Une méthode de calcul pour quantifier l’activité circadienne mouche

Chez la plupart des animaux, les horloges circadiennes orchestrent les processus comportementaux et moléculaires et les synchronisent avec le cycle jour-nuit. Chez les mouches à fruits, l’horloge est généralement étudiée à l’aide d’enregistrements de locomotion. Voici un exemple de locomotion moyenne de type sauvage mesurée dans un cycle de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité, le cycle lumière-obscurité étant indiqué par une barre jaune-noire en haut.

Un enregistrement typique de drosophile montre un motif complexe, bimodal avec deux pics d'activité, un pic matinal survenant autour de l'aube et un pic vespéral survenant autour du crépuscule. Ces deux pics forment ensemble une onde très différente des oscillations sinusoïdales observées dans les gènes horloges, suggérant que des mécanismes, en plus de l'horloge, ont un effet profond sur la production du motif observé dans les données comportementales. Nous présentons ici la première méthode permettant de décrire mathématiquement les motifs temporels de l'activité des drosophiles.

Nous ajustons les données d'activité à une onde modélisée qui imite la locomotion de la drosophile. Notre modèle comprend quatre termes exponentiels, deux provenant du pic matinal et deux provenant du pic vespéral. Associé à la période circadienne, notre modèle comporte neuf paramètres indépendants.

Les paramètres B définissent la vitesse de la montée matinale, du déclin matinal, de la montée vespérale et du déclin vespéral. TM et TE définissent les largeurs des pics matinal et vespéral, et HM et HE définissent les hauteurs des pics. Ensemble, ces paramètres décrivent complètement la taille et la forme des pics matinal et vespéral dans le motif d'activité.

Notre méthode peut être appliquée pour élucider les mécanismes et le substrat à l'origine du profil d'activité bimodal couramment observé dans les enregistrements de la locomotion des mouches. Pour l'expérience de locomotion, préparez des tubes individuels contenant de la nourriture à une extrémité et du coton à l'autre. Pour ce faire, placez d'abord cinq à six grammes de nourriture pour mouches dans un bécher de 50 millilitres.

Découpez les aliments en petits morceaux afin qu'ils fondent plus facilement au micro-ondes. Un seul moniteur d'activité accueille 32 tubes individuels. Par conséquent, prenez 32 tubes et reliez-les ensemble à l'aide d'un élastique.

Faire fondre l'aliment dans le bécher au micro-ondes. Chauffer l'aliment pendant environ 10 à 15 secondes. Arrêter le micro-ondes toutes les cinq secondes et agiter légèrement le bécher contenant l'aliment pour assurer une fusion uniforme de l'aliment.

Veillez à ce que tous les aliments soient fondus et qu'il ne reste aucune pièce solide dans le bécher. Tandis que les aliments sont encore liquides, insérez les tubes dans le bécher contenant les aliments. Déplacez légèrement les tubes vers le haut et le bas afin qu'ils soient remplis uniformément.

Laisser refroidir l'aliment et se solidifier pendant environ une heure. Une fois l'aliment solidifié, retirer les tubes du bécher en effectuant un mouvement de rotation afin que l'aliment n'adhère pas au fond du bécher. Ensuite, retirer l'élastique.

Fermez l'extrémité avec de la nourriture à l'aide de cire. Pour ce faire, essuyez d'abord soigneusement le tube avec un essuie-tout. Ensuite, appuyez le tube contre la cire.

Vérifiez visuellement la qualité du scellé et, si nécessaire, refaites le scellage. À l'aide de cette technique, scellez tous les tubes destinés à l'expérience. Fermez l'autre extrémité des tubes avec du coton.

Le coton permettra à l'air de circuler tout en empêchant les mouches de sortir des tubes. Il est également facile à retirer et à remettre en place, ce qui sera utile lorsque nous chargerons les tubes avec les mouches pour l'expérience. Maintenant que les tubes sont prêts, chargez-les avec les mouches pour l'expérience.

À cette fin, déposez les mouches sur le plateau à l’aide de CO2. Ensuite, à l’aide d’un pinceau, placez soigneusement une mouche unique dans chaque tube individuel. Insérez le tube contenant la mouche dans le moniteur.

Dans le même ordre que sur le moniteur, la locomotion des mouches sera enregistrée dans le fichier de sortie par le système de surveillance. Connectez le moniteur à l'ordinateur et placez-le dans un incubateur permettant de maintenir une température et une humidité constantes. Selon l'expérience, réglez les conditions d'éclairage appropriées (lumière/obscurité).

Pour l'expérience lumière/obscurité, maintenir les mouches en cycle lumière-obscurité pendant toute la durée de l'expérience. Ne pas utiliser les mesures du premier jour dans l'analyse. Pour l'expérience en obscurité constante, maintenir d'abord les mouches pendant deux jours en conditions lumière/obscurité afin d'assurer l'entraînement et la synchronisation des horloges, puis passer à l'obscurité constante.

Ne pas utiliser les mesures du premier jour de noirceur constante dans l'analyse. Avant de passer à la section suivante, nous recommandons de lire le protocole. Le système de surveillance produira un fichier unique contenant l'activité de toutes les mouches dans le dispositif de surveillance.

Les 32 dernières colonnes du fichier de sortie contiennent l'activité des mouches individuelles. Notre programme fonctionne avec les activités de mouches individuelles. Par conséquent, divisez le fichier de sortie en plusieurs fichiers d'activité de mouches individuelles.

Chaque fichier doit être un fichier TXT à une seule colonne. Maintenant, après avoir préparé les fichiers d'activité, nous pouvons exécuter notre analyse. Exécutez la fonction ModelFitPS3 dans la fenêtre de commande MATLAB avec les paramètres d'entrée suivants.

Taux d'échantillonnage, indiquez l'intervalle de temps de l'échantillon de données en secondes. Par exemple, nos données ont été collectées avec un taux d'échantillonnage de 20 secondes. Nous indiquons donc 20 ici.

En tant qu'intervalle de classe, indiquez l'intervalle de temps en minutes auquel les données seront regroupées pour une meilleure visualisation. Nous recommandons un regroupement par classes de 20 ou 30 minutes, mais, pour l'instant, je vais indiquer 10 ici, simplement pour vous montrer par la suite à quel point il peut être facilement modifié. Pour la tendance, indiquez un si les données présentent une tendance de base et zéro dans le cas contraire.

Nos données ne présentent aucune tendance de base. Par conséquent, j'ai indiqué zéro ici. Appuyez sur Entrée pour exécuter la fonction.

Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez un seul fichier d'activité de drosophile, puis appuyez sur Ouvrir. Le programme calculera et tracera le spectre de puissance des données. Dans cette fenêtre, déterminez la période principale dans les données.

À cette fin, cliquez soit avec le bouton gauche de la souris sur le pic correspondant à la période circadienne, soit avec le bouton droit sur le pic correspondant au deuxième harmonique, répliqué approximativement à la période circadienne divisée par deux. Dans notre cas, le pic du deuxième harmonique est beaucoup plus grand et plus net que celui de la période circadienne. Par conséquent, nous utilisons la seconde option.

Ensuite, le programme tracera les données regroupées selon l'intervalle de classe sélectionné. Comme vous pouvez le voir, avec un intervalalle de classe de 10 minutes, les pics matinal et vespéral ne sont pas très bien visualisés. Nous souhaitons donc modifier cette valeur.

Pour ce faire, cliquez simplement avec le bouton droit n'importe où sur le graphique. Dans la nouvelle boîte de dialogue, saisissez la nouvelle valeur pour l'intervalle de classe. Nous recommandons de regrouper les données selon un intervalle de temps de 20 minutes.

Par conséquent, nous insérons 20 ici. Cliquez sur OK. Le programme redessine immédiatement les données avec la nouvelle valeur de l'intervalle de classe. Pour accepter cette valeur, cliquez simplement avec le bouton gauche n'importe où sur le graphique.

Le programme va maintenant redessiner les données et afficher uniquement cinq jours de mesures. Dans cette fenêtre, sélectionnez le premier pic matinal qui sera utilisé dans l'analyse. Parfois, il est nécessaire de sauter les un ou deux premiers jours, le temps que la mouche s'adapte au cycle lumière-obscurité.

Pour sélectionner le pic du matin, cliquez simplement sur le pic souhaité. Le programme redessinera les données et affichera désormais uniquement trois jours de mesures à compter du pic du matin sélectionné. Les lignes verticales bleue et rouge indiquent respectivement le premier pic du soir et le second pic du matin, selon la période sélectionnée dans la première fenêtre.

Dans cette fenêtre, sélectionnez le point du tube utilisé pour l'ajustement préliminaire des données avec la fonction du modèle. Pour ce faire, cliquez sur les points suivants dans cet ordre particulier. Cliquez d'abord sur le sommet du premier pic matinal.

Le clic est indiqué par une étoile rouge en bas, montrant l'emplacement du clic. Ensuite, cliquez sur la fin du pic matinal, puis sur le début du pic vespéral, puis sur le sommet du pic vespéral, puis sur la fin du pic vespéral, et enfin sur le sommet du pic matinal du jour suivant. Le programme tracera à nouveau le spectre de puissance, car les paramètres finaux sont obtenus à partir de l'ajustement spectral.

Le spectre est désormais tracé avec la fréquence en abscisse, et le pic circadien se situe sur le côté gauche du graphique. La période déterminée lors de la première étape est indiquée par une ligne verticale rouge. Pour sélectionner les points d'ajustement, déterminez d'abord approximativement la période principale.

Pour cela, cliquez soit avec le bouton gauche sur le pic correspondant à la période circadienne, soit avec le bouton droit sur le pic correspondant au deuxième harmonique. Nous utiliserons à nouveau la deuxième option. Ensuite, un curseur apparaîtra en bas pour sélectionner les points destinés à l'ajustement spectral.

Les points seront affichés par des cercles rouges et apparaîtront après déplacement du curseur. Déplacez le curseur vers la gauche et vers la droite, et positionnez les points aussi près que possible des sommets des pics spectraux. Une fois l'image optimale obtenue, appuyez sur le bouton Accepter, et le programme ajustera les points sélectionnés à l'aide de l'expression analytique du spectre de puissance modèle.

Après l'ajustement, le programme produira deux graphiques supplémentaires. Le premier est un spectre de puissance du modèle construit à l'aide des paramètres extraits. Le second représente les données ajustées avec le modèle.

Les données sont représentées par une ligne noire, et le modèle est représenté par une ligne rouge. On peut observer que la fonction ressemble étroitement aux données, en particulier pour les trois derniers jours d'activité. Les paramètres extraits sont enregistrés dans le fichier TXT des paramètres d'ajustement du modèle.

Après le nom du fichier, les paramètres sont enregistrés dans l'ordre suivant : d'abord le b de la décroissance matinale, puis le b de la croissance matinale, le b de la croissance vespérale, le b de la décroissance vespérale, la période circadienne, puis la largeur du pic matinal divisée par la période circadienne, la largeur du pic vespéral divisée par la période circadienne, la hauteur du pic matinal, la hauteur du pic vespéral, et l'erreur d'ajustement du modèle spectral. En plus du fichier des paramètres d'ajustement du modèle, le programme génère également deux autres fichiers. Le premier contient l'ajustement des données avec la fonction du modèle, et le second un ajustement spectral.

Effectuez cette analyse avec d'autres fichiers d'activité. Tous les paramètres extraits sont enregistrés dans le fichier texte des paramètres d'ajustement du modèle et peuvent être utilisés ultérieurement pour relier la sortie comportementale aux mécanismes sous-jacents régulant le comportement quotidien des mouches, contrôlé par le modèle de motif d'activité.