Name: Transplantation de Schwann des cellules à l’intérieur des Conduits de PVDF-TrFE pour combler les souches moelle épinière sectionnée Rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Apprenez une technique chirurgicale pour établir un pont entre les moignons de moelle épinière sectionnée chez le rat en utilisant un conduit rempli de cellules de Schwann et une matrice injectable.

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Nous tenons à remercier le vecteur Viral et les noyaux de l’Animal au projet de Miami à la paralysie de la Cure pour produisant la lenti-GFP-virus et fournissant soins des animaux, respectivement et l’histologie et noyaux d’imagerie pour l’utilisation du cryostat, microscope confocal, et microscope à fluorescence avec stéréo enquêteur. Financement a été assuré par NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) et NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge est le Christine E Lynn distingué professeur de neurosciences.

rats femelles adultes de Fischer (180-200 g de poids corporel) sont logés conformément aux directives NIH et USDA. L’utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Miami et un animalier institutionnel approuvé toutes les procédures animaux.
 1. préparation avant Transplantation <ol><li>préparation Conduit.
	<ol><li>Coupe le conduit à 5 mm de longueur à l’aide d’une lame #10 sous un microscope à dissection. 
		NOTE : Le diamètre intérieur du conduit est entre 2,4 et 2,7 mm ; le diamètre extérieur est de 2,5-2,8 mm.</li>
		<li>Plier le conduit doucement le long de la face longitudinale ( Figure 1 a). Couper quatre petites incisions sur 0,4 mm de long et au moins 1 mm sur les ouvertures du conduit et environ 1 mm d’intervalle à l’aide de straight edge ciseaux de Vannas ( Figure 1 b).
		<ol><li>Déplier le conduit ( Figure 1) et couper entre les deux incisions le long du même côté, créant deux fenêtres côte à côte ( Figure 1). S’assurer que les fenêtres peuvent être ouverts et fermés correctement le long du côté non coupé.</li>
		</ol></li> <li>Stériliser les conduits dans l’éthanol à 75 % pendant 25 min dans un plat de Pétri de 10 cm. Rincer les conduites une fois pendant 4 min avec 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et transférer les conduites avec une pince stérile à une nouvelle boîte de Pétri 10 cm. Rincer les conduits deux fois avec du PBS 1 x pour chaque 25 min.</li>
		<li>Conserver les conduits dans du PBS 1 x jusqu'à l’intervention chirurgicale. 
		Remarque : Plusieurs conduites peuvent être stérilisés à la fois. Stocker les conduites dans des tubes à centrifuger distinct stérile de 1,5 mL pour les garder stérile.</li>
	</ol></li> <li>Green fluorescent protein (GFP)-préparation de la cellule de Schwann (SC) <ol><li>préparer des cultures SC purifiées par les nerfs tibiales de Fischer femelle adulte des rats comme décrit précédemment 43. À la fin de cette étape, plaque les SCs sur la poly-L-lysine (PLL)-enduit Pétri de 10 cm et maintenir dans un milieu D10/3M ; Ces SCs sont définis comme passage 0. 
		NOTE : D10/3M milieu est composé des éléments suivants : 10 % foetale de sérum bovin (FBS), 1 % la pénicilline-streptomycine (stylo/strep), 20 pituitaire µg/mL extrait, 2 µM forskoline, 2,5 nM heregulin dans Dulbecco &#39; s modified Eagle &#39; s moyenne (DMEM).</li>
		<li>Reconstituer avec un milieu frais D10/3M (7 mL/10 cm boîte de Pétri) tous les 3 à 4 jours.</li>
		<li>Culture Split SC lorsqu’elle atteint le confluent de 70 à 80 %.
		<ol><li>Moyen de retirer et de rincer deux fois à Hank &#39; s équilibré de solution saline (HBSS) sans calcium ou magnésium.</li>
			<li>Ajouter 5 mL de 0,25 % de trypsine/EDTA dans chaque boîte de Pétri 10 cm et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
			<li>Ajouter 5 mL de milieu D10 (10 % SVF et 1 % plume/strep en DMEM) dans un tube à centrifuger de 50 mL pour neutraliser la trypsine.</li>
			Solution <li>doucement pipette la trypsine/EDTA dans le Petri plat plusieurs fois pour détacher SCs. Retirer la suspension cellulaire du plat et placez-le dans le tube à centrifuger préparé à l’étape précédente. Rincer le plat avec 5 mL de milieu de D10 et placez-le dans le tube à centrifuger afin d’optimiser la récolte de la cellule.</li>
			<li>Centrifuger les cellules à 370 x g pendant 5 min à 4 o C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu D10/3M 4 mL pour chaque division Pétri.</li>
			<li>Diluer 1 mL de suspension SC et 6 mL de milieu de D10/3M dans un plat de Pétri de 10 cm ; chaque boîte de Pétri de split se traduira par 4 boîtes de Pétri. Ces SCs sont définis comme passage 1.</li>
			<li>Reconstituer avec un milieu frais D10/3M le jour après l’ensemencement et chaque 3-4 jours après l’ensemencement.</li>
			<li>Une fois les SCs atteindre 70-80 % confluence, répétez les étapes 1.2.3.1 à 1.2.3.6. Les SCs courent maintenant le passage 2.</li>
		</ol></li> <li>Transduce les SCs atteignant une fois confluence de 50 %, avec un vecteur lentiviral codant la GFP dans D10/3M, milieu du jour au lendemain à une multiplicité d’infection de 30 décrite précédemment 44 , 45 .</li>
		<li>Reconstituer avec un milieu frais D10/3M le lendemain et chaque 3-4 jours après l’ensemencement.</li>
		<li>Une fois que les GFP-SCs atteint 70-80 % confluence, répétez les étapes 1.2.3.1 à 1.2.3.5 mais remettre en suspension les GFP-SCs dans 6 mL de milieu de D10 à la place. Déposer 15 µL de suspension GFP-SC dans un tube à centrifuger 1,5 mL et ajouter 15 µL de solution de bleu de trypan de 0,4 %. Mettez le tube à centrifuger doucement et diluer 10 µL du mélange dans une chambre de la diapositive de comptage cellulaire.
		<ol><li>Placez le chariot dans un compteur de cellules automatisées et de déterminer la densité cellulaire.</li>
		</ol></li> <li>Centrifuger les cellules à 370 x g pendant 5 min à 4 o C. Retirer le surnageant, resuspendre avec 1,5 mL de milieu de congélation pour chaque 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1,5 mL de suspension de GFP-SC dans un flacon cryogénique et congélation à -80 o C pendant au moins 24 h avant de passer à l’azote liquide pour le stockage. 
		NOTE : Congélation moyen : 25 % de FBS et 8 % diméthyl sulfoxide en DMEM.</li>
		<li>GFP-SCs décongeler une semaine avant la chirurgie.
		<ol><li>Ajouter 10 mL D10 médium dans un tube à centrifuger 50 mL.</li>
			<li>Décongeler des flacons de GFP-SCs congelés au bain-marie à 37 o C jusqu'à ce que partiellement décongelé.</li>
			<li>Supprimer la suspension de GFP-SC de la ﬁole cryogénique et placez-le dans le tube à centrifuger 50 mL préparé en 1.2.8.1. Pipette de doucement la solution haut et bas à plusieurs reprises.</li>
			<li>Centrifuger les cellules à 370 x g pendant 5 min à 4 o C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu D10/3M 4 mL pour chaque flacon décongelé.</li>
			<li>Distribuer 2 mL de suspension de GFP-SC et 5 mL de milieu de D10/3M dans un plat de Pétri de 10 cm ; chaque flacon devrait se traduire par 2 boîtes de Pétri. Les GFP-SCs sont définis comme passage 3. 
			Remarque : Une boîte de Pétri 10 cm donne habituellement autour de 8 x 10 6 GFP-SCs après une semaine.</li>
		</ol></li> <li>Le jour de la chirurgie, répétez l’étape 1.2.6. Utilisation de la densité cellulaire calculée à l’étape 1.2.10.</li>
		<li>Dosage aliquotes de 3 x 10 6 GFP-SCs dans centrifugeuse stérile de 1,5 mL tubes basés sur la densité de la cellule calculée à partir d’étape 1.2.9. Centrifuger les aliquotes de GFP-SC à 370 x g pendant 5 min à 4 o C et éliminer le surnageant. Ajouter 1 mL de milieu DMEM/F12 à chaque aliquote et centrifuger à 370 x g. 
		Remarque : Chaque animal reçoit 3 x 10 6 GFP-SCs. moyennes avec du sérum est utilisé avec GFP-SCs jusqu'à cette étape.</li>
		<li>Garder GFP-SCs sur la glace jusqu’au moment de la transplantation.</li>
	</ol></li></ol> 2. Compléter la Transection au niveau thoracique 8 (T8) <ol><li>préparation animaux pour la chirurgie <ol><li>anesthésier un Fischer femelle rat (180-200 g) avec une injection intrapéritonéale de kétamine (60 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (5 mg/kg de poids corporel). Contrôler la profondeur de l’anesthésie avant de passer à l’étape suivante en cochant orteil pincement et réponses clignement des yeux.</li>
		<li>Raser l’arrière du rat avec une tondeuse électrique et essuyer la peau avec l’éthanol à 70 %. Appliquer du lubrifiant ophtalmique sur les deux yeux. Transférer l’animal dans la table de chirurgie sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à environ 37 o C. Place l’animal sur un rouleau pour les vertèbres sont faciles d’accès. 
		Remarque : Le rouleau peut faire du papier essuie-tout ou 2 en x2 en gaze qui peut être stérilisé. Plus gros rouleaux est recommandés lorsque T7-T9 doit être posé à plat sur le dessus du rouleau.</li>
	</ol></li> <li>T7 à T9 laminectomie <ol><li>localiser le point de repère pour les apophyses épineuses T9-T11. 
		NOTE : Les écarts entre T9 et T10 T11 sont petites par rapport aux autres segments j’ain la région. Après avoir placé le rat sur le rouleau, les apophyses épineuses T9-T11 se sentira comme une petite bosse triangulaire à travers la peau.</li>
		<li>Faire une incision médiane de 4 à 5 cm de la peau à l’aide d’une lame #10 de T4 à T11. Faire une petite incision dans la couche de graisse superficielle avec des ciseaux courbes avec les extrémités franches à disséquer la graisse. 
		NOTE : Autres types d’instruments peuvent être utilisés pour séparer la graisse, mais les ciseaux courbes avec les extrémités franches activez la méthode plus efficace et moins invasive pour la séparation des graisse.</li>
		<li>Localiser les apophyses épineuses T9 T7 en utilisant le dos de la lame #10. Tenez le muscle à propos de T4 avec une pince émoussée et faites une incision dans le muscle le long de chaque côté des vertèbres de T6-T10. Faire la coupe au plus près les vertèbres que possible à faire, une ouverture propre à l’animal un préjudice minime.</li>
		<li>Isoler chaque chaque apophyse de T7 à T9 en coupant les muscles et les ligaments entre T6 et T7, T7 et T8, T8 et T9 et T9 et T10 avec une lame #10.</li>
		<li>Utilisez un rongeur pour supprimer tout muscles et des ligaments sur les lamelles de T7 à T9. Supprimer les muscles et les ligaments aussi latéralement que possible jusqu'à ce que les écarts entre les apophyses transverses de T7 à T9 sont visibles.</li>
		<li>Enlever l’apophyse T9 avec un rongeur. Maintenez l’apophyse T8 avec pince émoussée et soulevez doucement pour élever la lamina T9 à la petite ouverture entre les processus T9 et T10.</li>
		<li>Supprimer la lamina à partir de l’ouverture et le déplacement rostralement avec un rongeur à T9. Retirez la lame latéralement autant que possible ; les racines de la dorsale doit être visibles après la laminectomie.</li>
		<li>Une fois que la lame est enlevée, répétez le processus pour T8 et T7. 
		Remarque : Au cours de la laminectomie, utilisez absorption lances pour enlever le sang tout en continuant avec la laminectomie. En cas de saignement excessif, placer une éponge compressée sur le site de saignement et ajouter une solution saline pour aider à la coagulation sanguine.</li>
	</ol></li> <li>Transection à T8 <ol><li>Placer le rétracteur autour de T7 à T9. Une fois que toutes les lamelles sont enlevés, s’assurer que les écarts entre les apophyses transverses sont visibles, en particulier à T8. Examinez également les os le long des deux côtés entre T7 à T9 pour assurer il n’y a aucune saillie vers l’extérieur des fragments d’os. 
		Remarque : Cette lacune à T8 est importante pour réaliser la résection complète. Les vertèbres sur toute la longueur doivent être retirés pour faciliter leur insertion conduit.</li>
		<li>Couper la partie dorsale et des racines ventrales au-dessus et en dessous à l’aide de T8 inclinée ciseaux de printemps. Ajouter une solution saline à la moelle épinière et attendez que le sang au caillot. Remarque : cette étape est importante pour une insertion correcte conduit.</li>
		<li>Placer les ciseaux coudé printemps au-dessus de la moelle épinière dans les écarts entre les apophyses transverses à T8 et faites une coupe de rompre complètement la moelle épinière. Placer un petit morceau de mousse compressée dans l’écart de 2 à 2,5 mm et ajoutez une solution saline à la zone immédiatement.</li>
	</ol></li></ol> 3. Insertion de conduit <ol><li>en attendant que les souches de cordon sectionné atteindre l’hémostase, sortez un conduit de PBS 1 x. Couper les triangles d’absorption en mince longs morceaux et rangez-les dans le conduit pour enlever l’excès PBS. S’assurer que les fenêtres prédécoupées sont ouverts.</li>
	<li>Supprimer une solution saline et le sang à l’aide de fines pièces longues de triangles d’absorption. Soulevez les deux souches de la moelle épinière utilise une microspatula pour assurer la bonne séparation. Soulevez le moignon rostral avec le microspatula doucement et faire passer le conduit sur le moignon avec les fenêtres face à soi-même. Assurez-vous que le moignon tout est inséré et il n’y a pas de saignement excessif dans le conduit.</li>
	<li>Soulever le moignon caudal délicatement et glissez l’autre extrémité du tube sur le moignon. Assurez-vous que le moignon tout est inséré et les fenêtres sont sur la face dorsale ( Figure 2 a).</li>
</ol> 4. Cellule de Schwann / matrice Injectable (voir Table des matières) préparation et Injection <ol><li>en attendant le cordon sectionné atteindre l’hémostase, retirez le support au-dessus du culot de GFP-SC (préparé à l’étape 1.2). Resuspendre les GFP-SCs dans 10 µl de froid DMEM/F12. Ajouter 10 µl de froid gel injectable dans la suspension cellulaire et bien mélanger en répété de pipetage. Garder le mélange de matrice de GFP-SC/DMEM/F12/injectable sur la glace jusqu'à insertion conduit fin.</li>
	<li>Après s’être assuré que les fenêtres sur la surface dorsale sont ouvertes ( Figure 2 a), injecter 20 µl du mélange matrice GFP-SC/DMEM/F12/injectable dans le conduit par l’une des fenêtres prédécoupées 46 à l’aide d’une embout et une micropipette de chargement la tache occidentale. Si le mélange de matrice de SC/DMEM/F12/injectable doit déborder le conduit, enlevez le surplus avec des triangles d’absorption. Fermez les fenêtres après l’injection ; suture n’est pas nécessaire ( Figure 2 b).</li>
</ol> 5. La fermeture et soins postopératoires calques de <ol><li>Suture du muscle et la graisse superficielle. Nettoyer la peau avec l’éthanol à 70 % et puis agrafe (p. ex., utiliser des agrafes de plaie) la peau ferme. Garder les animaux dans un incubateur thermiquement réglementé jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience. Transférer les animaux dans des cages. Fournir de l’eau avec un tube d’alimentation depuis longtemps et placer les boulettes sur la literie pour un accès facile.</li>
	<li>Administrer buprénorphine (0,1 mg/kg de poids corporel) deux fois par jour pendant 3 jours par voie sous-cutanée commençant immédiatement après la chirurgie pour réduire la douleur. Injecter de gentamycine (5 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée une fois par jour pendant 7 jours immédiatement après la chirurgie pour prévenir et réduire l’infection. Injecter 10 mL de solution de Ringer amorcez par voie sous-cutanée deux fois par jour pendant 7 jours pour l’hydratation.</li>
	<li>Vide vessies manuellement deux fois par jour jusqu'à la vessie fonctionnent retourne. En cas d’infection de la vessie, puis administrer 10 mL de solution saline par voie sous-cutanée jusqu'à ce que l’urine devient clair. S’il n’y a aucune amélioration en deux jours, injecter gentamycine (5 mg/kg de poids corporel, une fois par jour) par voie sous-cutanée jusqu'à ce que l’urine devient clair.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’étape la plus importante dans la création d’un modèle efficace de transection est sectionnant la moelle épinière dans une ou deux coupes. Un écart de 2 à 2,5 mm entre les souches médullaires rostral et caudale devrait être présent sur le site de transection. Les trois raisons très probables de tel un fossé n’apparaissant ne pas sont (1) les racines dorsales/ventrale n’étaient pas correctement supprimés, (2) la dure-mère ventrale n’a pas été éliminée adéquatement et/ou (3) l’animal n’était pas correctement positionné su...

Réparation de lésions de la moelle épinière est un problème complex et difficile qui nécessitera une stratégie de traitement combinatoire impliquant, par exemple, l’utilisation de cellules et un biomatériau pour fournir un micro-environnement favorable pour la fonction des cellules transplantées et axon régénération sur le site de lésion. Hémisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 et transection complète10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modèles sont fréquemment utilisés pour évaluer les effets des thérapies ponts à base de biomatériaux. L’avantage d’utiliser un modèle hémisection est qu’il offre plus de stabilité pour la construction de pontage par rapport à la résection complète. Toutefois, dans les modèles hémisection, il est difficile de prouver la régénération axonale à l’issue de la méthode thérapeutique appliquée en raison de la présence de tissu épargné. Le modèle de transection complète est la méthode la plus rigoureuse de démontrer la régénération axonale.
Divers matériaux naturels et synthétiques ont été étudiés pour une utilisation comme un gel injectable, un gel pré-formé placé dans une contusion ou hémisection modèles, ou comme un conduit structuré dans hémisection ou toutes les modèles de transection (détaillés dans les commentaires23 , 24 , 25). in situ gélifiant d’un mélange de matrice/SC injectable crée une interface plus permissive entre la greffe et le cordon de l’hôte pour axon passage26,27 par rapport aux implants pré gélifié matrice/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gélifiant a permis la matrice au contour autour des interfaces hôte irrégulière, alors qu’une conduite plus rigide et plus structurée ou un gel moins malléable préformé ne pouvait pas. Une conduite structurée offre souvent une stabilité orientation et implant contact contrairement à une matrice injectable. Les protocoles présentés ici décrivent une procédure chirurgicale qui profite des fois une matrice injectable membrane basale (p. ex., matrigel, voir la Table des matières, dénommé comme matrice injectable ici) et un tuyau structuré en vue de évaluer la régénération axonale dans le modèle de blessure de la moelle épinière plus rigoureux.
Électrofilées poly-vinylidenedifluoride-trifluoroéthylène (PVDF-TrFE) alignées fibreux conduites creux sont utilisés dans notre approche expérimentale. PVDF-TrFE est un polymère piézoélectrique qui génère une charge transitoire lorsque déformée mécaniquement et a été montré pour favoriser la régénération d’extension et axon neurites fois in vitro29,30 et in vivo 31. électrofilage est une méthode de fabrication échafaudage commune capable de produire rapidement des échafaudages fibreux fiables en utilisant une variété de polymères ayant des propriétés contrôlables telles que l’alignement de fibre, fibre de diamètre et l’épaisseur de l’échafaud pour neural et d’autres applications32,33,34.
De nombreuses études sur le rat SCs repiquées dans des sites de lésion de la moelle épinière ont démontré traitement efficacité5,9,18,19,20,21 ,26. Ces greffes sont neuroprotecteurs pour tissu qui entoure la lésion, de réduire la taille de cavité de lésion et promouvoir la régénération axonale dans le site de la lésion/transplantation et la myélinisation des axones régénérés. SCs humaines peuvent être transplantées autologously, un avantage par rapport à la plupart des autres neurones liés cellules24. Après une biopsie de nerf périphérique, SCs peuvent être isolées et purifiées et va proliférer à la quantité désirée pour la transplantation dans les humains. Autogreffe de SC pour les patients de la moelle épinière blessée a été prouvé pour être sûr en Iran35,36,37,38, Chine39,40et la United States41,42. SCs sont connus pour sécréter des nombreux facteurs neurotrophiques et les protéines de la matrice extracellulaire importants pour la croissance de l’axone et à jouer un rôle essentiel dans la régénération axonale après une lésion des nerfs périphériques. Notre objectif ici est de décrire les méthodes qui peuvent enquêter sur des conceptions de conduit pour améliorer les résultats de la transplantation de SC dans un modèle de transection de moelle épinière de rat complet.

<table><tbody><tr><td>Flacons cryogéniques</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Boîte de Pétri</td><td>VWR</td><td>25382-428</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’Eagle modifié de Dulbecco : mélange de nutriments F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039-021</td><td>"DMEM/F12 » dans le protocole.</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>"Pen/Strep » en protcol.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Hyclone</td><td>SH300-70-03</td><td>"FBS » dans le protocole.</td></tr><tr><td>Extrait hypophysaire</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-215</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin</td><td>R& D Systems</td><td>396-HB/CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>"PLL » dans le protocole.</td></tr><tr><td>Le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td> <td>« DMEM » dans le protocole.</td></tr><tr><td>La solution saline équilibrée de Hank</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td> <td>« HBSS » dans le protocole.</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Rat Fischer femelle (160-180g)</td><td>Ciseaux Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas, droit</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Vedco Inc</td><td>5098976106</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc</td><td>AnaSed</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-010-02</td><td>Peut être n’importe quelle marque de choix.</td></tr><tr><td>Micro Spatule</td><td>FST</td><td>10089-11</td><td>Peut être n’importe quelle marque de choix.</td></tr><tr><td>Ciseaux incurvés à extrémité émoussée</td><td>FST</td><td>14017-18</td><td>Peut être n’importe quelle marque de choix.</td></tr><tr><td>Pince émoussée</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td>Peut être n’importe quelle marque de choix.</td></tr><tr><td>rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td>Peut être n’importe quelle marque de choix.</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort coudés</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td>Peut être n’importe quelle marque de choix.</td></tr><tr><td>Triangles d’absorption</td><td>FST</td><td>18105-03</td><td>Peut être n’importe quelle marque de choix.</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>"Mousse compressée » dans le protocole.</td></tr><tr><td>#10 lames</td><td>Sklar</td><td>06-3010</td><td>Peut être n’importe quelle marque de choix.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>"Matrice injectable » dans le protocole.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-protéine fluorescente verte de poulet</td><td>Millipore</td><td>AB16901</td><td></td></tr><tr><td>Souris RT97 Anticorps anti-hybridome</td><td>DSHB</td><td>RT97</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-neurofilament de lapin</td><td>Encor Biotechnology, Inc</td><td>PRCA-NF-H</td><td></td></tr><tr><td>Vaccin polyclonal de lapin anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Anticorps</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-poulet IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21244</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 chèvre anti-souris IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie confocale</td><td>Nikon</td><td>clsi</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantation de schwann des cellules à l’intérieur des conduits de pvdf-trfe pour combler les souches moelle épinière sectionnée rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Parmi les différents modèles pour la blessure de la moelle épinière chez le rat, le modèle de la contusion est le plus souvent utilisé parce que c’est le type le plus commun de la moelle épinière humaine. Le modèle de transection complète, bien que pas aussi cliniquement pertinente que le modèle de la contusion, est la méthode la plus rigoureuse pour évaluer la régénération axonale. Dans le modèle de la contusion, il est difficile de distinguer régénérée des axones germés ou épargnés en raison de la présence d’autres lésions post. Dans le modèle de transection complète, une méthode de raccordement est nécessaire pour combler le vide et de créer une continuité de la rostrale des caudales souches afin d’évaluer l’efficacité des traitements. Une chirurgie de pontage fiable est indispensable pour tester les mesures de résultats en réduisant la variabilité due à la méthode chirurgicale. Les protocoles décrits ici sont utilisées pour préparer Schwann, cellules (SCs) et conduits avant la greffe, une résection complète de la moelle épinière au niveau thoracique 8 (T8), insérer le tube et transplant SCs dans le conduit. Cette approche utilise également en situ gélifiant d’une matrice injectable membrane basale avec transplantation SC qui permet la croissance axonale améliorée via les interfaces rostrales et caudales avec les tissus de l’hôte.

L’objectif de l’utilisation de cette technique chirurgicale consiste à évaluer l’utilisation d’un conduit structuré et matrice injectable qui maximise la fonction SC après la transplantation en rempli sectionnées moelles épinières. Trois semaines après la transplantation, les animaux sont perfusés avec paraformaldéhyde à 4 % et les colonnes vertébrales sont grossièrement disséqués et fixe le même fixateur pour encore 24 h. La moelle épinière est ensuite disséquée et les échantillons pour ...

Cet article décrit une technique pour insérer un tube creux entre les souches de la moelle épinière après transection complète et remplissez-le de cellules de Schwann (SCs) et matrice injectable membrane basale afin de combler et de promouvoir la régénération axonale dans le fossé.

Transplantation de Schwann des cellules à l’intérieur des Conduits de PVDF-TrFE pour combler les souches moelle épinière sectionnée Rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

L'objectif général de cette procédure chirurgicale est d'utiliser un conduit rempli de cellules de Schwann et d'une matrice injectable afin de créer un pont entre des moignons de moelle épinière complètement sectionnés, favorisant ainsi la régénération des axones à travers ce pont. Notre objectif est de franchir un site de lésion de la moelle épinière chez le rat afin de restaurer la fonction. La lésion que nous utilisons consiste à créer un intervalle de section complète.C'est uniquement en utilisant ce type de lésion que nous pouvons affirmer avec certitude que les axones ont régénéré lorsque nous les retrouvons au niveau du site de la lésion. Le pont que nous utilisons est un canal polymère contenant des cellules de Schwann, ces dernières étant essentielles à la régénération des axones. Nous montrons dans cette vidéo comment introduire un tel pont dans un intervalle de section complète.Les chercheurs novices avec cette méthode devront s'entraîner, car la section complète de la moelle épinière et l'insertion du conduit peuvent s'avérer difficiles pour les débutants. Avant de commencer la procédure, utilisez une lame numéro 10 pour couper le conduit à cinq millimètres. Cette étape peut également être réalisée au microscope stéréoscopique, si souhaité.Replier délicatement le conduit le long du côté longitudinal et utiliser des ciseaux droits de Vannas pour effectuer quatre petites incisions d’environ 0,4 millimètre de long, situées à au moins un millimètre des ouvertures et espacées d’environ un millimètre. Ensuite, déplier le conduit et couper entre les deux incisions le long du même côté afin de créer deux fenêtres côte à côte, en s’assurant que les fenêtres peuvent s’ouvrir et se fermer correctement le long du côté non coupé. Pour réaliser la laminectomie T7-T9, après avoir confirmé l’absence de réponse à une pincée des orteils chez un rat femelle Fischer anesthésié pesant entre 180 et 200 grammes, localiser le repère des apophyses épineuses T9-T11.Ils se sentiront comme une petite bosse triangulaire à travers la peau. À l’aide d’un bistouri n°10, réalisez une incision cutanée médiane de quatre à cinq centimètres, de T4 à T11, suivie d’une petite incision dans la couche superficielle de tissu adipeux à l’aide de ciseaux courbes à extrémités émoussées. Après avoir disséqué la graisse, utilisez le bistouri n°10 pour localiser les apophyses épineuses T7-T9 et saisissez le muscle vers T4 à l’aide de pinces émoussées. Incisez le muscle de chaque côté des vertèbres de T6 à T10, aussi près que possible des vertèbres, afin d’obtenir une ouverture nette et de causer un traumatisme minimal à l’animal.Placer le rétracteur autour de T7 à T9. Utiliser la lame numéro 10 pour sectionner les muscles et les ligaments entre les apophyses individuelles de T6 à T10, puis utiliser un rongeur pour retirer tout muscle ou ligament présent sur les lames de T7 à T9 aussi latéralement que possible. Lorsque les espaces entre les apophyses transverses de T7 à T9 deviennent visibles, utiliser le rongeur pour enlever l’apophyse épineuse de T9, en soulevant délicatement l’apophyse épineuse de T8 à l’aide de pinces contondantes afin de soulever la lame de T9 au niveau de la petite ouverture entre les apophyses de T9 et T10. Ensuite, utiliser le rongeur pour retirer la lame aussi latéralement que possible, en commençant par l’ouverture et en progressant de façon rostrale au niveau de T9. Une fois toutes les lames retirées, vérifier que les espaces entre les apophyses transverses sont bien visibles, en particulier au niveau de T8, et examiner les os situés des deux côtés entre T7 et T9 afin de s’assurer qu’il n’y a aucun fragment osseux proéminent vers l’extérieur ; les racines dorsales doivent alors devenir visibles.À l’aide de ciseaux à ressorts angulaires, couper les racines dorsales et ventrales au-dessus et au-dessous de T8 et ajouter du sérum physiologique sur la moelle épinière pour aider à arrêter le saignement. Ensuite, placer les ciseaux à ressorts angulaires au-dessus de la moelle épinière, dans les espaces situés entre les processus transverses au niveau de T8, et effectuer une coupe afin de sectionner complètement le tissu nerveux. Insérer un petit morceau de mousse compressée dans l’espace résultant de deux à 2,5 millimètres et ajouter immédiatement du sérum physiologique sur la zone.Pendant que les moignons du cordon sectionné atteignent l'hémostase, découper des triangles absorbants en fines bandes allongées et sortir un conduit du stockage dans le PBS. Placer quelques triangles dans le conduit afin d'éliminer l'excès de PBS et vérifier que les fenêtres préalablement découpées sont bien ouvertes. Ensuite, retirer le milieu d'un culot de cellules de Schwann exprimant la GFP et resuspendre les cellules de Schwann dans 10 microlitres de DMEM/F-12 froid.Ajoutez 10 microlitres de gel injectable froid à la suspension cellulaire et mélangez soigneusement par pipetage répété. Ensuite, placez la suspension cellulaire sur de la glace. Lorsque les moignons de cordon sont prêts, retirez la mousse comprimée, puis utilisez de longues bandes des triangles d'absorption pour éliminer le sérum physiologique et le sang de la zone de laminectomie.Ensuite, utilisez une microspatule pour soulever délicatement le moignon rostral et glisser le conduit sur le moignon, les fenêtres orientées vers le haut, en prenant soin que l'ensemble du moignon soit inséré et qu'il n'y ait pas de saignement excessif dans le conduit. Soulevez doucement le moignon caudal et faites glisser l'autre extrémité du conduit sur celui-ci, en veillant à ce que l'ensemble du moignon soit inséré et que les fenêtres se trouvent sur la surface dorsale. Ensuite, utilisez une micropipette équipée d'une pointe de chargement pour western blot pour injecter 20 microlitres du mélange matriciel injectable de cellules de Schwann exprimant la GFP dans le conduit à travers l'une des fenêtres préalablement découpées, puis fermez les fenêtres.Une mise en garde. Il est très important que les moignons de cordon soient manipulés aussi rapidement et aussi soigneusement que possible. Un retard pourrait provoquer un gonflement des moignons, rendant difficile le glissement du conduit sur la moelle épinière et causant ainsi des lésions supplémentaires.Trois semaines après la transplantation, les images fluorescentes confocales de sections sagittales congelées du tissu médullaire révèlent une répartition homogène des cellules de Schwann le long et à l'intérieur du conduit, ainsi que la présence de vaisseaux sanguins et d'axones myélinisés au centre du pont. La régénération axonale est également étroitement associée à la présence de cellules de Schwann, confirmant l'efficacité de l'utilisation d'un pont de cellules de Schwann à l'intérieur d'un conduit structuré pour favoriser la régénération axonale le long du pont entre les moignons rostral et caudal. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en 45 minutes lorsqu'elle est effectuée correctement.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le traçage EndoRay peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, combien d'axones régénèrent dans le pont et combien d'entre eux quittent le pont pour réintégrer la moelle épinière ? Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de sectionner la moelle épinière, d'insérer un conduit et d'injecter des cellules au sein d'une matrice afin de créer un pont fiable pour la régénération axonale et d'autres évaluations des résultats.

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Lésions traumatiques de la moelle épinière interrompt la communication avec le cerveau. Pour restaurer la connectivité perdue, nous utilisons une greffe du nerf périphérique pour fournir un substrat pour les fibres de régénération en combinaison avec les facteurs neurotrophiques et la matrice de modulation des enzymes pour éliminer les molécules inhibitrices de promouvoir la croissance à longue distance.

Combinant des nerfs périphériques et de greffe matrice de modulation de réparer le cordon Rat épinière lésée

Prenez un rat anesthésié avec un nerf sciatique droit intact exposé, qui contrôle le mouvement et la sensation de la jambe.Exciser un segment nerveux, créant un espace, sectionnant les axones neuronaux et perturbant la transmission du signal.Les axones distaux sectionnés se détériorent, détachant les cellules spécialisées de réparation nerveuse ou cellules de Schwann.Suturez un échafaudage nerveux conducteur bionique, un tube mou avec des microcanaux, à l’épineurium, la couche externe du nerf,...

Réparation nerveuse à l’aide d’un échafaudage conducteur bionique combiné à une stimulation électrique

Source : Lee, Y., et.al. Transplantation de cellules de Schwann à l’intérieur de conduits en PVDF-TrFE pour relier les moignons de moelle épinière de rat transectés afin de favoriser la régénération axonale à travers l’espace. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo démontre l’utilisation d’un conduit polymère piézoélectrique ensemencé de cellules de Schwann pour favoriser la régénération axonale dans une moelle épinière de rat transectée. Le conduit fournit un guidage structurel, tandis que ses...

Conduits ensemencés de cellules Schwann pour la régénération axonale après une lésion de la moelle épinière

des matrices de fibrine contenant des facteurs de croissance ont été utilisés pour conserver des cellules souches neurales dans des sites greffés complète de transection de la moelle épinière. Cellules greffées complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en plusieurs types de cellules neurales, y compris les neurones qui s'étendaient axones dans la moelle épinière hôte sur de longues distances.

Promotion de la survie et de la différenciation des cellules souches neurales de fibrine et du facteur de croissance Cocktails après Spinal Cord Injury sévère

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Un système de radio-télémétrique de surveiller la fonction cardiovasculaire chez le rat avec la moelle épinière Transection et embryonnaires souches neurales greffes cellulaires

Lésion de la moelle épinière est une condition traumatique qui entraîne une morbidité grave et une mortalité élevée. Dans ce travail, nous décrivons en détail un modèle de contusion de blessure de la moelle épinière chez la souris suivie d'une transplantation de cellules souches neurales.

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Les lésions graves de la moelle épinière entraînent souvent des anomalies tissulaires. Deux possibilités sont décrites pour combler avec succès ces lacunes afin de promouvoir l’adaptation tissulaire, les réponses régénératives et l’amélioration fonctionnelle chez le rat via l’implantation d’un système de microconnecteur mécanique après une lésion aiguë et cinq semaines après une transsection complète de la moelle épinière.

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Cette vidéo montre le modèle orthotopique greffe aortique comme un modèle simple pour étudier le développement de la vasculopathie transplantation (TVP) chez les rats.

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Apprenez une technique chirurgicale pour établir un pont entre les moignons de moelle épinière sectionnée chez le rat en utilisant un conduit rempli de cellules de Schwann et une matrice injectable.

Transplantation de Schwann des cellules à l’intérieur des Conduits de PVDF-TrFE pour combler les souches moelle épinière sectionnée Rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé (Vidéo) | JoVE Journal

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