionnée de la trajectoire des particules. Sélectionnez les contrôles appropriés à code couleur de la trajectoire selon l&#39;intensité de fluorescence des particules. </li><li> Sélectionnez l&#39;option pour afficher la pagearticle trajectoire en 3D, et un code couleur en fonction de l&#39;intensité de fluorescence. Tournez la trajectoire en 3D en utilisant les contrôles de visualiser les caractéristiques de la motion de lysosome le long des microtubules. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Malgré les énormes progrès des techniques de fluorescence en microscopie et instrumentations au cours des dernières années, la réalisation de trajectoires de particules fluorescentes en trois dimensions avec une résolution temporelle est restée un défi dans le domaine. Si une haute résolution temporelle a été atteinte particules de repérage à deux dimensions, l&#39;extension à la direction axiale apporte généralement une réduction drastique de la réponse en fréquence du système 10. <p class="jove_content"...

Un grand nombre d&#39;approches ont été développées à ce jour pour suivre les particules fluorescentes dans trois dimensions à l&#39;aide d&#39;un microscope. La plupart des approches reposent sur l&#39;utilisation de caméras rapides, parfaitement adapté pour suivre en deux dimensions, typiquement combinées avec les adaptations personnalisées de l&#39;optique d&#39;émission du microscope pour réaliser un suivi dans le sens axial. microscopes à balayage laser (soit confocale ou deux photons) conventionnelle peut suivre une particule fluorescente en effectuant une séquence temporelle de z-piles, même si ce processus est généralement beaucoup de temps, et donne la résolution de temps raisonnable (10 Hz) que si la particule étant suivi est conservé dans le centre d&#39;une petite région de formation d&#39;image tramée par un mécanisme de rétroaction actif 2. L&#39;idée de l&#39;immobilisation de la particule est la base de la méthode de suivi orbital. Au lieu d&#39;une trame numériser une orbite circulaire est réalisée autour de la particule fluorescente. L&#39;intensité de la fluorescence le long del&#39;orbite localise précisément la position des particules 4. La position localisée de la particule peut ensuite être utilisé pour actionner les scanners de microscope et recentrer les orbites de la position de la particule. Les scanners galvanométriques du microscope sont entraînés par une tension analogique. La composante alternative de cette tension permet d&#39;effectuer une orbite avec le faisceau laser focalisé, c&#39;est à dire un sinus et une onde cosinus appliquée à des miroirs X et Y balayage permettant d&#39;effectuer une orbite circulaire. Le décalage en courant continu du signal facilite le changement de la position du centre de l&#39;orbite. Une fois la période de l&#39;orbite est déterminée et la forme d&#39;onde pour le signal en courant alternatif est configuré, le système de rétroaction a besoin pour mettre à jour uniquement la composante continue du signal. Un logiciel capable de lire le signal fluorescent recueillies par les détecteurs est nécessaire pour contrôler les scanners et les détecteurs, de calculer la position de la particule et mettre à jour la DC horsdéfinir. Pour un retour réussi imagerie d&#39;un choix judicieux des paramètres orbitaux (taille et de synchronisation) est nécessaire et ces paramètres doivent être ajustés en fonction des caractéristiques des particules fluorescentes, il est nécessaire de suivre. Les fondements physiques et mathématiques de la technique ont été décrites dans le passé de 4,5 pour les applications 2D et 3D. Dans ce protocole, nous décrivons brièvement les principaux composants matériels de l&#39;installation, et plus en détail le choix des paramètres et la préparation de l&#39;échantillon nécessaire pour une expérience typique qui nous a permis suite au déplacement d&#39;un lysosome à une haute résolution temporelle dans une cellule vivante.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcite Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanomètre-moteur miroir</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Platine motorisée</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp ;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Tube photomultiplicateur</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Carte d’acquisition de données</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie</td><td>LFD</td><td>Global pour images-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

suivi 3d orbital dans un microscope à deux photons à jour: une application au suivi des vésicules intracellulaires

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

L&#39;objectif de ce protocole vidéo est de discuter de la façon d&#39;effectuer et d&#39;analyser une expérience fluorescente en trois dimensions suivi de particules orbital en utilisant un microscope à deux photons modifié 1. Contrairement aux approches classiques (de balayage de trame ou à grand champ basé sur une pile de cadres), le suivi orbitale 3D permet de localiser et de suivre avec une grande spatiale (10 précision nm) et la résolution temporelle (réponse en fréquence de 50 Hz) le déplacement 3D de une particule fluorescente déplacer sur la longueur des échelles de centaines de microns 2. La méthode est basée sur un algorithme de contre-réaction qui commande le matériel de deux photons microscope à balayage laser pour effectuer une orbite circulaire autour de l&#39;objet à suivre: le mécanisme de rétroaction maintient l&#39;objet fluorescent dans le centre de commande du déplacement de le faisceau de balayage 5.3. Pour démontrer les avantages de cette technique, nous avons suivi un organite se déplaçant rapidement, le lysosome, dans alcellule iving 6,7. Les cellules ont été étalées selon des protocoles standard, et colorées à l&#39;aide d&#39;un colorant dans le commerce lysosome. Nous discutons brièvement la configuration matérielle et plus en détail le logiciel de contrôle, à réaliser une expérience de suivi orbitale 3D à l&#39;intérieur des cellules vivantes. On discute en détail les paramètres nécessaires afin de contrôler le microscope à balayage et permettre le mouvement de la poutre sur une orbite fermée autour de la particule. Nous concluons en démontrant comment cette méthode peut être utilisée efficacement pour suivre le mouvement rapide d&#39;un lysosome marqué le long des microtubules en 3D dans une cellule vivante. Les lysosomes peuvent se déplacer à des vitesses de l&#39;ordre de 0,4-0,5 um / s, en affichant un mouvement généralement dirigé le long du réseau de microtubules 8.

Selon ce protocole suivi rapide de particules isolées 3D peut être effectué à l'intérieur de cellules vivantes à l'aide d'un microscope à deux photons à jour pour suivre le déplacement des lysosomes marquées par fluorescence. L'expérience réalisée consiste en un suivi de lysosome isolée se déplaçant à l'intérieur de la cellule après le processus de maturation de l'endosome 9. Les lysosomes ont été colorées en utilisant un colorant vert fluorescent et excités à 930 nm exploitant 2-photon excitation. Nos donnée...

Dans ce protocole vidéo, nous suivons - à grande vitesse et en trois dimensions - des lysosomes marqués par fluorescence dans des cellules vivantes, en utilisant la méthode de suivi orbital dans un microscope à deux photons modifié.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

L’objectif général de cette procédure est d’illustrer comment suivre des organites se déplaçant rapidement tels que les lysosomes se déplaçant en 3D au sein d’une cellule vivante. Ceci est accompli en colorant d’abord les lysosomes et les microtubules à l’aide de colorants commerciaux spécifiques à l’intérieur de cellules vivantes cultivées. La deuxième étape consiste à utiliser un microscope à balayage laser et à utiliser la méthode de suivi orbital pour suivre le mouvement du lysosome à grande vitesse, la taille de l’orbite et d’autres paramètres, tels que la réponse en fréquence du système, sont ensuite sélectionnés pour effectuer des expériences de suivi.En fin de compte, les résultats montrent qu’il est possible de suivre des lysosomes se déplaçant rapidement en trois dimensions et de détecter des interactions avec d’autres organites colorés par fluorescence rencontrés le long de l’orbite du laser pendant le suivi. Le principal avantage de la méthode de suivi 3D par rapport aux autres méthodes existantes, qui sont basées, par exemple, sur les Astigmats, est que la méthode de suivi 3D ou totale nous permet de suivre une très large gamme de la démence. Cette méthode peut aider à poser une question clé dans le domaine du transport vésiculaire, comme la façon dont les vésicules se déplacent le long des microtubes.Bien que cette méthode puisse être utilisée pour étudier la dynamique endosomale. Il peut également être utilisé dans d’autres systèmes où il est possible de marquer par fluorescence des particules isolées telles que les nanoparticules go, les récepteurs membranaires, les complexes de ports nucléaires agrégés ou les locus génétiques, les cellules ovariennes de hamster chinois maintenues ou les cellules CH K one, comme décrit dans le protocole de texte. Après avoir récolté les cellules, placez-les sur un diamètre de 14 millimètres.Micro puits d’une épaisseur de surface de 0,16 millimètre Cellules de semence pour une densité optimale pour l’imagerie autour de 60 à 70 % de fluidité Co Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius 5 % CO2 le lendemain, laver les cellules trois fois dans la solution saline tamponnée de Hank ou H-B-S-S-H-B-S-S est utilisé pour éliminer les cellules mortes ou les débris de la plaque de culture et pour préparer les cellules à l’étape de coloration. Ensuite, incubez les cellules dans une solution HBSS contenant une concentration finale de 50 traqueurs de lyo molaires ano et de 150 molaires ano molaires de traqueur de tubuline verte pendant une heure à 37 degrés Celsius après l’incubation. Lavez les cellules trois fois dans HBSS pour enlever tout colorant non lié.Ajoutez du milieu de croissance DMEM frais avant d’imager les cellules. Le microscope pour le suivi des particules décrit dans le protocole vidéo est assemblé sur le cadre d’un microscope inversé disponible dans le commerce. Une source lumineuse d’excitation laser femtoseconde saphir saphir titane cohérente caméléon ultra deux titane est utilisée avec une gamme de longueurs d’onde de sortie accordable entre 690 nanomètres et 1040 nanomètres.Assurez-vous que le faisceau laser est aligné dans l’orifice arrière du microscope. À l’aide de miroirs à revêtement infrarouge, le faisceau laser est atténué à l’aide d’une plaque demi-onde rotative placée devant un polariseur de calcite, atténuez le faisceau de sorte que la puissance moyenne de l’échantillon soit comprise entre 0,5 et deux milliwatts. Collectez la lumière de fluorescence de l’échantillon en plaçant un objectif à eau à grande ouverture numérique dans le trajet de la lumière.Ensuite, placez l’échantillon sur une platine motorisée et ajustez le mouvement fin de l’objectif du microscope. À l’aide d’un contrôleur pizo objectif. Choisissez un cube de filtre de fluorescence en fonction des longueurs d’onde d’émission souhaitées dans une configuration à un ou deux canaux.Utiliser des filtres passés par la bande d’émission. Pour sélectionner davantage la plage spectrale de la fluorescence émise, dirigez la lumière du cube de filtre dans des tubes photomultiplicateurs où le signal est amplifié et discriminé et envoyé à une carte d’acquisition de données d’entrée et de sortie numérique pour imager les cellules, les positionner sur la scène et faire la mise au point à l’aide d’un éclairage en lumière transmise. Passez à l’imagerie par balayage matriciel pour identifier les cellules qui ont incorporé le colorant et, pour visualiser les microtubules sous-jacents, identifiez la zone initiale où le mouvement de la vésicule est présent.Une fois qu’une vésicule isolée est identifiée, définissez les paramètres de suivi orbital. Tout d’abord, sélectionnez le rayon de l’orbite pour définir la taille du balayage circulaire en fonction de la taille de la particule suivie. Pour un émetteur ponctuel, définissez le rayon de l’orbite égal à la taille de la fonction d’étalement du point ou PSF du faisceau d’excitation.Pour maximiser la sensibilité et la réponse. Définissez la distance axiale pour définir la distance entre les deux orbites qui sont effectuées pour localiser la position des particules le long de la direction axiale. Réglez la distance axiale sur 1,5 à trois fois les déchets PSF.Définissez le temps de séjour en fonction de la luminosité de la particule, pour définir le temps passé sur chaque point de l’orbite, ce qui déterminera également le taux de blanchiment des photos. Utilisez un temps d’arrêt compris entre 10 et 100 microsecondes. Définissez le nombre de points sur chaque orbite sur 64 ou 128 pour obtenir des périodes d’orbite de l’ordre de quatre à 32 millisecondes et fournir une résolution temporelle élevée pour déterminer la position des particules.Modifiez le signal de décalage CC envoyé aux miroirs afin de centrer le faisceau sur la particule via l’interface utilisateur graphique via une sélection de curseur dans l’image numérisée raster. Commencez le suivi en basculant le mode microscope de l’imagerie matricielle au balayage orbital. Activez le retour d’information et la collecte de données pour l’analyse de trajectoire.Utilisez le logiciel pour afficher la fluorescence collectée à chaque point de l’orbite et à chaque point temporel sous la forme d’un tapis d’intensité. L’intensité recueillie le long du tapis fournit des informations sur l’interaction de la particule avec d’autres objets brillants. Affichez à la fois les informations de trajectoire ainsi que l’intensité de fluorescence collectée à partir du tube photomultiplicateur au fil du temps sous forme de séries chronologiques.Utilisez la représentation de la série chronologique et les informations du tapis d’intensité pour sélectionner uniquement une région d’intérêt dans la trajectoire. Affichez ensuite une projection 2D de la partie sélectionnée de la trajectoire de la particule. Sélectionnez les commandes appropriées pour coder par couleur la trajectoire en fonction de l’intensité de fluorescence des particules.Sélectionnez l’option permettant d’afficher la trajectoire des particules en 3D et de la coder en couleur en fonction de l’intensité de fluorescence. Faites pivoter la trajectoire en 3D à l’aide des commandes pour visualiser les caractéristiques du mouvement du lysosome le long du microtubule. À l’aide d’une coloration verte fluorescente des lysosomes et des microtubules, il est possible d’imager le mouvement à grande vitesse des vésicules le long des microtubules avec un microscope à balayage laser à deux photons.Cependant, l’imagerie par balayage matriciel n’a pas la résolution temporelle nécessaire pour suivre avec précision le mouvement des endosomes les plus rapides si le suivi orbital est utilisé. Au lieu de cela, les données montrent qu’il est possible d’obtenir des trajectoires de déplacement x, y, Z avec une résolution temporelle de 32 millisecondes. Dans ces trajectoires de déplacement en fonction du temps, l’analyse du tapis affiche l’intensité enregistrée le long de chaque orbite.Au fil du temps, la trajectoire d’intensité fournit des informations sur l’environnement fluorescent de la particule. La région encadrée correspond à la portion de la trajectoire entre deux sauts. Les points lumineux à l’extérieur de la région encadrée correspondent aux interactions de la particule avec d’autres objets brillants et sont associés à des sauts dans la trajectoire lorsque les orbites se recentre sur la source fluorescente la plus brillante.Pendant le suivi, l’intensité intégrée de la fluorescence émise peut être enregistrée. La trajectoire 3D reconstruite affiche un mouvement dirigé comme on peut s’y attendre d’une vésicule se déplaçant sur le réseau de microtubules. De plus, il est possible de corréler la trajectoire 3D à un RA ou à une image numérisée de la région environnante.Cela confirme le mouvement de la particule dans la direction d’un faisceau de microtubes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle a fonctionné correctement lors de la tentative. Cette procédure est importante pour se rappeler d’utiliser des niveaux de puissance laser qui ne sont pas nocifs pour votre échantillon lors de l’utilisation de citation photonique comme illustré dans ce protocole, les niveaux de puissance environ deux millivolts après les objectifs doivent être maintenus.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la mise en place d’une expérience en utilisant la méthode de suivi orbital 3D, qui permet de suivre des objets d’une très grande portée Z.

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Cette vidéo montre comment les vésicules neuronales sont marquées avec des protéines fluorescentes spécifiques pour visualiser leur mouvement. Tout d’abord, un plasmide codant pour une protéine fluorescente est incubé avec un agent de transfection, puis introduit dans une culture de neurones. Par la suite, des images des neurones sont acquises et analysées pour suivre le mouvement des vésicules.

Visualisation des motilités vésiculaires dans les neurones à l’aide de l’imagerie par fluorescence

Quatre dimensions (4D) imagerie est utilisée pour étudier le comportement et les interactions entre les deux types de endosomes dans les terminaisons nerveuses vertébrés vivant. Le mouvement de ces petites structures est caractérisé en trois dimensions, ce qui permet la confirmation des événements tels que la fusion des endosomes et l'exocytose.

Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d&#39;imagerie par fluorescence

L'étude du trafic membranaire est cruciale pour comprendre les fonctions neuronales. Ici, nous introduisons un procédé pour quantifier la motilité des vésicules dans les neurones. C'est une méthode pratique qui peut être adaptée à la quantification du trafic membranaire dans le système nerveux.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

Détails de ce protocole la construction et l’exploitation d’un microscope de suivi en temps réel 3D seule particule capable de suivi échelle nanométrique fluorescent sondes à grande vitesse par diffusion et taux de comptage de photons de faible.

Un protocole pour un suivi en temps réel 3D seule particule

Ici, nous illustrons comment microscopie photoactivation localisation seule molécule peut être effectuée sur le terminal de nerf moteur d’un live de Drosophila melanogaster troisième stade larve.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

Ce protocole décrit l'analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d'imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d'analyser quantitativement les structures étiquetées.

Microscopie 4D de levure

La microscopie de localisation simple molécule 3D est utilisée pour sonder les positions spatiales et les trajectoires de mouvement des protéines étiquetées fluorescentes dans les cellules bactériennes vivantes. Le protocole expérimental et d'analyse de données décrit ci-dessus détermine les comportements diffusifs répandus des protéines cytosoliques basées sur des trajectoires monomolécules mises en commun.

Microscopie de suivi à molécule unique - Outil pour déterminer les états diffusifs des molécules cytosoliques

L’analyse du déplacement carré moyen (iMSD) dérivée de l’imagerie est appliquée aux macroponosomes pour mettre en évidence leur nature intrinsèque évolutive dans le temps en termes de propriétés structurelles et dynamiques. Les macropoinosomes sont ensuite comparés aux granules sécrétoires d’insuline (ISG) comme référence pour les structures subcellulaires ayant des propriétés structurelles/dynamiques moyennes invariantes dans le temps.

Sondage des propriétés structurelles et dynamiques des nanostructures subcellulaires de trafic par spectroscopie de fluctuation spatio-temporelle

Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Cet article fournit une description détaillée de la création d’échantillons pour le suivi d’une seule protéine dans les bicouches lipidiques soutenues par des solides. Il explique aussi un microscope à fluorescence simple avec une sensibilité à une seule molécule et un taux d’images rapide. Enfin, nous exposons la procédure d’extraction des trajectoires à une seule protéine.

Suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence

Découvrez le suivi orbital 3D de lysosomes rapides dans des cellules vivantes par microscopie à deux photons. Cette méthode permet d'observer les interactions organellaires avec haute résolution temporelle.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

Explorer plus de vidéos