Transplantation de Schwann des cellules à l’intérieur des Conduits de PVDF-TrFE pour combler les souches moelle épinière sectionnée Rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé

L’objectif global de cette procédure d’intervention chirurgicale est d’utiliser un conduit rempli de cellules de Schwann et de matrice injectable pour établir un pont entre les moignons de la moelle épinière complètement tranquillés afin de favoriser la régénération axonale à travers le pont. Notre objectif est de combler le site d’une lésion de la moelle épinière chez le rat afin de restaurer la fonction. La blessure que nous utilisons est la création d’un espace de transsection complet.

Ce n’est qu’en utilisant ce type de blessure que nous pouvons affirmer avec assurance que les axones se sont régénérés lorsque nous les trouvons sur le site de la blessure. Le pont que nous utilisons est un canal polymère qui contient des cellules de Schwann, les cellules de Schwann étant si importantes pour la régénération des axones. Nous montrons dans cette vidéo comment introduire un tel pont dans un espace de transsection complet.

Les chercheurs novices dans cette méthode auront besoin de pratique, car la section complète de la moelle épinière et l’introduction du conduit peuvent être difficiles pour les débutants. Avant de commencer la procédure, utilisez une lame numéro 10 pour couper le conduit à cinq millimètres. Cela peut également être effectué sous un microscope de dissection si vous préférez.

Pliez doucement le conduit le long du côté longitudinal et utilisez des ciseaux Vannas à bords droits pour découper quatre petites incisions d’environ 0,4 millimètre de long, à au moins un millimètre des ouvertures et à environ un millimètre de distance. Ensuite, dépliez le conduit et coupez entre les deux incisions du même côté pour créer deux fenêtres côte à côte, en vous assurant que les fenêtres peuvent être ouvertes et fermées correctement le long du côté non coupé. Pour effectuer la laminectomie T7-T9, après avoir confirmé une absence de réponse au pincement des orteils chez un rat Fischer femelle anesthésié de 180 à 200 grammes, localisez le point de repère pour les apophyses épineuses T9-T11.

Ils se sentiront comme une petite bosse triangulaire à travers la peau. À l’aide d’une lame numéro 10, faites une incision cutanée médiane de quatre à cinq centimètres de T4 à T11, suivie d’une petite incision dans la couche de graisse superficielle avec des ciseaux incurvés à pointe émoussée. Après avoir disséqué la graisse, utilisez la lame numéro 10 pour localiser les apophyses épineuses T7-T9 et utilisez une pince émoussée pour maintenir le muscle à environ T4. Faites une incision dans le muscle le long de chaque côté des vertèbres de T6 à T10 aussi près que possible des vertèbres pour faire une ouverture nette et causer le moins de blessures possible à l’animal.

Placez l’écarteur autour de T7 à T9. Utilisez la lame numéro 10 pour couper les muscles et les ligaments entre l’apophyse individuelle de T6 à T10 et utilisez un rongeur pour retirer tout muscle ou ligament sur les lames de T7 à T9 aussi latéralement que possible. Lorsque les espaces entre les apophyses transverses de T7 à T9 sont visibles, utilisez le rongeur pour retirer l’apophyse épineuse T9, en soulevant doucement l’apophyse épineuse T8 avec une pince émoussée pour élever la lame T9 au niveau de la petite ouverture entre les apophyses T9 et T10. Ensuite, utilisez le rongeur pour retirer le limbe aussi latéralement que possible, en commençant par l’ouverture et en déplaçant le rostrally à T9. Lorsque toutes les lames ont été enlevées, confirmez que les espaces entre les apophyses transverses sont visibles, en particulier en T8, et examinez les os des deux côtés entre T7 et T9 pour confirmer qu’il n’y a pas de fragments d’os saillants vers l’extérieur et que les racines dorsales devraient devenir visibles.

À l’aide de ciseaux à ressort inclinés, coupez les racines dorsale et ventrale au-dessus et en dessous de T8 et ajoutez une solution saline à la moelle épinière pour aider à arrêter le saignement. Ensuite, placez les ciseaux à ressort inclinés au-dessus de la moelle épinière dans les espaces entre les apophyses transversales en T8 et faites une coupe pour sectionner complètement le tissu nerveux. Placez un petit morceau de mousse compressée dans l’espace de deux à 2,5 millimètres obtenu et ajoutez immédiatement une solution saline à la zone.

En attendant que les moignons du cordon sectionnés atteignent l’hémostase, coupez les triangles d’absorption en longs morceaux minces et retirez un conduit de l’entreposage PBS. Placez quelques triangles dans le conduit pour éliminer l’excès de PBS et confirmez que les fenêtres prédécoupées sont ouvertes. Ensuite, retirez le milieu d’une pastille de GFP Schwann Cell et remettez les Schwann Cells en suspension dans 10 microlitres de DMEM/F-12 froid.

Ajoutez 10 microlitres de gel injectable froid à la suspension cellulaire et mélangez bien avec des pipetages répétés. Ensuite, placez la suspension cellulaire sur de la glace. Lorsque les moignons du cordon sont prêts, retirez la mousse compressée, puis utilisez de longs morceaux des triangles d’absorption pour retirer la solution saline et le sang de la zone de laminectomie.

Ensuite, à l’aide d’une micro spatule, soulevez doucement le moignon rostral et glissez le conduit sur le moignon avec les fenêtres vers le haut, en veillant à ce que tout le moignon soit inséré et qu’il n’y ait pas de saignement excessif dans le conduit. Soulevez doucement le moignon caudal et glissez l’autre extrémité du conduit par-dessus, en veillant à ce que tout le moignon soit inséré et que les fenêtres soient sur la surface dorsale. Ensuite, à l’aide d’une micropipette équipée d’un embout de chargement par western blot, injectez 20 microlitres du mélange de matrice injectable GFP Schwann Cell dans le conduit à travers l’une des fenêtres prédécoupées et fermez les fenêtres.

Une mise en garde. Il est très important que les moignons du cordon soient manipulés aussi rapidement et soigneusement que possible. Un retard peut provoquer un gonflement des moignons, ce qui rend difficile le glissement du conduit sur la moelle épinière, créant ainsi d’autres blessures.

Trois semaines après la transplantation, des images fluorescentes confocales de coupes de tissu rachidien sagittal du cryostat révèlent une distribution uniforme des cellules de Schwann le long et à l’intérieur du conduit, ainsi que des vaisseaux sanguins et des axones myélinisés au centre du pont. La régénération axonale est également étroitement associée à la présence de cellules de Schwann, ce qui confirme l’efficacité de l’utilisation d’un pont de cellules de Schwann dans un conduit structuré pour favoriser la régénération axonale le long du pont entre les moignons rostral et caudal. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être complétée en 45 minutes lorsqu’elle est correctement exécutée.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le traçage EndoRay peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, combien d’axones se régénèrent dans le pont et combien d’entre eux sortent du pont pour rentrer dans la moelle épinière ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transecter la moelle épinière, d’insérer un conduit et d’injecter des cellules dans une matrice pour créer un pont fiable pour la régénération axonale et d’autres évaluations de résultats.