Régénération des microélectrodes or rangés, équipé d’un analyseur de cellule en temps réel

L’objectif global de cette procédure est de régénérer des plaques électroniques commerciales équipées d’un analyseur de cellules en temps réel, ou RTCA. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération des puces jetables à base d’or, y compris la régénération des plans électroniques utilisés dans la RTCA. Le principal avantage de cette technique est que la procédure de régénération peut être effectuée à l’aide de réactifs de laboratoire doux et facilement disponibles avec une faible toxicité.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons commencé à utiliser l’analyseur de cellules en temps réel, qui coûte des puces à base d’or. Commencer cette procédure par l’incubation et la prolifération des cellules A549 dans une boîte de culture cellulaire comme décrit dans le protocole textuel. Ajouter 150 microlitres de milieu cellulaire dans chaque puits d’incubation de la plaque électronique L8. Laissez la plaque pendant 30 minutes dans le capot de biosécurité pour l’équilibre.

Après 30 minutes, insérez manuellement la plaque électronique L8 dans l’analyseur de cellules en temps réel de l’incubateur de CO2 à 37 degrés Celsius. Ensuite, lancez le programme de fonctionnement de l’analyseur de cellules en temps réel sur l’ordinateur. Sur la page de configuration du modèle d’expérience par défaut, sélectionnez Modèle d’expérience, puis nommez le test en cours.

Sur sa page de mise en page, sélectionnez les puits correspondants qui sont inclus dans l’expérience et entrez les informations telles que le type de cellule, le numéro et les noms de médicaments dans les zones d’édition. Sur sa page de planification, ajoutez les étapes expérimentales, puis sélectionnez le temps d’exécution de chaque étape et l’intervalle d’acquisition des données en temps réel. Cliquez sur Démarrer pour mesurer l’impédance d’arrière-plan du support.

Le fichier d’expérience sera enregistré. Les données résultantes seront automatiquement soustraites. Sur la page de tracé, ajoutez des puits et le graphique de l’indice de la cellule temporelle s’affichera.

Pour l’expérience de prolifération cellulaire, cliquez d’abord sur le bouton pause pour mettre le programme en pause. Retirez ensuite la plaque électronique et ajoutez 100 microlitres de tampon de suspension de cellules A549 par puits à température ambiante. Laissez la plaque pendant 30 minutes dans le capot de bio-sécurité pour laisser les cellules se déposer au fond des puits d’incubation.

Insérez manuellement la plaque électronique dans la station d’analyse de cellules en temps réel. Cliquez ensuite sur le bouton Démarrer pour poursuivre l’expérience. Sur la page du tracé, l’analyseur enregistre en continu les valeurs d’indice des cellules, ou courbes, tout au long de l’expérience.

Une fois l’expérience terminée, entrez dans la page du graphique et ouvrez le fichier de l’expérience. Sélectionnez ensuite tous les puits d’incubation testés et les courbes d’indice cellulaire résultantes qui peuvent être moyennées ou normalisées pour la dernière fois avant d’ajouter des médicaments pharmaceutiques ou de changer de milieu pour réduire les variations entre les tests. Sur la page d’analyse des données, il est possible de calculer l’EC50 ou l’IC50.

Après avoir effectué l’évaluation de la cytotoxicité du médicament anticancéreux comme décrit dans le protocole textuel, retirez la plaque électronique contenant les cellules de la station d’analyse de cellules en temps réel. Placez la plaque électronique usagée dans une hotte de biosécurité stérile à température ambiante et mélangez soigneusement le milieu de culture à l’aide d’une pipette. Ensuite, à l’aide d’une pipette, aspirez tout le support.

Rincez les plaques électroniques avec 200 microlitres d’eau déminéralisée trois fois à température ambiante. Digérez les cellules restantes sur les plaques électroniques avec 0,25 % de trypsine fraîchement préparée pendant une à deux heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois la digestion terminée, travailler dans la hotte de biosécurité à température ambiante pour mélanger la solution d’incubation cinq à 10 fois à l’aide d’une pipette, puis retirer la solution.

Rincez deux fois les plaques électroniques avec 200 microlitres d’eau déminéralisée. Ensuite, lavez deux fois avec 200 microlitres d’éthanol à 100 %, puis deux fois le même volume d’éthanol à 75 %. Enfin, rincez deux fois avec 200 microlitres d’eau déminéralisée.

Retournez la plaque électronique sur une gaze stérile ou du papier de soie pour décanter l’eau restante à température ambiante. Effectuez ensuite une stérilisation par ultraviolets sur la plaque électronique régénérée pendant une à deux heures dans la cagoule de biosécurité à température ambiante. Après avoir utilisé les plaques pour l’administration de médicaments à l’aide d’un matériau mésoporeux comme décrit dans le protocole de texte, digérez les cellules restantes avec de la trypsine comme précédemment.

Comme la pipette est fréquemment utilisée dans les expériences, la personne doit veiller à ne pas rayer la pointe et la surface des micropuces. Rincez les micropuces avec 200 microlitres d’eau déminéralisée une fois dans la hotte de biosécurité à température ambiante. Soulevez ensuite les micropuces avec 200 microlitres d’éthanol absolu deux fois à température ambiante.

Ensuite, rincez les micropuces avec 200 microlitres d’éthanol à 75 % une fois à température ambiante. Ajoutez 250 microlitres d’éthanol à 75 % dans chaque puits et scellez la plaque électronique avec le film d’étanchéité à température ambiante. Après avoir fait tourner la plaque électronique à 114 fois G pendant deux minutes, videz la plaque.

Retournez la plaque électronique sur une gaze stérile ou du papier de soie pour décanter le liquide restant à température ambiante. Répétez les rinçages à l’éthanol à 75 % suivis de l’essorage. Effectuez ensuite une stérilisation par ultraviolets sur la plaque électronique régénérée pendant une à deux heures dans la cagoule de biosécurité à température ambiante.

Évaluer les caractéristiques optiques de la surface de la plaque électronique régénérée en démontant d’abord la partie inférieure du puits d’incubation, comme décrit dans le protocole de texte. Pour évaluer la viabilité des cellules attachées après l’absorption de médicaments anticancéreux sur les plaques électroniques fraîches et régénérées, utilisez un microscope confocal à balayage laser pour surveiller la fluorescence spontanée des molécules DOX absorbées par les cellules A549. Pour enregistrer la fluorescence spontanée de la DOX absorbée par les cellules, utilisez un objectif à huile 63 fois et 485 nanomètres comme longueur d’onde d’excitation.

Ensuite, évaluez les comportements électrochimiques des électrodes régénérées en polissant d’abord l’électrode d’or et l’électrode de carbone vitreux sur une surface semblable à un miroir avec une suspension lumineuse sur un chiffon de polissage. Ensuite, sonicez les électrodes dans de l’eau pour éliminer toutes les particules. Ensuite, activez l’électrode d’or dans de l’acide sulfurique 0,5 molaire.

Obtenir des données de spectroscopie d’impédance électrochimique, ou EIS, de l’électrode d’or nu et de l’électrode de carbone vitreux dans une solution électrolytique de chlorure de potassium de 10 millimolaires, contenant un phéracyanure de potassium millimolaire. Maintenant, déposez 10 microlitres d’une suspension de cellule sur la surface de l’électrode d’or dans le GCE. Après avoir ajouté les cellules, incubez l’électrode d’or dans le GCE dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois heures avant d’obtenir les données EIS des électrodes modifiées avec des cellules, comme décrit dans le protocole texte.

Pour régénérer les électrodes, plongez l’électrode d’or dans le GCE modifié avec des cellules à 0,25 % de trypsine pendant 0,5 à deux heures. Rincez doucement les deux électrodes à l’eau quatre fois. Ensuite, rincez doucement les électrodes avec de l’éthanol absolu quatre fois.

Ensuite, plongez l’électrode d’or dans le GCE dans de l’éthanol à 75 % pendant environ cinq minutes. Après cinq minutes, rincez doucement la puce avec de l’éthanol à 75 % quatre fois avant d’obtenir les données EIS des électrodes régénérées, comme décrit dans le protocole texte. Pour évaluer l’efficacité de régénération de la plaque électronique en or, des observations microscopiques ont été effectuées pour les plaques électroniques fraîches et traitées.

Aucune différence virtuelle dans les propriétés optiques de la surface de la micropuce n’a été trouvée. La throescence des molécules de doxorubicine est utilisée pour évaluer l’état cellulaire sur les micropuces d’or avant et après la régénération. L’homogénéité similaire et la morphologie cellulaire bien définie ont démontré la réutilisabilité des puces.

Le protocole de régénération est appliqué pour le test réel de la prolifération cellulaire. Les courbes de croissance obtenues à partir de plusieurs puits d’incubation d’une plaque électronique testée montrent une bonne cohérence, indiquant la régénération réussie de la puce commerciale. La plaque électronique régénérée L8 a été testée pour l’évaluation de la cytotoxicité à l’aide de matériaux de silice mésoporeux.

L’indice cellulaire de l’échantillon traité avec des matériaux mésoporeux a diminué par rapport au témoin, ce qui indique une légère cytotoxicité des matériaux. L’encapsulation et la libération ultérieures du médicament anticancéreux doxorubicine par des matériaux mésoporeux ont provoqué une diminution spectaculaire de la courbe de croissance des cellules A549. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le type de temps de digestion de l’évier peut différer d’une puce à l’autre. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie confocale à balayage laser, ou même la spectroscopie, la spectroscopie d’impédance électrochimique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’évaluation de l’effet de régénération.