Détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la teneur en glycogène des cyanobactéries à l’aide d’une hydrolyse sélective et d’un dosage enzymatiques. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine des cyanobactéries, comme la physiologie, la génétique moléculaire et la bio-ingénierie de différentes souches de cyanobactéries à l’étude. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est adaptée à petite échelle, qu’elle est facile à réaliser, qu’elle est très sensible et spécifique au glycogène.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des cyanobactéries, elle peut également être appliquée à d’autres micro-organismes qui accumulent du glycogène ou de l’amidon, tels que E. Coli, les levures, les microalgues et divers micro-organismes hétérotrophes et phototrophes. Commencer ce protocole par la préparation des cultures de cyanobactéries comme décrit dans le protocole textuel. Transférez un millilitre de culture cyanobactérienne ou de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre.

Ensuite, centrifugez à 6 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Jetez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans un millilitre de 50 millimolaires de Tris-HCL pH huit. Centrifugez la pastille remise en suspension comme précédemment.

Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension une deuxième fois dans le tampon Tris-HCL. Centrifugez les tubes comme précédemment et jetez le surnageant. Ensuite, remettez complètement le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon Tris-HCL de 50 millimolaires pH huit.

Il est crucial d’avoir le granulé bien suspendu pour une lyse efficace. Conservez la remise en suspension dans la glace. Lyser les cellules remises en suspension à quatre degrés Celsius par 30 cycles d’ultrasons, chaque cycle étant composé de 30 secondes à une fréquence de 20 kilohertz avec une amplitude maximale, suivie de 90 secondes sans.

Centrifugez le tube contenant le lysat à 6 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après la centrifugation, la pastille doit être principalement constituée de gros débris cellulaires, et le surnageant est utilisé pour une analyse plus approfondie. À ce stade, déterminez la concentration en protéines à l’aide du kit de dosage des protéines.

Éliminez la chlorophylle a du lysat cellulaire en mélangeant 900 microlitres d’éthanol et 100 microlitres du surnageant obtenu dans un tube à bouchon à vis de 1,5 millilitre. Après avoir fermé le bouchon, chauffez le tube à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes, à l’aide d’un bloc chauffant de laboratoire standard. Ensuite, incubez le tube dans de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, centrifugez le tube à 20 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant. La pastille contient du glycogène.

Séchez légèrement la pastille à l’air libre pour éliminer l’excès d’éthanol. Ne séchez pas excessivement le granulé pour éviter de le dissoudre difficilement. Mesurer l’absorbance à 666 nanomètres du surnageant obtenu pour déterminer la teneur en chlorophylle a.

La valeur peut être utilisée pour normaliser la teneur en glycogène. Dissoudre la pastille dans 100 microlitres d’acétate de sodium de 50 millimolaires pH cinq. Mélangez bien ces matériaux, à l’aide d’un vortex.

Le mélange par pipetage n’est pas recommandé car le mélange est visqueux. Ajoutez également 50 microlitres de huit unités par millilitre d’amyloglucosidase et 50 microlitres de deux unités par millilitre d’alpha-amylase. Ensuite, incubez le mélange à 60 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant deux heures pour permettre la digestion du glycogène en molécules de glucose.

Après l’incubation, centrifuger l’échantillon à 20 000 fois g pendant cinq minutes et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Mesurer la concentration de glucose dans le surnageant après hydrolyse enzymatique, à l’aide du réactif GOD-POD. Transférez 100 microlitres de surnageant de l’étape de précipitation du glycogène dans un puits dans une plaque à 96 puits.

Comme contrôle négatif, utilisez 100 microlitres d’acétate de sodium de 50 millimolaires pH cinq. Pour générer la courbe d’étalonnage, mesurez également les solutions étalons de glucose. Ajoutez 150 microlitres de réactif GOD-POD à chaque échantillon et mélangez rapidement par pipetage.

Incuber l’assiette à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, enregistrez la valeur d’absorbance à 510 nanomètres, à l’aide d’un lecteur de plaques. Calculez la quantité de glycogène en équivalent glucose, à l’aide d’une courbe d’étalonnage obtenue à partir des étalons de glucose.

La teneur en glycogène de Synechocystis est indiquée ici. Les deux souches mutantes, delta pmg A et delta pmg R, qui sont connues pour hyperaccumuler le glycogène, ont été comparées à la souche de type sauvage. Comme prévu, les souches mutantes présentaient des niveaux élevés de glycogène.

À l’inverse, un mutant dépourvu de glycogène synthase n’a pas accumulé de glycogène. Les souches utilisées ici ont été conçues pour produire du mannitol. Notamment, le mutant de la glycogène synthase a produit plus de mannitol que la souche témoin, ce qui suggère que les glucides synthétisés par la photosynthèse sont redirigés vers le mannitol dans la souche mutante n’ayant pas la capacité de synthétiser le glycogène.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de déterminer quantitativement la teneur en glycogène des cyanobactéries en cinq heures. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de ne pas oublier de remettre soigneusement les cellules en suspension et de solubiliser les granules de glycogène pour obtenir des résultats fiables. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que les dosages de l’activité enzymatique métabolique peuvent être effectuées à l’aide des lysats cellulaires restants afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la façon dont le métabolisme des glucides est régulé chez les cyanobactéries.