Visualisation quantitative de l'infiltration de leucocytes dans un modèle murin de myocardite fulminante par microscopie à feuilles lumineuses

L’objectif global de ce protocole est d’éliminer chimiquement le cœur d’une souris, avec une arythmie cardiaque induite, pour une visualisation de l’infiltration cardiaque leucocytaire de l’organe entier par microscopie à feuillet de lumière à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les prothèses et les structures d’organes entiers au niveau de la résolution cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à la fois de quantifier et de localiser l’inflammation dans des organes entiers.

Donner des détails à l’intérieur dans une prothèse neurologique. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avions un besoin urgent d’un outil de visualisation pour identifier les explications cellulaires de l’arythmie cardiaque dans le module d’épuisement. Après l’exposition du cœur d’une souris de huit à 10 semaines, utilisez un cathéter de calibre 21 et pénétrez dans le ventricule droit.

Inciser l’aorte pour permettre le drainage sanguin, puis perfuser avec cinq millilitres de PBS plus EDTA, avec une pression lente et constante. Suivez l’EDTA PBS avec cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4 %. À la fin de la perfusion, utilisez une pince dentelée pour saisir doucement le cœur fixe et tirez l’organe légèrement vers le haut pour couper toutes les connexions tissulaires.

Y compris les artères et les veines entrantes et sortantes. Ensuite, conservez le cœur pendant quatre heures dans du PFA frais à 4 % pour une fixation supplémentaire. Pour déshydrater le tissu, incubez le cœur dans une série ascendante d’éthanol, dans des tubes de réaction en polypropylène noir de cinq millilitres dans l’obscurité, avec une rotation lente constante sur un rotateur de tube, pour éviter la formation de bulles d’air.

Ensuite, nettoyez le tissu avec une incubation à 98 % d’éther dibenzylique avec une rotation constante pendant la nuit. Pour effectuer une microscopie à fluorescence à feuillet de lumière, placez d’abord des blocs d’agarose déshydratés dans le porte-échantillon standard, afin de maintenir l’échantillon en place. Ensuite, transférez l’échantillon sur le porte-échantillon.

Ensuite, transférez le porte-échantillon dans une cuvette remplie d’éther dibenzylique de taille appropriée. Utilisez les paramètres de filtre d’excitation et d’émission appropriés pour détecter les signaux de fluorescence d’intérêt. Le positionnement et la fixation corrects de l’échantillon sont donc fondamentaux pour minimiser les effets d’ombrage pendant l’imagerie.

De plus, un échantillon lâche peut provoquer des artefacts en mouvement, qui sont difficiles à éclairer pendant le post-traitement. Après avoir requis toutes les images, ouvrez le logiciel d’analyse de traitement d’images 3D et 4D approprié, puis sélectionnez surpasser. Choisissez fichier et ouvrir, puis sélectionnez le dossier contenant les données du premier canal acquis pour ouvrir les piles d’images.

Sélectionnez Modifier et ajouter des canaux pour ajouter les données de canal fluorescent acquises appropriées. Ensuite, cliquez sur Modifier et sélectionnez Propriétés de l’image, pour corriger les dimensions de voxel x, y et z. Réglage des paramètres dans la fenêtre qui vient de s’ouvrir.

Pour régler les signaux fluorescents, ouvrez d’abord le menu d’édition et sélectionnez, afficher le réglage de l’affichage. Une nouvelle fenêtre affiche très tous les canaux ouverts. Pour changer le canal d’autofluorescence en niveaux de gris, sélectionnez le canal d’autofluorescence, choisissez le style d’affichage blanc et cliquez sur OK.

Ensuite, ajustez la vue en supprimant la grille. Ensuite, zoomez et désélectionnez un canal. Ensuite, ajustez la valeur du niveau de noir pour exclure tout signal d’arrière-plan indésirable qui ne représente pas les structures de l’échantillon, l’intensité du signal et le contraste.

Ajustez le canal permanent de l’anticorps par rapport au signal du canal d’autofluorescence révisé. Réglage du mode de canal, fire pour définir la visualisation du signal d’anticorps sur une table de correspondance de couleurs de carte thermique. Ensuite, sélectionnez le mode de fusion, pour visualiser les structures tissulaires en détail.

Pour ouvrir virtuellement l’orgue, avant l’exportation de la scène 3D, sélectionnez l’icône du plan de coupe dans la liste des objets. Un cadre jaune et un manipulateur de broche blanc apparaîtront dans la vue de l’image. Utilisez la souris pour faire pivoter l’axe à l’extrémité la plus fine, pour changer l’orientation du plan de découpe et déplacer la partie centrale la plus épaisse de l’axe pour sélectionner la profondeur de découpe souhaitée.

Ensuite, décochez les cases correspondantes pour masquer le cadre et le manipulateur et créer les instantanés souhaités. L’acquisition d’une pile d’images entière, composée de deux signaux de canaux fluorescents, permet d’obtenir un rendu 3D artificiel, dans lequel la distribution des leucocytes est affichée dans une vue de carte thermique. Les zones fortement enflammées du cœur d’un animal traité à la toxine diphtérique peuvent être perçues par leur aspect rougeâtre et blanchâtre.

Particulièrement dans les régions du système de conduction cardiaque, telles que le faisceau ventriculaire auriculaire et les fibres de Purkinje. En revanche, les cœurs d’animaux contrôlés traités au PBS ne présentent pas ce schéma d’inflammation. Une fois maîtrisée, cette technique permet l’analyse numérique d’un organe cible, de son prélèvement à sa restitution assistée par ordinateur en quatre à cinq jours.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’emmenologie, pour explorer les modèles de distribution cellulaire dans des organes entiers de souris. Cela peut vieillir dans l’analyse et le traitement d’une variété de prothèses de maladies physiopathologiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’organes de souris entiers pour la microscopie à fluorescence et de la génération et du traitement d’empilements de données 3D.