Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

L’objectif général de l’expérience suivante est d’utiliser la détection d’impédance du substrat de cellule électrique connue sous le nom de eis pour caractériser les comportements cellulaires. Ceci est réalisé en cultivant des cellules sur des électrodes dans un réseau et en prenant des mesures dans différents modes pour quantifier la formation de la barrière endothéliale, la maturation et les manipulations fonctionnelles telles que l’enroulement électrique et l’ajout de stimulants sont ensuite effectuées pour tester la motilité cellulaire et la fonction barrière. On obtient des résultats qui décrivent l’attachement, la prolifération, la migration, la détection de la perméabilité endothéliale et l’évaluation des contacts entre les cellules, les cellules et les substrats cellulaires sur la base de l’ESIS.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que la production en ligne de données quantitatives, la caractérisation des cellules dans leur état de confluence naturelle dans leurs conditions de culture cellulaire standard. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode ont du mal parce que la théorie sous-jacente semble complexe et que vous devez être conscient de plusieurs considérations de base avant de commencer une expérience. Pour commencer, les réseaux doivent être nettoyés et stabilisés afin d’éviter la dérive des électrodes, d’améliorer la reproductibilité et d’augmenter le rapport d’intensité du signal.

Par conséquent, ajoutez 200 microlitres de 10 millimolaires d’EL ine dans chaque puits d’un réseau de huit puits après 15 minutes À température ambiante, retirez la cystine EL avec deux lavages d’eau ultra-pure, et non des tampons de phosphate. De plus, n’exposez pas les électrodes à des solutions contenant du sérum avant de les enrober, car elles peuvent interférer avec l’absorption des protéines. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de gélatine réchauffée à 1 % dans chaque puits et incubez le réseau pendant une demi-heure à 37 degrés Celsius.

Pour enlever la gélatine, utilisez de l’eau ultra-pure et ne laissez pas les surfaces des électrodes se dessécher. Remplissez ensuite les puits avec 400 microlitres de milieu de culture complet, qui peut maintenant contenir du sérum. Chargez le réseau dans le support.

Vérifiez les neuf carrés d’or. Ils doivent contacter les broches POGO. Fixez soigneusement la matrice en place à la main, en serrant la vis de réglage de l’ordinateur.

Ouvrez le logiciel de mesure. Appuyez sur configurer, puis sur la vérification dans la section collecter les données pour effectuer une mesure d’impédance rapide de chaque puits à la fréquence par défaut de 4 000 hertz. Les valeurs seront stockées dans la section des commentaires.

Assurez-vous que la vérification a correctement sélectionné le type de réseau EIS utilisé dans la section de configuration du puits sur le diagramme du réseau. Le rouge et le vert indiquent la fonctionnalité des connexions. Si le nettoyage et le codage étaient réussis, huit réseaux système W one E devraient enregistrer environ cinq à six réseaux NANOFARAD et huit réseaux W 10 E.

La résistance de base de 50 à 60 nanofarads avant ensemencement cellulaire est donc d’environ 2000 ohms. Pour modéliser les données à l’aide de RB alpha et cm, démarrez un enregistrement MFT avec la matrice défectueuse moyenne. Prenez 15 minutes de données acellulaires et terminez l’expérience pour ajouter les cellules.

Retirez maintenant le réseau et ensemencez 400 microlitres de suspension unicellulaire dans chaque puits. Pour étudier les graines de croissance cellulaire, 10 000 cellules par centimètre carré pour commencer avec une graine de population presque confluente, 60 000 cellules par centimètre carré. Après avoir chargé le réseau dans le support, dans la section de configuration du puits, sélectionnez les puits à mesurer.

Ensuite, allez dans les options de collecte de données et sélectionnez un mode de mesure pour une série chronologique à une fréquence fixe, sélectionnez SFT, puis choisissez la fréquence de mesure pour mesurer la couverture des électrodes et les modèles RB et alpha, sélectionnez MFT et l’appareil prendra automatiquement des mesures à toutes les fréquences disponibles. Exécutez la mesure en mode multifréquence dans la mesure du possible. Cela nécessite des données à toutes les fréquences disponibles et fournit ainsi le plus d’informations.

Pour l’analyse des micro-mouvements, sélectionnez RTC et ajustez la fréquence d’échantillonnage. La résolution temporelle standard est d’un hertz, mais peut être augmentée pour suivre les changements rapides d’impédance. La valeur peut être augmentée à 25 hertz pour le z thêta.

Pour mesurer séquentiellement les micromouvements à partir de plusieurs puits, sélectionnez le menu d’aide. Choisissez ensuite afficher les éléments de menu de la barre d’outils expert et acquérir un RTC multipuits. Dans la section collecter les données, assurez-vous de spécifier la limite de temps en heures.

Lors de l’utilisation de ce paramètre, le logiciel vous demandera le nombre de cycles après le démarrage de l’acquisition des données. Lors de la collecte de données à l’aide de SFT ou MFT, sélectionnez l’intervalle de temps entre les mesures spécifié en secondes. Pour une acquisition maximale de données, laissez cette option décochée.

Appuyez maintenant sur Démarrer et spécifiez où les données doivent être stockées. La course est arrêtée en appuyant sur la finition. En appuyant sur pause, l’acquisition de données s’arrête, mais l’horloge expérimentale continue de fonctionner.

Retirez maintenant le réseau et sous une hotte à flux laminaire, manipulez les puits. Après avoir remis le réseau au support, cliquez sur vérifier la connexion pour vérifier les connexions électriques, puis reprenez l’expérience pour continuer à collecter des données. Si les cellules n’ont pas besoin d’être stériles après la manipulation, un stimulus tel que la thrombine peut être ajouté directement à un puits lors de l’acquisition des données.

De telles variations introduites peuvent être marquées sur l’horloge expérimentale en appuyant sur le repère et en ajoutant un commentaire. Une autre option consiste à enrouler électriquement les cellules. Les paramètres pour cela ont besoin de quelques ajustements pour obtenir un temps de blessure court et ce n’est pas efficace trop longtemps, et vous pouvez endommager les électrodes.

Il suffit de commencer par les paramètres par défaut fournis par le logiciel et de partir de là. Allez dans la section de configuration de la parade électrique blessée et activez la blessure. Sélectionnez maintenant les puits à enrouler sous la configuration des puits.

Seuls les puits vérifiés seront blessés. En cliquant sur activer, une fenêtre contextuelle s’ouvre pour demander des blessures. Après la blessure, vérifiez que le signal tombe à une valeur d’électrode presque sans cellule.

S’il n’a pas répété la blessure généralement pour travailler avec les données, utilisez l’option d’exportation des données et sélectionnez vers Excel. La modélisation RB et alpha, cependant, peut être effectuée à partir du logiciel. À partir des données MFT, n’oubliez pas que la modélisation n’est valable que dans les couches de cellules de confluence.

Et n’oubliez pas d’ajouter la référence acellulaire. Commencez par sélectionner automatiquement une référence sans cellule à l’aide de la fonction de recherche sous la section de modélisation et d’analyse du balayage de fréquence. Acceptez la valeur avec set.

Appuyez ensuite sur model pour lancer les calculs. Ne vous inquiétez pas si cela prend plusieurs minutes. Au cours d’une expérience typique, les cellules passent d’une phase de croissance à une phase de plateau.

Lorsqu’ils atteignent la confluence, les images sont acquises directement à partir de l’électrode au cours de ce processus. La phase suivante est la formation et la maturation de la barrière EC. L’enroulement électrique est ensuite utilisé pour étudier la migration cellulaire.

Une chute caractéristique du signal à la ligne de base est suivie du rétablissement de l’état de confluence. Enfin, la réponse aux stimuli est suivie en temps réel. Ici, l’agent vasoactif thrombine a été appliqué.

Cela a provoqué une contraction cellulaire et donc une ouverture transitoire de petits espaces dans la barrière, ce qui a provoqué une baisse de la résistance d’impédance et les mesures de capacité fournissent des informations complémentaires sur l’adhésion cellulaire et la résistance à la croissance à la mesure la plus sensible. La fréquence représente la qualité et la fonction de la barrière cellulaire et prend en compte la résistance au flux de courant paracellulaire et transcellulaire. Lorsque les cellules se fixent aux électrodes, elles limitent le flux de courant et la capacité diminue proportionnellement.

Cette phase fournit une mesure globale de la couverture des électrodes et est mieux quantifiée lors de l’enregistrement de la capacité à une fréquence supérieure à 40 kilohertz. La résistance donne une idée claire de la façon dont de bonnes cellules peuvent bloquer le flux de courant et donc la qualité de la barrière cellulaire. Par conséquent, les cellules de différents passages et de différents types ont des résistances différentes.

Nos RB et alpha aident à distinguer les adhérences des cellules cellulaires et de la matrice cellulaire. RB est la résistivité des contacts des cellules par rapport au flux de courant, ou une mesure inverse de la perméabilité. Alpha est une mesure des contributions d’impédance des jonctions d’électrodes des cellules.

Les valeurs RB et alpha peuvent être calculées à partir du logiciel ISIS. De petites fluctuations du signal de résistance peuvent être dues à des mouvements subtils dans la couche cellulaire de confluence ou à des micro-mouvements. Ils peuvent être mesurés avec un réseau E à la fréquence la plus sensible et analysés par transformation de Fourier rapide dans les manipulations logicielles de l’EIS qui donnent un aperçu du comportement cellulaire peuvent être faites avec précision.

Par exemple, il est possible de faire une bobine électrique de 250 microns qui se refermera en quelques heures pour étudier la migration cellulaire. La spectroscopie d’impédance est également bien adaptée à l’analyse de l’effet des substances ajoutées. Comme indiqué précédemment, la thrombine rend la barrière cellulaire hyperperméable en abaissant la tension cellulaire basale avec l’inhibiteur de la kinase ARO, l’effet de la thrombine pourrait être diminué Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’ESIS est extrêmement sensible aux changements de l’environnement cellulaire tels que la température, le pH, l’épuisement du milieu, etc.

Après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ologie pour étudier en temps réel les tendances et les effets des agents vasoactifs sur les cultures de cellules de confluence.