Name: Détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez une méthode enzymatique simple et sensible pour mesurer le contenu en glycogène dans les cyanobactéries. Cette technique facilite la recherche en physiologie, génétique moléculaire et ingénierie métabolique.

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Les auteurs reconnaissent Nordic Energy Research (AquaFEED, projet no 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, projet n ° 12-131844) et Villum Fonden (projet n ° 13363)

1. Préparation <ol><li> Les cultures de cyanobactéries <ol><li> Grow Synechocystis sp. PCC 6803 à 30 ° C dans un milieu liquide BG11 8 , avec un apport constant d&#39;air additionné de CO 2 à 1% (v / v). Illuminer les cultures en continu avec de la lumière à une densité de flux photonique photosynthétique de 50 μmol de photon / m 2 / s. </li><li> Grow Synechococcus sp. PCC 7002 en liquide A + moyen 23 (milieu BG11 peut également être utilisé), avec un apport constant d&#39;air additionné de CO 2 à 1% (v / v). La température devrait être de 37 ° C. Illuminer les cultures en continu avec de la lumière à une densité de flux photonique photosynthétique de 150 μmol de photon / m 2 / s. </li><li> Mesurer la densité optique (OD) de la culture à 730 nm à l&#39;aide d&#39;une cuvette avec un chemin d&#39;éclairage de 1 cm. Si la valeur de l&#39;OD est supérieure à 0,8, faites des dilutions appropriées pour obtenir des mesures de DO qui sont proportionnelles à laConcentration de cellule e. NOTE: Les protocoles présentés ci-dessous conviennent aux cultures liquides, avec une densité cellulaire correspondant à une valeur OD 730nm de 2 ou supérieure. Lorsque des cultures dans la phase de croissance exponentielle sont souhaitées, qui ont typiquement une valeur de DO 730nm inférieure à 1, concentrent la densité cellulaire par centrifugation et remise en suspension dans un tampon ou un milieu pour obtenir une valeur de DO 730nm de 2 ou plus. </li></ol></li><li> Buffers et réactifs <ol><li> Faire un tampon Tris-HCl 50 mM à pH 8. </li><li> Faire un tampon 50 mM d&#39;acétate de sodium à pH 5. </li><li> Faire une solution mère de 8 U / ml d&#39;amyloglucosidase dans du tampon 50 mM d&#39;acétate de sodium, pH 5. </li><li> Faire une solution mère de 2 U / ml d&#39;a-amylase dans du tampon 50 mM d&#39;acétate de sodium, pH 5. </li><li> En utilisant de l&#39;eau distillée, des solutions standards de formolucose à des concentrations comprises entre 0 et 100 μg / mL. </li><li> Préparer le réactif GOD-POD du kit D-Glucose Assay (Format GODPOD), fEn suivant les instructions du fabricant. </li></ol></li></ol> 2. Détermination du poids sec à la cellule (en option) <ol><li> Transférer 2 mL d&#39;une culture ou une resuspension cellulaire (voir étape 1.1) dans un tube de 2,0 mL et centrifuger à 6000 xg et 4 ° C pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension la pastille dans 1 mL d&#39;eau et centrifuger à 6000 xg et 4 ° C pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 ml d&#39;eau. </li><li> Transférer la suspension dans un plateau en aluminium pré-pesé. Transférez le plateau à un four à sécher à 105 ° C pour un séchage pendant une nuit (environ 18 h). CRITIQUE: Il est important que le bac soit manipulé avec une pince pour éviter le transfert du matériau des doigts. Séchez un bac en aluminium pré-pesé vide dans les mêmes conditions pour déterminer toute perte de poids des plateaux pendant le séchage. </li><li> Après séchage, retirez le plateau du four et laissez-le équilibrer à la température ambiantePendant 5 min avant de le peser avec une précision de 0,0001 g. REMARQUE: la valeur peut être utilisée pour normaliser la teneur en glycogène sur une base cellulaire-sèche. </li></ol> 3. Lysis of Cyanobacterial Cells <ol><li> Transférer 1 mL d&#39;une culture ou une remise en suspension cellulaire (voir étape 1.1) dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 6 000 xg et 4 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension la pastille dans 1 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8 et centrifuger à 6 000 xg et 4 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml du tampon Tris-HCl. Répétez le processus. </li><li> Remettre complètement le culot dans 500 μL de tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8. CRITIQUE: Resuspendre bien le culot pour une lyse cellulaire efficace. Garder la resuspension dans la glace. </li><li> Lyse les cellules remises en suspension à 4 ° C en effectuant 30 cycles d&#39;ultrasons, chaque cycle étant constitué de 30 s à une fréquence de 20 kHz avec l&#39;amplitude maximale,Suivi de 90 s sans. REMARQUE: Cette méthode peut efficacement lyse Synechococcus sp. PCC 7002. <ol><li> Sinon, transférez la suspension de la cellule à un tube à vis et ajoutez des billes d&#39;oxyde de zirconium au tube, conformément aux instructions du fabricant. Réglez le tube dans un homogénéisateur de tissu et lysez les cellules à 4 ° C en effectuant 2 cycles de battement, chaque cycle étant constitué de 5 min au réglage de fréquence de 5. REMARQUE: cette méthode peut efficacement lyse Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002. </li></ol></li><li> Centrifuger le tube contenant le lysat pendant 10 min à 6000 xg et 4 ° C. REMARQUE: La pastille doit être principalement constituée de débris de grandes cellules. S&#39;il existe un nombre important de cellules ininterrompues, répétez l&#39;étape 3.4. Gardez le surnageant sur la glace. </li><li> Déterminer la concentration de protéines en utilisant un kit commercial de dosage de protéines BCA. NOTE: La valeur peut être utilisée pour normaliser le contenu en glycogèneSur une base de protéines. </li></ol> 4. Précipitations de glycogène <ol><li> Enlever la chlorophylle a du lysat cellulaire en mélangeant 900 uL d&#39;éthanol à 96% (v / v) et 100 μL du surnageant à partir de l&#39;étape 3.5 dans un tube à bouchon à vis de 1,5 ml. Après avoir fermé le capuchon, chauffez le tube à 90 ° C pendant 10 min en utilisant un bloc de chauffage de laboratoire standard. </li><li> Incuber le tube sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Centrifuger le tube à 20 000 xg et 4 ° C pendant 30 min et enlever soigneusement le surnageant; La pastille contient du glycogène. Sécher légèrement la pastille à l&#39;air pour éliminer l&#39;excès d&#39;éthanol. CRITIQUE: Le séchage excessif de la pastille doit être évité, sinon il devient difficile de se solubiliser à l&#39;étape 5.1. </li><li> OPTIONNEL: Mesurer l&#39;absorbance du surnageant obtenu à l&#39;étape 4.3 à 664 nm pour déterminer la teneur en chlorophylle a . Utilisez un coefficient d&#39;absorption de 84,6 L / g / cm 24 . REMARQUE: la valeur peut être utilisée pour normaliserE la teneur en glycogène. </li></ol> 5. Détermination enzymatique de l&#39;hydrolyse et du glycogène <ol><li> Solubiliser le pastille obtenu à l&#39;étape 4.3 dans 100 μl d&#39;acétate de sodium 50 mM, pH 5, et ajouter 50 μL de 8 U / mL d&#39;amyloglucosidase et 50 μL d&#39;α-amylase 2 U / mL. Mélangez bien ces matériaux à l&#39;aide d&#39;un vortex. REMARQUE: le mélange par pipettage n&#39;est pas recommandé car la pastille de glycogène est visqueuse. </li><li> Incuber le mélange à 60 ° C sur un bloc de chauffage pendant 2 h pour permettre la digestion du glycogène en molécules de glucose. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 10 000 xg pendant 5 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li></ol> 6. Détermination du contenu total en glycémie à l&#39;aide du réactif GOD-POD <ol><li> Mesurer la concentration de glucose dans le surnageant obtenu à l&#39;étape 5.3 en utilisant le réactif GOD-POD. Transférer 100 μL du surnageant de l&#39;étape 5.3 à un puits dans une plaque à 96 puits. Comme un contrôle négatif,Utiliser 100 μl d&#39;acétate de sodium 50 mM, pH 5. Pour générer une courbe d&#39;étalonnage, mesurer également les solutions standard de glucose. </li><li> Ajouter 150 μL de réactif GOD-POD à chaque échantillon et mélanger rapidement par pipettage. </li><li> Incuber la plaque de manière statique à 25 ° C pendant 30 min. Enregistrez la valeur d&#39;absorbance à 510 nm à l&#39;aide d&#39;un lecteur de plaques. </li><li> Calculer la concentration de glucose en utilisant une courbe d&#39;étalonnage obtenue à partir des normes de glucose. NOTE: La concentration de glycogène dans le lysat cellulaire est exprimée en concentration de glucose (μg / mL). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les étapes critiques dans le protocole sont la précipitation et la resuspension du glycogène. Après centrifugation suite à la précipitation de l&#39;éthanol, le glycogène forme une pastille translucide qui adhère légèrement aux parois des tubes de microcentrifugeuse. Par conséquent, lors de l&#39;élimination du surnageant, une attention particulière doit être accordée afin de ne pas enlever la pastille. La pastille de glycogène est collante, et la solubilisation peut être difficile si elle sèche. Notez que la solubilisa...

Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme principal stock de glucides provenant du CO 2 fixé à la lumière par la photosynthèse. Le glycogène est un glycan consistant en un glucane linéaire α-1,4-lié avec des branches créées par des liaisons glucosyle liées à l&#39;α-1,6. La biosynthèse du glycogène dans les cyanobactéries commence par la conversion du glucose-6-phosphate en ADP-glucose par l&#39;action séquentielle de la phosphoglucomutase et de la pyrophosphorylase ADP-glucose. La fraction de glucose dans ADP-glucose est transférée à l&#39;extrémité non réductrice du squelette α-1,4-glucane du glycogène par une ou plusieurs glycogènes synthases (GlgA). Par la suite, des enzymes de ramification introduisent la liaison glucosyle liée à l&#39;α-1,6, qui est encore étendue pour générer la particule de glycogène. Dans le noir, le glycogène est décomposé par la glycogène phosphorylase, les enzymes débranchantes du glycogène, l&#39;α-glucanotransférase et la malto-dextrine phosphorylase dans le glucose phosphorylé et le glucose libre. Ces flux intLes voies cataboliques, y compris la voie de phosphate de pentose oxydante, la voie d&#39;Embden-Meyerhof-Parnas (glycolyse) et la voie de Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 . Le métabolisme du glycogène dans les cyanobactéries a suscité un intérêt croissant au cours des dernières années en raison de la possibilité que les cyanobactéries se développent dans des usines de cellules microbiennes entraînées par la lumière du soleil pour produire des produits chimiques et des combustibles. Le métabolisme du glycogène pourrait être modifié pour augmenter le rendement des produits, car le glycogène est le plus grand pool de carbone flexible de ces bactéries. Un exemple est la cyanobactérie Synechococcus sp. PCC 7002, qui a été génétiquement conçu pour produire du mannitol; La rupture génétique de la synthèse du glycogène augmente le rendement en mannit 3 fois 5 . Un autre exemple est la production de bioéthanol à partir de cellules sauvages chargées de glycogèneYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . La teneur en glycogène des cellules de type sauvage peut représenter jusqu&#39;à 60% du poids sec de la cellule pendant la famine par l&#39;azote 6 . Notre compréhension du métabolisme et de la régulation du glycogène a également été élargie ces dernières années. Alors que le glycogène est connu pour s&#39;accumuler dans la lumière et être catabolisé dans l&#39;obscurité, la cinétique détaillée du métabolisme du glycogène pendant le cycle diel n&#39;a été révélée que récemment dans Synechocystis sp. PCC 6803 7 . En outre, plusieurs gènes affectant l&#39;accumulation de glycogène ont été identifiés. Un exemple notable est la découverte que la putative histidine kinase PmgA et l&#39;ARN non codant PmgR1 forment une cascade régulatrice et contrôlent l&#39;accumulation de glycogène. Fait intéressant, les mutants de suppression de pmgA et pmgR1 accumulent deux fois plus de glycogène que la souche de type sauvage de Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . D&#39;autres éléments réglementaires sont également connus pour affecter l&#39;accumulation de glycogène, y compris le facteur de sigma alternatif E et le facteur de transcription CyAbrB2 10 , 11 . À mesure que l&#39;intérêt pour la régulation du glycogène et le métabolisme augmente, un protocole détaillé décrivant la détermination de la teneur en glycogène est justifié. Plusieurs méthodes sont utilisées dans la littérature. L&#39;hydrolyse acide suivie de la détermination de la teneur en monosaccharides par une chromatographie liquide à échange d&#39;anions haute pression associée à un détecteur ampérométrique pulsé ou à une détermination spectrométrique après des traitements avec de l&#39;acide et du phénol sont des méthodes largement utilisées pour rapprocher la teneur en glycogène 9 , 10 , 12 , 13 . Cependant, une chromatographie liquide à échange d&#39;anions haute pressionL&#39;instrument c est très coûteux et ne distingue pas le glucose dérivé du glycogène de celui dérivé d&#39;autres glycoconjugués contenant du glucose, tels que le saccharose 14 , le glucosylglycérol 15 et la cellulose 16 , 17 , 18 , qui sont connus pour s&#39;accumuler dans certaines espèces de cyanobactéries. La méthode acide-phénol peut être effectuée en utilisant des équipements de laboratoire standard. Cependant, il utilise des réactifs hautement toxiques et ne distingue pas le glucose dérivé de différents glycoconjugués, ni distingue le glucose des autres monosaccharides qui constituent des matériaux cellulaires tels que les glycolipides, les lipopolysaccharides et les matrices extracellulaires 12 . Notamment, le dosage acide acide-phénol est souvent utilisé pour la détermination de la teneur totale en glucides plutôt que pour la détermination spécifique de la teneur en glucose 12 . Enzymatic hyL&#39;hydrolyse du glycogène en glucose par l&#39;α-amyloglucosidase suivie de la détection du glucose par un dosage couplé à une enzyme génère une lecture colorimétrique hautement sensible et spécifique au glucose dérivé du glycogène. La spécificité peut être renforcée avec la précipitation préférentielle du glycogène à partir des lysats cellulaires par l&#39;éthanol 5 , 8 , 19 . Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour un dosage enzymatique du contenu en glycogène dans deux des espèces de cyanobactéries les plus étudiées, Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, dans les souches de type sauvage et mutant. Afin d&#39;assurer une hydrolyse efficace, un cocktail d&#39;α-amylase et d&#39;α-amyloglucosidase est utilisé 8 . L&#39;α-amylase à effet endo hydrolyse les liaisons α-1,4 dans divers glucanes dans les dextrines, qui sont encore hydrolysées tO glucose par ex-action de l&#39;α-amyloglucosidase 20 . Les effets synergiques de ces enzymes sont bien connus, et ces enzymes sont habituellement utilisées pour l&#39;hydrolyse sélective de l&#39;amidon, qui est un glucane glycogène tel que glycogène, sans affecter d&#39;autres glycoconjugants, comme la cellulose, dans la biomasse végétale 21 . Le glucose libéré est détecté quantitativement suite à un essai couplé par une enzyme consistant en glucose oxydase - qui catalyse la réduction de l&#39;oxygène au peroxyde d&#39;hydrogène et l&#39;oxydation du glucose à une lactone et à la peroxydase - qui produit un colorant de quinoneimine de couleur rose provenant du peroxyde d&#39;hydrogène, Un composé phénolique et la 4-aminoantipyrine 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td> Lecteur de microplaques <td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190&nbsp ;</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Eliza lecteur</td></tr><tr><td>de plaques Bullet Blender Storm</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Batteur à billes</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro Spectrophotomètre UV/Visible Amersham</td><td>Biosciences</td><td>NA</td><td>Spectrophotomètre</td></tr><tr><td>Tris&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>Ajustement du pH</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>Enzyme pour la dépolymérisation du glycogène</td></tr><tr><td>&alpha ;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzyme pour la dépolymérisation du glycogène</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Étalon pour le dosage du glucose</td></tr><tr><td>Pierce BCA Kit de dosage des protéines&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>Pour la détermination des concentrations en protéines</td></tr><tr><td>Plateaux de séchage en aluminium, jetables</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>Pour la détermination du poids sec des cellules</td></tr><tr><td>D-Glucose taya kit (format GODPOD)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>Pour la détermination des concentrations de glucose</td></tr><tr><td>Pains d’oxyde de zirconium, 0,15 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Perles pour la lyse cellulaire dans un Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td>Tubes RINO</td><td>Next Advance</td><td>NA</td><td>pour la lyse cellulaire dans un Bullet Blendar Storm</td></tr></tbody></table>

détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme stockage majeur de carbone et d&#39;énergie intracellulaire pendant la photosynthèse. Les développements récents dans la recherche ont mis en évidence des mécanismes complexes du métabolisme du glycogène, y compris le cycle diels de la biosynthèse et du catabolisme, la régulation redox et l&#39;implication de l&#39;ARN non codant. Dans le même temps, des efforts sont faits pour rediriger le carbone du glycogène vers des produits désirables dans des cyanobactéries génétiquement modifiées pour améliorer les rendements des produits. Plusieurs méthodes sont utilisées pour déterminer le taux de glycogène dans les cyanobactéries, avec des précisions variables et des complexités techniques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la détermination fiable de la teneur en glycogène dans les cyanobactéries qui peuvent être effectuées dans un laboratoire de sciences de la vie standard. Le protocole implique la précipitation sélective du glycogène à partir du lysat cellulaire et la dépolymérisation enzymatique du glycogène pour générer des monomères de glucose, qui sont détectés par un bœuf de glucoseIdase-peroxydase (GOD-POD) couplé à l&#39;enzyme. La méthode a été appliquée à Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, deux types d&#39;espèces de cyanobactéries largement utilisées dans l&#39;ingénierie métabolique. En outre, la méthode a montré avec succès des différences dans les teneurs en glycogène entre le type sauvage et les mutants défectueux dans les éléments régulateurs ou les gènes de biosynthèse du glycogène.

10 ml de Synechocystis sp. Le PCC 6803 a été cultivé dans des conditions photoautotrophiques jusqu&#39;à ce que la valeur de la DO 730nm atteigne environ 0,8. Les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans du Tris-HCl 50 mM, pH 8. La valeur de la DO730nm a été ajustée à 2-3. La teneur en glycogène a été analysée selon le protocole décrit ci-dessus. La teneur en glycogène par OD 730nm était de 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730nm (...

Ici, nous présentons un dosage fiable et facile pour mesurer la teneur en glycogène dans les cellules cyanobactériennes. La procédure implique des précipitations, une dépolymérisation sélectionnable et la détection de résidus de glucose. Cette méthode est appropriée pour les souches de type sauvage et génétiquement modifiées et peut faciliter l&#39;ingénierie métabolique des cyanobactéries.

Détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la teneur en glycogène chez les cyanobactéries à l'aide d'une hydrolyse sélective enzymatique et d'un dosage. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine des cyanobactéries, notamment en physiologie, en génétique moléculaire et en bioingénierie de différentes souches de cyanobactéries étudiées. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est adaptée à une échelle réduite, facile à réaliser, et qu'elle présente une grande sensibilité et une spécificité élevée pour le glycogène.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les cyanobactéries, elle peut également être appliquée à d'autres micro-organismes accumulant du glycogène ou de l'amidon, tels que E. coli, les levures, les microalgues et divers micro-organismes hétérotrophes et phototrophes. Commencez ce protocole par la préparation des cultures de cyanobactéries, comme décrit dans le protocole textuel. Transférez un millilitre de culture de cyanobactéries ou de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre.Ensuite, centrifuger à 6 000 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Éliminer le surnageant avant de resuspendre le culot dans un millilitre de Tris-HCl 50 millimolaire, pH 8. Centrifuger le culot resuspendu comme précédemment.Jetez le surnageant et resuspendez à nouveau le culot cellulaire dans le tampon Tris-HCl. Centrifugez les tubes comme précédemment et jetez le surnageant. Resuspendez ensuite complètement le culot dans 500 microlitres de tampon Tris-HCl 50 millimolaire, pH 8.Il est essentiel que le culot soit bien en suspension pour une lyse efficace. Maintenir la resuspension sur glace. Lysér les cellules resuspendues à quatre degrés Celsius par 30 cycles d'ultrasonication, chaque cycle comprenant 30 secondes à une fréquence de 20 kilohertz avec une amplitude maximale, suivies de 90 secondes sans traitement.Centrifuger le tube contenant le lysat à 6 000 × g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après la centrifugation, le culot doit contenir principalement de gros débris cellulaires, et le surnageant est utilisé pour des analyses supplémentaires. À ce stade, déterminer la concentration en protéines à l’aide du kit d’analyse des protéines.Éliminer la chlorophylle a du lysat cellulaire en mélangeant 900 microlitres d'éthanol et 100 microlitres du surnageant obtenu dans un tube de 1,5 millilitre à vis. Après avoir fermé le bouchon, chauffer le tube à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes à l'aide d'un bloc chauffant de laboratoire standard. Incuber ensuite le tube dans de la glace pendant 30 minutes.Ensuite, centrifuger le tube à 20 000 ×g et à 4 °C pendant 30 minutes. Après la centrifugation, retirer soigneusement le surnageant. Le culot contient du glycogène.Séchez légèrement le culot à l'air pour éliminer l'excès d'éthanol. N'asséchez pas excessivement le culot afin d'éviter des difficultés lors de sa dissolution. Mesurez l'absorbance à 666 nanomètres du surnageant obtenu pour déterminer la teneur en chlorophylle a.La valeur peut être utilisée pour normaliser la teneur en glycogène. Dissoudre le culot dans 100 microlitres de 50 millimolaire d'acétate de sodium à pH cinq. Mélanger soigneusement ces composants à l'aide d'un vortex.Le mélange par pipetage n'est pas recommandé car le mélange est visqueux. Ajoutez également 50 microlitres d'amyloglucosidase à huit unités par millilitre et 50 microlitres d'alpha-amylase à deux unités par millilitre. Ensuite, incubez le mélange à 60 degrés Celsius dans un bloc chauffant pendant deux heures afin de permettre la digestion du glycogène en molécules de glucose.Après l'incubation, centrifuger l'échantillon à 20 000 fois g pendant cinq minutes et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Mesurer la concentration en glucose dans le surnageant après hydrolyse enzymatique, en utilisant le réactif GOD-POD. Transférer 100 microlitres du surnageant provenant de l'étape de précipitation du glycogène dans une cavité d'une plaque de 96 puits.En tant que témoin négatif, utilisez 100 microlitres de 50 millimolaire d'acétate de sodium à pH cinq. Pour générer la courbe d'étalonnage, mesurez également les solutions étalons de glucose. Ajoutez 150 microlitres de réactif GOD-POD à chaque échantillon et mélangez rapidement à l'aide d'une pipette.Incuber la plaque à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, enregistrer la valeur d'absorbance à 510 nanomètres, à l'aide d'un lecteur de plaques. Calculer la quantité de glycogène en équivalent glucose, à l'aide d'une courbe d'étalonnage obtenue à partir des étalons de glucose.Les teneurs en glycogène chez Synechocystis sont présentées ici. Deux souches mutantes, delta pmg A et delta pmg R, connues pour hyperaccumuler le glycogène, ont été comparées à la souche sauvage. Comme prévu, les souches mutantes ont montré des niveaux élevés de glycogène.En revanche, un mutant dépourvu de synthase du glycogène n’a pas accumulé de glycogène. Les souches utilisées ici ont été conçues pour produire du mannitol. Notamment, le mutant de la synthase du glycogène a produit plus de mannitol que la souche témoin, ce qui suggère que l'hydrate de carbone synthétisé par la photosynthèse est redirigé vers le mannitol dans la souche mutante incapable de synthétiser le glycogène.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de déterminer quantitativement la teneur en glycogène chez les cyanobactéries en cinq heures. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de bien resuspendre les cellules et de solubiliser complètement les culots de glycogène afin d'obtenir des résultats fiables. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que des dosages de l'activité d'enzymes métaboliques, peuvent être réalisées à l'aide des lysats cellulaires restants afin de répondre à d'autres questions, comme la régulation du métabolisme des glucides chez les cyanobactéries.

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Cette vidéo décrit un test spectrophotométrique pour l’estimation de l’activité de la glycogène synthase. La méthode repose sur la réduction de l’absorbance du NADH avec le temps et indique l’activité de la glycogène synthase.

Dosage spectrophotométrique pour déterminer l’activité de la glycogène synthase

Dans cette vidéo, nous décrivons un test spectrophotométrique qualitatif pour déterminer l’étendue de la ramification dans un échantillon de glycogène avec une structure non caractérisée. La comparaison des maxima d’absorbance de l’échantillon non caractérisé avec celle des polysaccharides avec des structures ramifiées connues indique la présence de ramifications dans l’échantillon non caractérisé.

Test de ramification du glycogène pour mesurer le degré de ramification du glycogène

Nous décrivons ici une méthode biochimique précis, reproductible et pratique pour le titrage de glycogène in vitro. Cette technique utilise la trousse de dosage Abcam glycogène et est basé sur l'hydrolyse successive du glycogène en glucose et glucose titrage par fluorescence.

Titration biochimique de glycogène<em&gt; In vitro</em

Nous présentons ici un protocole pour déterminer quantitativement le contenu de phycobiliprotein dans la cyanobactérie Synechocystis en utilisant une méthode spectrophotométrique. La procédure d’extraction a été appliquée avec succès à d’autres souches de cyanobactéries et les algues ; Toutefois, en raison des variations dans les spectres d’absorption de pigment, il est nécessaire de tester les équations spectrophotométriques pour chaque souche individuellement.

Dosage spectrophotométrique du Phycobiliprotein en cyanobactérie Synechocystis

Ici, des protocoles pour l'isolement des polymères de glucides libérés de cyanobactérien et l'isolement de leurs exoprotémomes sont décrits. Les deux procédures incarnent des étapes clés pour obtenir des polymères ou des protéines avec des degrés de haute pureté qui peuvent être utilisés pour une analyse ou des applications plus approfondies. Ils peuvent également être facilement adaptés en fonction des besoins spécifiques de l'utilisateur.

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outward

Des techniques pour mesurer l’activité des enzymes clés du métabolisme du glycogène sont présentées, à l’aide d’un spectrophotomètre simple fonctionnant dans la plage visible.

Méthodes spectrophotométriques pour l’étude du métabolisme du glycogène eucaryote

Une concentration optimale de saccharose a été déterminée pour l’extraction du glycogène hépatique à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité de saccharose. L’ajout d’une étape d’ébullition de 10 minutes pour inhiber les enzymes dégradant le glycogène s’est avéré bénéfique.

L’extraction des molécules de glycogène hépatique pour la détermination de la structure du glycogène

Le protocole actuel détaille l’isolement des phycobilisomes des cyanobactéries par centrifugation à travers un gradient de densité de saccharose discontinu. Les fractions de phycobilisomes intacts sont confirmées par le spectre d’émission fluorescent 77K et l’analyse SDS-PAGE. Les fractions phycobilisomes résultantes conviennent à la coloration négative de la TEM et à l’analyse par spectrométrie de masse.

Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries

Dans le présent protocole, la technique d’électrophorèse des glucides assistée par fluorophore (FACE) est utilisée pour déterminer la distribution de la longueur de la chaîne (CLD) et la longueur moyenne de la chaîne (ACL) du glycogène.

Détermination de la distribution de la longueur de la chaîne de glucane du glycogène à l’aide de la méthode d’électrophorèse des glucides assistée par fluorophore (FACE)

L’adsorption peptidique sur des objets en plastique lors de dilutions en série traditionnelles basées sur des pointes peut avoir un impact significatif sur la détermination de l’activité et confondre la compréhension des relations structure-activité utilisées pour les phases d’identification et d’optimisation des pistes de découverte de médicaments. Ici, des méthodes de dilution en série acoustique automatisée sans contact d’échantillons de peptides sont décrites.

Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays

Découvrez une méthode enzymatique simple et sensible pour mesurer le contenu en glycogène dans les cyanobactéries. Cette technique facilite la recherche en physiologie, génétique moléculaire et ingénierie métabolique.

Détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries

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