Une méthode de calcul pour quantifier l’activité circadienne mouche

Chez la plupart des animaux, les horloges circadiennes orchestrent les processus comportementaux et moléculaires et les synchronisent avec le cycle quotidien lumière-obscurité. Chez les mouches des fruits, l’horloge est généralement étudiée à l’aide d’enregistrements locomoteurs. Voici un exemple de locomotion moyenne de type sauvage mesurée en 12 heures de lumière, 12 heures d’obscurité, le cycle lumière-obscurité étant illustré par une barre jaune-noir en haut.

Un enregistrement typique à la mouche montre un modèle biomodal complexe avec deux pics d’activité, un pic matinal qui se produit à l’aube et un pic du soir qui se produit au crépuscule. Ces deux pics forment ensemble une forme d’onde très différente des oscillations sinusoïdales observées dans les gènes de l’horloge, ce qui suggère que les mécanismes, en plus de l’horloge, ont un effet profond sur la production du modèle observé dans les données comportementales. Nous présentons ici la première méthode qui décrit mathématiquement les motifs temporels dans l’activité des mouches.

Nous ajustons les données d’activité avec une forme d’onde de modèle qui imite la locomotion des mouches. Notre modèle se compose de quatre termes exponentiels, deux termes du pic du matin et deux termes du pic du soir. Avec la période circadienne, notre modèle comporte neuf paramètres indépendants.

Les paramètres B définissent le taux de lever du matin, de décroissance du matin, de lever du soir et de décroissance du soir. TM et TE définissent les largeurs des pics du matin et du soir, et HM et HE définissent les hauteurs des pics. Ensemble, ces paramètres décrivent pleinement la taille et la forme des pics du matin et du soir dans le modèle d’activité.

Notre méthode peut être appliquée pour élucider les mécanismes et le substrat qui sous-tendent le modèle d’activité bimodale couramment observé dans les lectures locomotrices des mouches. Pour l’expérience de locomotion, préparez des tubes individuels avec de la nourriture à une extrémité et du coton à l’autre. Pour cela, mettez d’abord cinq à six grammes de nourriture contre les mouches dans un bécher de 50 millilitres.

Coupez les aliments en petits morceaux, il sera donc plus facile de les faire fondre au micro-ondes. Le moniteur d’activité unique peut s’adapter à 32 tubes individuels. Par conséquent, prenez 32 tubes et connectez-les ensemble à l’aide d’un élastique.

Faites fondre les aliments dans le bécher au micro-ondes. Faites chauffer les aliments pendant environ 10 à 15 secondes. Arrêtez le micro-ondes toutes les cinq secondes et secouez un peu le bécher avec de la nourriture pour assurer une fonte uniforme des aliments.

Assurez-vous que tous les aliments sont fondus et qu’il ne reste plus de morceaux de nourriture solides dans le bécher. Pendant que les aliments sont encore liquides, insérez des tubes dans le bécher avec des aliments. Déplacez les tubes de haut en bas un peu, afin qu’ils soient remplis de manière égale.

Laissez les aliments refroidir et se solidifier pendant environ une heure. Une fois que les aliments sont solides, retirez les tubes du bécher en utilisant un mouvement de rotation afin qu’ils ne collent pas au fond du bécher. Retirez ensuite l’élastique.

Scellez l’extrémité avec de la nourriture avec de la cire. Pour cela, essuyez d’abord soigneusement le tube à l’aide d’une serviette en papier. Appuyez ensuite le tube contre la cire.

Vérifiez visuellement la qualité de l’étanchéité et, si nécessaire, répétez l’étanchéité. À l’aide de cette technique, scellez tous les tubes pour l’expérience. L’autre extrémité des tubes se ferme avec le coton.

Le coton laissera passer l’air tout en gardant les mouches enfermées à l’intérieur des tubes. Il est également facile à retirer et à remettre, ce qui sera utile lorsque nous chargerons les tubes avec les mouches pour l’expérience. Maintenant, une fois que les tubes sont prêts, chargez-les avec des mouches pour l’expérience.

Pour cela, déchargez les mouches sur le pad avec du CO2. Ensuite, à l’aide d’une brosse, placez soigneusement une mouche dans chaque tube individuel. Mettez le tube avec la mouche dans le moniteur.

Dans le même ordre que dans le moniteur, la locomotion du vol sera enregistrée dans le fichier de sortie par le système de contrôle. Connectez le moniteur à l’ordinateur et placez-le dans un incubateur qui maintient une température et une humidité constantes. Sur la base de l’expérience, réglez les conditions de lumière/obscurité appropriées.

Pour une expérience lumière/obscurité, gardez les mouches dans le cycle lumière-obscurité pendant toute l’expérience. N’utilisez pas le premier jour des mesures dans l’analyse. Pour une expérience d’obscurité constante, gardez d’abord les mouches pendant deux jours dans des conditions de lumière/obscurité pour l’entraînement et la synchronisation des horloges, puis passez à l’obscurité constante.

N’utilisez pas les mesures du premier jour d’obscurité constante dans l’analyse. Avant de passer à la section suivante, nous vous recommandons de lire le protocole. Le système de surveillance produira un seul fichier contenant l’activité de toutes les mouches dans le moniteur.

Les 32 dernières colonnes du fichier de sortie contiennent l’activité des mouches individuelles. Notre programme fonctionne avec des activités de mouche unique. Par conséquent, divisez le fichier de sortie en plusieurs fichiers d’activité à un seul vol.

Chaque fichier doit être un fichier TXT à une seule colonne. Maintenant, après avoir préparé les fichiers d’activité, nous pouvons exécuter notre analyse. Exécutez la fonction ModelFitPS3 dans la fenêtre de commande MATLAB avec les paramètres d’entrée suivants.

Taux d’échantillonnage, mettez l’intervalle de temps de l’échantillon de données en secondes. Par exemple, nos données ont été prises avec un taux d’échantillonnage de 20 secondes. Par conséquent, nous en mettons 20 ici.

En tant qu’intervalle de rang, placez l’intervalle de temps en minutes, auquel les données seront regroupées pour une meilleure visualisation. Nous recommandons de limiter le binning à 20 ou 30 minutes, mais, pour l’instant, je vais en mettre 10 ici, juste pour vous montrer plus tard comment il peut être facilement modifié. Pour la tendance, mettez un si les données montrent la tendance de base et zéro sinon.

Nos données n’ont pas de tendance de base. Par conséquent, je mets zéro ici. Appuyez sur Entrée pour exécuter la fonction.

Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le fichier d’activité à mouche unique et appuyez sur Ouvrir. Le programme calculera et tracera le spectre de puissance des données. Dans cette fenêtre, déterminez la période principale dans les données.

Pour cela, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le pic de la période circadienne ou avec le bouton droit de la souris sur le pic de la deuxième harmonique, répliqué approximativement à la période circadienne divisée par deux. Dans notre cas, le pic à la deuxième harmonique est beaucoup plus grand et plus net que le pic à la période circadienne. Par conséquent, nous utilisons la deuxième option.

Ensuite, le programme tracera les données regroupées dans l’intervalle de bac sélectionné. Comme vous pouvez le voir, à 10 minutes d’intervalle, les pics du matin et du soir ne sont pas très bien visualisés. Par conséquent, nous voulons modifier cette valeur.

Pour ce faire, il suffit de cliquer avec le bouton droit de la souris n’importe où sur le graphique. Dans la boîte de dialogue nouvelle, tapez la nouvelle valeur de l’intervalle de rangement. Nous recommandons le binning à un intervalle de temps de 20 minutes.

Par conséquent, nous en mettons 20 ici. Appuyez sur OK. Le programme redessine immédiatement les données avec la nouvelle valeur de l’intervalle bin. Pour accepter cette valeur, il suffit de cliquer avec le bouton gauche de la souris n’importe où sur le graphique.

Le programme va maintenant redessiner les données et n’afficher que cinq jours de mesure. Cette fenêtre permet de sélectionner le premier pic matinal qui sera utilisé dans l’analyse. Parfois, il est nécessaire de sauter d’abord un ou deux jours, ce qui prend à la mouche pour s’adapter au cycle lumière-obscurité.

Pour sélectionner le pic du matin, cliquez simplement sur le pic préféré. Le programme redessinera les données et n’affichera plus que trois jours de mesures à partir du pic matinal sélectionné. Les lignes verticales bleues et rouges indiquent le premier pic du soir et le deuxième pic du matin en fonction de la période sélectionnée dans la première fenêtre.

Dans cette fenêtre, sélectionnez le point utilisé par le tube pour l’ajustement préliminaire des données avec la fonction modèle. Pour cela, cliquez sur les points suivants dans cet ordre particulier. Tout d’abord, cliquez sur le haut du premier pic du matin.

Le clic est indiqué par l’étoile rouge en bas, indiquant l’emplacement du clic. Cliquez ensuite sur la fin du pic du matin, puis sur le début du pic du soir, puis sur le sommet du pic du soir, puis sur la fin du pic du soir, et enfin sur le sommet du pic du matin du lendemain. Le programme tracera à nouveau le spectre de puissance puisque les paramètres finaux sont obtenus à partir de l’ajustement spectral.

Le spectre est maintenant représenté en fréquence sur l’axe des x, et le pic circadien est situé sur le côté gauche du graphique. La période déterminée à la première étape est indiquée par une ligne verticale rouge. Pour sélectionner les points de raccordement, déterminez d’abord grossièrement la période principale.

Pour cela, faites un clic gauche sur le pic de la période circadienne, ou faites un clic droit sur le pic de la deuxième harmonique. Nous utiliserons à nouveau la deuxième option. Après cela, un curseur apparaîtra en bas pour sélectionner les points pour l’ajustement spectral.

Les points seront affichés par des cercles rouges et apparaîtront après avoir déplacé le curseur. Déplacez le curseur vers la gauche et la droite, et placez les points aussi près que possible du sommet des pics spectraux. Une fois la meilleure image obtenue, appuyez sur le bouton Accepter et le programme ajustera les points sélectionnés avec l’expression analytique du spectre de puissance du modèle.

Après l’ajustement, le programme produira deux autres graphiques. Tout d’abord, il y a un spectre de puissance du modèle construit avec les paramètres extraits. Deuxièmement, les données fournies avec le modèle.

Les données sont indiquées par une ligne noire et le modèle est représenté par une ligne rouge. On peut voir que la fonction ressemble beaucoup aux données, en particulier aux trois derniers jours d’activité. Les paramètres extraits sont enregistrés dans le fichier TXT des paramètres d’ajustement du modèle.

Après le nom du fichier, les paramètres sont enregistrés dans l’ordre suivant, d’abord b de la décroissance matinale, puis b du lever du matin, b du lever du soir, b de la décroissance du soir, période circadienne, puis largeur du pic du matin divisée par la période circadienne, largeur du pic du soir divisée par la période circadienne, hauteur du pic du matin, hauteur du pic du soir et l’erreur d’ajustement de l’ajustement spectral. En plus du fichier de paramètres d’ajustement du modèle, le programme produira également deux autres fichiers. Tout d’abord, les données sont-elles ajustées à la fonction du modèle, et deuxièmement, est-ce un ajustement spectral.

Effectuez cette analyse avec d’autres fichiers d’activité. Tous les paramètres extraits sont enregistrés dans le fichier TXT des paramètres d’ajustement du modèle et peuvent être utilisés pour connecter la sortie comportementale aux mécanismes sous-jacents qui régulent le comportement quotidien des mouches contrôlé par le modèle d’activité du modèle.