Name: Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Découvrez la technique ECIS pour quantifier la prolifération endothéliale, la fonction barrière et la motilité cellulaire en temps réel. Cette méthode bioélectrique permet une analyse automatisée et non invasive des comportements cellulaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Charles Keese, le Dr Christian Renken, Christian Dehnert (Applied Biophysique Inc.) et le Dr Ulf Radler (ibidi GmbH) pour leurs conseils, l&#39;aide et les discussions fructueuses lors de la préparation de ce manuscrit. En outre, nous tenons à remercier Jan van Bezu pour son excellent soutien technique.

Une. Préparation du système de mesure <ol><li> Préchauffer le support de matrice dans un incubateur à 37 ° C avant de commencer l&#39;expérience, afin d&#39;éviter la condensation. </li><li> Remplir cercueil d&#39;eau de l&#39;incubateur avec de l&#39;eau distillée pour éviter le séchage des puits. </li><li> Effectuer toutes les manipulations sur les cellules et les réseaux dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. </li></ol> 2. Préparation de tableaux et inoculation des cellules REMARQUE: Les matrices de ECIS doivent être nettoyés et stabilisée avant une expérience visant à empêcher la dérive d&#39;électrodes, afin d&#39;améliorer la reproductibilité du puits à puits et un rapport signal-sur-bruit. Par conséquent, deux options sont disponibles: A) prétraitement des électrodes avec la fonction de stabilisation de l&#39;ECIS L-cystéine et B). Option A: L-cystéine est recommandé que le pré-traitement plus uniforme, mais peut, dans certains cas particuliers, d&#39;interagir avec la protéine Revêtementsgs sur les électrodes. Les volumes présentés sont utilisés pour les tableaux 8 puits standard. <ol><li> Ajouter 200 ul / puits de 10 mM de L-cystéine. Cystéine nettoie et modifie la surface d&#39;électrode fournissant une capacité élevée et reproductible électrode. </li><li> Incuber 15 min à température ambiante (RT). </li><li> Laver deux fois 500 pl / puits avec de l&#39;eau ultra-pure (type 1). Ne pas utiliser de tampons phosphates, qui peuvent interférer avec l&#39;adsorption de certaines protéines. Evitez également les solutions contenant du sérum avant le revêtement, la surface de l&#39;or va adsorber les premières macromolécules apportés en contact. </li><li> Manteau avec 200 pl / puits chaud 1% de gélatine. </li><li> Incuber 30 min à 37 ° C. </li><li> Retirer la gélatine, mais ne laissez pas sécher la surface. Cela peut endommager les électrodes. </li><li> Laver une fois avec de l&#39;eau ultra-pure (type 1). </li><li> Ajouter 400 ul / puits de milieu complet de culture de cellules (contenant du sérum, les antibiotiques et les facteurs de croissance). </li><li> tableau de diapositives dans un tableau porte und s&#39;assurer que le réseau est positionné de telle sorte que les neuf or pads carrés sont correctement contactés par les broches de pogo ressort et la vis de réglage de correction à la main. Soyez prudent avec les tableaux transparents, la couche d&#39;or peut facilement être endommagé. </li><li> Ouvrez le programme d&#39;installation du logiciel de mesure et presse suivie par chèque dans la section «Collecte des données» pour effectuer une mesure d&#39;impédance rapide de chaque puits. Les valeurs obtenues sont la base de mesure et seront automatiquement stockés dans les &quot;Commentaires&quot;. </li><li> Le contrôle de puits détermine automatiquement le type de tableaux ECIS utilisé. Vérifiez les tableaux sélectionnés dans la section &quot;Bien Configuration&quot;. </li><li> Le schéma de tableau s&#39;allume en vert pour les puits sont correctement raccordés et rouge pour les puits raccordés vides ou incorrectes. Pourtant, assurez-vous toujours que les tableaux ont été placés correctement dans le support. REMARQUE: Si le nettoyage et le revêtement ont réussi les tableaux 8W1E ECIS ont acapacitance d&#39;environ 5 nF et les matrices de 8W10E de 50 nF, ce qui se traduit par une résistance de référence de l&#39;ordre de 200 Ω et 2000, respectivement. </li><li> Retirer tableau de titulaire. </li><li> des cellules de semences sous forme de suspension de cellules individuelles dans 400 ul / puits de milieu complet de culture cellulaire. </li></ol> Option B: La fonction de stabilisation de l&#39;ECIS peut être utilisé comme une alternative ou en combinaison avec le traitement de la L-cystéine et si les problèmes de dérive de la chaîne ou de grandes différences dans la résistance et la capacité du puits à puits se produisent. <ol><li> Effectuer un traitement de cysteine ​​(en option) et des électrodes de pré-couche avec de la protéine (en option). </li><li> Ajouter 200 ul / puits de milieu complet à chaque puits et placer la matrice dans le porte-matrice. </li><li> Ouvrez le logiciel de mesure et appuyez sur Configuration suivie Cocher pour vérifier le réseau est correctement connecté et à mesure initiale Z, R et C. </li><li> Stabiliser les électrodes en appuyant sur <strong&gt; Stabiliser dans la section «Collecte des données». L&#39;ECIS appliquera un courant élevé (ca. 3 mA), haute fréquence (64 kHz) impulsion de nettoyer les électrodes. </li><li> Vérifiez à nouveau les électrodes. Capacité devrait être augmentée et les valeurs de résistance doivent être dans une gamme comparable. </li><li> Si les valeurs de capacité et de résistance sont toujours pas satisfaisants, répétez la stabilisation. </li><li> Retirer tableau du support et inoculer des cellules. </li></ol> 3. Mise en place le logiciel de mesure et d&#39;acquisition de données <ol><li> Placer la matrice dans le porte-matrice comme décrit précédemment. </li><li> Ouvrez le logiciel de mesure et appuyez sur le bouton Configuration dans la section «Collecte des données» pour connecter le logiciel de l&#39;ECIS à l&#39;instrument ECIS et exécuter un autre bien Vérifier. </li><li> Vérifiez les tableaux sélectionnés dans la section &quot;Bien Configuration&quot;. </li><li> Sélectionnez les puits à mesurer dans la &quot;Eh bien Configuratsection ion &quot;. </li><li> Sélectionnez le mode de mesure parmi les options &quot;recueillir des données&quot;: <ol><li> Pour une série de temps à une fréquence fixe, sélectionnez la fréquence unique. / Heure (SFT) et choisir la fréquence de mesure de la menu déroulant. </li><li> Pour la mesure de la couverture de l&#39;électrode et de la modélisation de Rb et Alpha, sélectionnez la fréquence multiple. / Heure (MFT). Le dispositif ECIS mesure automatiquement à toutes les fréquences disponibles. </li><li> Pour micromouvements (voir l&#39;analyse de données), sélectionnez Heure rapide Collect (RTC) et d&#39;ajuster la fréquence de mesure et la fréquence d&#39;échantillonnage. Voici la résolution temporelle standard est un échantillon par seconde (1 Hz), mais la fréquence d&#39;échantillonnage peut également être augmentée pour suivre les changements rapides de l&#39;impédance jusqu&#39;à 25 Hz (pour le Z-Theta). Note importante: en mode RTC un seul puits est mesurée. REMARQUE: Si micromouvements doivent être mesurés dans plusieurs puits par la suite, cliquez sur Aide&gt; Afficher la barre articles d&#39;experts / menu Outils&gt; Acquire&gt; Multi-Eh bien RTC. Spécifiez le Délai (h) dans la section de Collecter les données; la ECIS va maintenant mesurer les puits sélectionnés dans l&#39;ordre numérique. Après le démarrage de la mesure, le logiciel vous demandera de spécifier le nombre de cycles. Entrez la valeur de la fréquence de la mesure doit être répétée. </li></ol></li><li> Pour SFT et MFT, sélectionnez l&#39;intervalle de temps (sec) entre les mesures ou si les données doivent être acquis aussi vite que possible laisser cette option désactivée. REMARQUE: Pour obtenir des données du dispositif d&#39;ECIS utilise un multiplexeur de passer d&#39;un puits à l&#39;autre avec un taux minimum d&#39;acquisition SFT de 0,25 s et 7,5 s pour MFT. Signification de l&#39;intervalle est fonction du nombre de puits sélectionnés et les fréquences. Pour les mesures sur les cellules en prolifération lente ou un simple enregistrement de la résistance en fonction du temps, en utilisant des intervalles de 600 s ou plus. </li><li> Appuyez sur Démarrer, nommez le fichier et sélectionnez l&#39;emplacement de stockage des données. REMARQUE: La taille du fichier ne doit pas être un problème, puisque les données ECIS sont enregistrées dans un type de format de texte brut appelé *. abp, qui ne dépasse jamais quelques centaines de Mo, même avec toutes les fréquences de mesure et le nombre de puits sélectionnés. </li><li> Arrêtez exécuter en appuyant sur ​​Terminer. </li></ol> 4. Changement moyen et Manipulation de cellules <ol><li> Appuyez sur Pause, cela arrêtera l&#39;acquisition de données, mais continuer à fonctionner l&#39;horloge expérimentale. </li><li> Enlever la matrice du support et de manipuler le cadre d&#39;un banc à flux laminaire (ie moyen de changement). </li><li> Placez tableau dans son support et cliquez sur Vérifier la connexion soit ou CV Expérience de poursuivre l&#39;acquisition de données. Le logiciel de mesure va placer un repère temporel dans le jeu de données. </li></ol> 5. Stimulation aiguë lors de l&#39;acquisition de données REMARQUE: Une deuxième option consiste à manipuler les cellules lors de l&#39;acquisition de données pour le suivi des changements immédiats. Ceci n&#39;est possible que; Lorsque les échantillons ne doit pas être stérile dans la suite de l&#39;expérience. <ol><li> Ajouter le stimulus directement au bien et assurez-vous de mélanger prudent avec une pipette ul 200. </li><li> Point Time Mark manuellement en appuyant sur ​​Mark et ajouter un commentaire. </li></ol> 6. Blessant électrique REMARQUE: Trouver les bons réglages pour le type de cellule utilisée est la clé pour blessures électrique. Si blessant est trop courte, cela peut entraîner la suppression insuffisante des cellules, alors que si la blessure est trop long et / ou rugueux, cela peut endommager les électrodes (en particulier sur les réseaux transparents). Par conséquent, plusieurs impulsions de courte blessantes sont recommandés. Pour les cultures HUVEC deux longue blessantes impulsions 10-20 sec de 5 V à 60 kHz chacun ont été trouvés optimale en utilisant la ECIS 1600R. En général, il est recommandé d&#39;utiliser des fréquences élevées&gt; 20 kHz à maintenir des hauts champs uniformes dans les cellules et d&#39;éviter d&#39;endommager les électrodes. <ol><li> Effectuer blessant pendantment une mesure ECIS active. </li><li> Activer Blessure / Setup électroporation, puis cliquez sur la plaie et remplir le temps (sec), la tension de la plaie (V pour 1600 R) ou en cours (uA pour Z et Z-Theta) et la fréquence (Hz). Les valeurs par défaut affichés sont basés sur le type de tableau et le dispositif de l&#39;ECIS. </li><li> Sélectionnez les puits de blesser dans la section &quot;Bien Configuration&quot;. Seuls les puits cochés seront blessés. </li><li> Activer Retarder jusqu&#39;à Heure et remplir le temps de retard pour activer la fonction retard de la plaie. Cette fonction peut être arrêtée à tout moment en appuyant sur ​​Stop ou l&#39;application d&#39;une blessure à la main. Seule une commande de retard peut être actif à la fois. </li><li> Appuyez sur Activer, puis cliquez sur OK dans la fenêtre pop-up pour commencer blessant. </li><li> Assurez-vous que le signal de la résistance tombe à l&#39;impédance décalée après blessure, sinon répéter la blessure. </li></ol> 7. Analyse des données </p&gt; <ol><li> Représentation des données et l&#39;exportation. <ol><li> mesure de finition ou charger des données défini via Fichier -&gt; Ouvrir. </li><li> Sélectionnez puits à afficher dans la fenêtre &quot;configuration bien&quot;. Groupe de puits individuels à présenter à la moyenne. </li><li> A choisi paramètre à afficher à partir de la barre d&#39;outils supérieure (Z, R ou C). </li><li> Sélectionnez le type de la barre d&#39;outils supérieure (T = temps, F = fréquence, 3D = cascade blot) graphique. </li><li> Définir décalage graphique et la gamme avec les curseurs ci-dessous la fenêtre graphique ou de remplir les valeurs exactes dans les contrôles adjacents. </li><li> Choisissez parmi les «Options de la série chronologique&quot; de base dans la section «Analyse» pour effectuer l&#39;écart type, moyenne mobile ou la normalisation des données. </li><li> Activer la barre d&#39;outils Expert dans le menu Aide pour les opérations plus avancées comme Nyuist terrain et de la transformation de Fourier. </li><li> Utilisez &quot;Options d&#39;affichage&quot; dans la section &quot;Analyser&quot; pour définir range de x et y des axes et l&#39;exportation graphique. </li><li> Exporter les données sélectionnées vers un fichier Excel via Fichier -&gt; Exporter des données -&gt; Pour Excel (sélectionnée) et utiliser un logiciel tiers de choix pour une analyse approfondie, les statistiques et la représentation que nécessaire. </li></ol></li><li> Modélisation de Rb et Alpha. NOTE: Pour la modélisation, il est recommandé d&#39;utiliser un milieu acellulaire bien rempli comme référence. <ol><li> Mesure Finition MFT ou charge des données MFT ensemble. </li><li> Si un puits de référence acellulaire est disponible, appuyez soit sur ​​Rechercher pour sélectionner automatiquement la valeur de référence ou Set pour sélectionner le point de temps libre cellulaire manuellement &quot;Freq. Modélisation Scan&quot; dans la section &quot;Analyse&quot;. </li><li> S&#39;il n&#39;y a pas de référence acellulaire, importer une valeur de référence d&#39;un autre ensemble de données. Ouvrez l&#39;ensemble de données de référence (assurez-vous que le même tableau et moyennes ont été utilisées) et utiliser Trouver ou Set pour sélectionner la valeur de référence.Puis accédez à des données mesurées et appuyez sur Get. </li><li> S&#39;il n&#39;y a pas fixés utilisation disponible par défaut d&#39;usine des données de référence sans cellules. </li><li> Appuyez sur Modèle de commencer les calculs. Modélisation peut prendre plusieurs minutes dépendant de la taille de l&#39;ensemble de données. </li></ol></li><li> Calcul des micromouvements. Note: Ce calcul ne fait pas partie du logiciel de mesure, mais peut être réalisée avec n&#39;importe quel logiciel de traitement de signal. <ol><li> Terminez mesure RTC ou charger l&#39;ensemble de données RTC. </li><li> Normaliser fixées par la résistance moyenne de l&#39;ensemble de la période données. </li><li> Cassez fixés en segments d&#39;une longueur de points de 256 données données et nettoyer chaque segment par une fenêtre de Hanning. </li><li> Exécuter une transformation de Fourier 256 points et la moyenne résultant spectres de fréquences à un spectre de puissance 129 points unilatéral de réduire au minimum le bruit aléatoire et amélioré le signal biologique. </li><li> fréquence de Complot contre amplitude dans un graphique log-log et d&#39;appliquerajustement linéaire des moindres carrés. </li><li> La pente de la régression linéaire est une mesure du bruit dans le signal global, et de ce fait les cellules de micro-mouvements. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (17), 7896-7900 (1991).</li>
<li>Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contact%3A+another+factor+may+influence+transepithelial+electrical+resistance+of+cell+layers+cultured+on+permeable+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contact: another factor may influence transepithelial electrical resistance of cell layers cultured on permeable filters.</a> Exp. Cell Res. 250 (2), 576-580 (1999).</li>
<li>Wegener, J., Sieber, M., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+analysis+of+epithelial+and+endothelial+cell+monolayers+cultured+on+gold+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance analysis of epithelial and endothelial cell monolayers cultured on gold surfaces.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 32 (3), 151-170 (1996).</li>
<li>Pänke, O., Balkenhohl, T., Kafka, J., Schäfer, D., Lisdat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+spectroscopy+and+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Impedance spectroscopy and biosensing.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 109 (11/2007), 195-237 (2008).</li>
<li>Wegener, J., Zink, S., Rösen, P., Galla, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrochemical+impedance+measurements+to+monitor+beta-adrenergic+stimulation+of+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Use of electrochemical impedance measurements to monitor beta-adrenergic stimulation of bovine aortic endothelial cells.</a> Pflugers Arch. 437 (6), 925-934 (1999).</li>
<li>Eker, B., Meissner, R., Bertsch, A., Mehta, K., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+recognition+of+drug+resistance+via+impedimetric+screening+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Label-free recognition of drug resistance via impedimetric screening of breast cancer cells.</a> PloS ONE. 8 (3), (2013).</li>
<li>Nacke, T., Anhalt, M., Frense, D., Beckmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anwendungsm%C3%B6glichkeiten+der+Impedanzspektroskopie+in+der+Biotechnologie+%28Application+of+the+Impedance+Spectroscopy+in+the+Biotechnology%29%5BTitle%5D)+AND+%22Technisches+Messen%22%5BJournal%5D)">Anwendungsmöglichkeiten der Impedanzspektroskopie in der Biotechnologie (Application of the Impedance Spectroscopy in the Biotechnology).</a> Technisches Messen. 69 (1/2002), 12-18 (2002).</li>
<li>DePaola,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+impedance+of+cultured+endothelium+under+fluid+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electrical impedance of cultured endothelium under fluid flow.</a> Ann. Biomed. Eng. 29 (8), 648-656 (2001).</li>
<li>Pietrosimone, K. M., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Cellular+Chemotaxis+with+ECIS%2FTaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+cell-substrate+impedance+sensing+%28ECIS%29+as+a+noninvasive+means+to+monitor+the+kinetics+of+cell+spreading+to+artificial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces.</a> Exp. Cell Res. 259 (1), 158-166 (2000).</li>
<li>Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+analysis+of+MDCK+cells+measured+by+electric+cell-substrate+impedance+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing.</a> Biophys. J. 69 (6), 2800-2807 (1995).</li>
<li>Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+motion+of+confluent+cells+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring motion of confluent cells in tissue culture.</a> Exp. Cell Res. 204 (1), 102-109 (1993).</li>
<li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24 (8), 2625-2629 (2009).</li>
<li>Szulcek, R., Beckers, C. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+RhoA+GTPase+activity+regulates+dynamics+of+endothelial+monolayer+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Localized RhoA GTPase activity regulates dynamics of endothelial monolayer integrity.</a> Cardiovasc. Res. 99 (3), 471-482 (2013).</li>
<li>Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li>
<li>Krishnan, R., Klumpers, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.%2C+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 300 (1), 146-154 (2011).</li>
<li>Van Nieuw Amerongen, P. G., van Delft, S., Ma Vermeer, M., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability%3A+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87 (4), 335-340 (2000).</li>
<li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+edema+and+endothelial+barrier+dysfunction+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib.</a> Circulation. 126 (23), 2728-2738 (2012).</li>
</ol>

Applied Biophysique Inc. a couvert les frais d&#39;accès ouvert, tandis que la structure et le contenu de l&#39;article restés entière responsabilité de leurs auteurs.

ECIS est un excellent outil pour le dépistage des propriétés et le comportement cellulaire ainsi que pour la quantification des effets des substances connues et inconnues. Ainsi les cellules sont maintenues dans des conditions de culture standard, impédance peut être contrôlée en permanence avec une haute résolution temporelle et corrélées à des signaux optiques. De cette façon, le point de temps optimal pour les manipulations de cellules peut être choisie sur la base de l&#39;état morphologique et fonctionnelle cellulaire. Malheureusement, cette résolution de mesure élevée est livré avec le prix que les petites variations de température, le pH ou la stimulation mécanique des cellules (changement de milieu) auront une influence sur le signal d&#39;impédance immédiatement. L&#39;application de la faible courant de mesure pour les cellules rend la mesure non invasive de l&#39;ECIS, non destructive et sans étiquette, mais à la suite seulement les propriétés bioélectriques passive peut être mesurée (pas de potentiels d&#39;action). Un élément clé est que un certain nombre de paramètres peut être der<html> Ived partir d&#39;une seule mesure, en combinant les informations provenant de plusieurs essais classiques, comme la perméabilité ou des analyses de la cicatrisation des plaies. Voici l&#39;aspect particulier intéressant est que les données mathématiquement modélisés peuvent être utilisés pour explorer les changements de la résistance et de la capacité et les orienter vers les structures cellulaires distinctes (par exemple cellulaires contacts ou la membrane cellulaire). Est important de noter que la spectroscopie d&#39;impédance fournit toujours un signal moyenne de toutes les cellules sur l&#39;électrode de détection, ce qui ne permet pas d&#39;études sur les cellules simples et aussi le modèle mathématique est valable uniquement dans les couches de cellules confluentes. Par conséquent les cellules endothéliales doivent avoir lieu dans l&#39;état de confluence pour au moins un jour avant utilisé pour la modélisation d&#39;assurer cellulaires adhérences matures et les cellules au repos. De même, les blessures électriques ne doivent être appliquées à confluentes couches cellulaires en utilisant des impulsions multiples blessantes courtes avec des fréquences élevées, pour atteindre l&#39;efficacité optimale blessures et éviter d&#39;endommager les électrodes. jove_content &quot;&gt; Pour obtenir la quantité maximale de l&#39;information à partir d&#39;une mesure de l&#39;ECIS, comme dans chaque essai, plusieurs paramètres tels que la combinaison d&#39;un substrat de matrice, le revêtement et la densité d&#39;ensemencement pour le type de cellule individuelle doivent être testées et optimisées avant d&#39;une expérience. Une limitation importante de l&#39;ECIS est que la mesure ne fournit pas d&#39;information directe sur le niveau moléculaire. Ainsi mesures ECIS sont généralement plus informative au début d&#39;une série d&#39;expériences pour aider à associer un problème scientifique avec des structures ou des propriétés cellulaires et de fournir des données importantes pour la génération d&#39;une hypothèse testable. Par conséquent, la conception modulaire de l&#39;ECIS fournit un large éventail d&#39;applications avec la possibilité pour Tailor Made tableaux. Les derniers développements de tableau indiquent un avenir accent sur ​​haut débit projections d&#39;impédance pour la prolifération cellulaire et la blessure électrique et l&#39;avance des tableaux de flux spéciaux pour la simulation in vivo </em&gt; cisaillement avec des profils de flux différents. Documentation supplémentaire S&#39;il vous plaît se référer également à la page Web de la biophysique appliquées (www.biophysics.com) pour les notes d&#39;application, des webinaires et une liste détaillée des publications couvrant l&#39;ensemble du spectre ECIS.

ΩΩΩHere nous présentons Cell-substrat électrique Impedance Sensing, connu comme l&#39;ECIS, une méthode spécifique pour mesurer et analyser le spectre de cellules adhérentes en culture une impédance. L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;offrir un guide général applicable à l&#39;utilisation de ce type particulier de l&#39;impédance en fonction des dosages cellulaires et fournir des protocoles pour certaines des fonctions clés du nombre sans cesse croissant d&#39;applications. L&#39;accent sera mis sur l&#39;étude de la prolifération cellulaire, la fonction de barrière, les jonctions cellulaires, et la motilité cellulaire. Depuis ECIS et son modèle associé pour transformer les données de spectroscopie d&#39;impédance dans les paramètres biologiques pertinents a été introduit sous sa forme actuelle à la communauté scientifique par Giaever et Keese en 1991 2, il a souvent été considéré comme un système de mesure de TEER (trans -épithéliale de résistance électrique), ce qui n&#39;est pas exact. Les différences apparaissent marginales au premier abord, maissont importants pour l&#39;interprétation des données. Pour les mesures de TEER classiques, les cellules sont cultivées sur des filtres perméables à caractériser les mécanismes de transport paracellulaires, qui sont dominés par des jonctions serrées épithéliales ou endothéliales adhérentes jonctions 3. Communément, les deux électrodes placées au-dessus et en dessous du filtre sont utilisés pour appliquer un courant continu (DC) couler sur la couche de cellules et de deux autres électrodes afin de mesurer la chute de tension résultante 4. La résistance électrique est calculée en utilisant la loi d&#39;Ohm, ce qui permet une description numérique de la qualité de la barrière cellulaire. ECIS suit ce principe de base et l&#39;étend. Dans le système de l&#39;ECIS, les cellules sont cultivées sur des électrodes opposées, de l&#39;or circulaires qui sont incorporés dans le fond de boîtes spéciales de culture cellulaire. Le nombre d&#39;électrodes par la culture est ainsi variable dépend de l&#39;application et les électrodes ont un diamètre standard de 250 um, dans certains cas, un plus grand contre-électrodeest utilisé pour compléter le circuit. ECIS utilise un courant alternatif constant (AS) de 1 uA avec une fréquence donnée à la place d&#39;un courant continu. L&#39;impédance est calculée à partir des variations correspondantes de la tension (en mV) entre les électrodes. ECIS offre la possibilité de mesurer l&#39;impédance sur une plage de fréquences pour étudier les propriétés cellulaires dépendant de la fréquence, ce qui a plusieurs avantages par rapport TEER et seront expliquées en détail dans cet article. Tout d&#39;abord, la mesure de l&#39;impédance complexe permet de séparer l&#39;impédance globale dans la résistance de la barrière de cellules et la capacité de la cellule. En outre, en prenant des données à des fréquences multiples et l&#39;application d&#39;un modèle mathématique, on peut distinguer entre l&#39;impédance de jonction (raideur des contacts cellule-cellule) et de l&#39;impédance causée par des interactions cellule-substrat (la distance de la membrane des cellules basales de la matrice sous-jacente), ainsi que la contribution de la capacité de la membrane cellulaire. Deuxièmement, la prolifération cellulaire et la motilité peuvent être évaluées, puisque la cellules sont en contact direct avec les électrodes. Troisièmement, le substrat et les électrodes sont suffisamment minces pour permettre le champ lumineux et microscopie à contraste de phase. Base de mesures d&#39;impédance: L&#39;impédance complexe La base de la mesure de l&#39;impédance électrique d&#39;objets biologiques (par exemple des cellules) est la loi d&#39;Ohm, un principe de l&#39;électro-technique de base, qui décrit la relation entre la résistance (R), le courant (I) et la tension (U) à un circuit électrique à un instant donné (t). Applicable dans le circuit DC: R (t) = U (t) / I (t) Lorsque l&#39;on travaille dans le système de climatisation, le courant et la tension ne diffèrent pas dans leur amplitude, mais également dans leur phase (φ). Maintenant, la résistance n&#39;est plus suffisant pour décrire ces relations. Au lieu de cela, l&#39;impédance complexe (Z) ou, dans la plupart des cas, l&#39;amplitude de l&#39;impédance (| Z |) sont utilisés, contenant la résistance ohmique précédemment décrit, plus la réactance (X), qui resultats de courant alternatif s&#39;écoule à travers les condensateurs et les inductances route du déphasage entre la tension et le courant 5. Applicable dans le circuit AC: | Z (f) | = √ (R 2 + X (f) 2) φ = arctan (X / R) Pour effectuer des mesures d&#39;impédance sur des cellules intactes, en raison des caractéristiques de leur membrane, les cellules agissent comme une connexion parallèle d&#39;une résistance et d&#39;un condensateur. Ici, la résistance représente l&#39;opposition à la circulation du courant, tandis que la capacité (C), on décrit la séparation de porteuses électriques dans le bi-couche isolant de la membrane cellulaire qui provoque la polarisation de la cellule. Ainsi X est dominée par les propriétés capacitives de la membrane cellulaire. X (f) ≈ (2 * pi * f * C Cell) -1 Etant donné que X est dépendante de la fréquence, de la variation de la fréquence de mesure permet l&#39;étude de différentes propriétés fonctionnelles et structurelles de la cellule. Les mesures de l&#39;appareil de ECIS la fois R et X, qui permet de calculerde | Z |, C et φ. Quantification des couches de cellules entières avec la spectroscopie d&#39;impédance: Le circuit électrique équivalent. Comme expliqué précédemment, quand une cellule est amenée en un champ électrique, elle montre les propriétés des composants électroniques passifs. Si maintenant, au lieu d&#39;une seule cellule, une couche entière de cellules cultivées sur le dessus d&#39;électrodes et complété par du milieu de culture cellulaire est étudié, le modèle simple de la résistance et du condensateur doit être étendue à l&#39;ensemble d&#39;un réseau électrique. Dans ce circuit que l&#39;on appelle l&#39;équivalent, la résistance du milieu de culture (R M) ainsi que la capacité (C Electr) et une résistance (R Electr) caractérisant l&#39;interaction électrode / électrolyte doivent être envisagés 3,6. Un, exemple général simplifié d&#39;un tel circuit équivalent pour une couche de cellules adhérentes en croissance peuvent être trouvées dans la figure 1. L&#39;avantage d&#39;un tel mathématiquePPROCHE pour décrire un système biologique, c&#39;est que ces circuits peuvent être affinés ad libitum et ajustés aux questions expérimentales spécifiques, par exemple en tenant compte de l&#39;impédance causée par organelles intracellulaires ou de distinguer les influences de la cellule-cellule (R jonction), et adhérences cellule-substrat (R Sub) sur 7,8 globale d&#39;impédance. Néanmoins, le but de la modélisation devrait toujours être d&#39;utiliser le plus petit nombre d&#39;éléments décrivant toutes les caractéristiques du spectre d&#39;impédance mesurée pour permettre des corrélations significatives. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51300/51300fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Schéma du système de l&#39;ECIS et circuit équivalent représentant une couche de cellules en croissance adhérentes. A) de la section de la Croix d&#39;une culture de l&#39;ECIS bien. Les cellules sont de plus en plus au-dessus de détection et contre-électrode et unere recouvert de milieu de culture. Les électrodes sont reliées à un amplificateur lock-in et un signal de courant alternatif est appliqué par l&#39;intermédiaire d&#39;une résistance de 1 MQ pour créer une source de courant constant. Stimuli peuvent être ajoutées directement au milieu de culture à tout moment dans le temps. B) des mesures d&#39;ECIS la somme de toutes les contributions individuelles à l&#39;impédance. Résistance du milieu de culture (R M) ainsi que l&#39;impédance causée par l&#39;interface électrode / électrolyte, qui est pour plus de simplicité présentés comme une combinaison en parallèle d&#39;une résistance (R Electr) et un condensateur (C Electr), ainsi que les propriétés électriques de la membrane cellulaire, décrite par un montage en parallèle d&#39;une résistance (R cellulaire) et la capacitance (C Mem), doivent tous être pris en considération. R cellulaire est variable, car elle dépend de la perméabilité des cellules en direction du courant. Le circuit équivalent peut être étendu et affiné ad libitum. A titre d&#39;exemple de jonction (R Junc) commeainsi que la résistance sous-endothélial (R Sub) ont été ajoutés au circuit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51300/51300fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> paramètres d&#39;impédance et leur signification biologique Les deux paramètres les plus directs dérivées de mesures d&#39;impédance sont la résistance et la capacité des cellules. Résistance représente la qualité et la fonction de la barrière de la cellule et prend en considération la résistance à l&#39;égard de para-et de la circulation du courant trans-cellulaire donc. Capacité fournit une mesure globale de la couverture de l&#39;électrode. La particularité de l&#39;ECIS est que, avec l&#39;aide de circuits équivalents et la modélisation de ces paramètres globaux donnent un aperçu sur de nombreuses propriétés plus cellulaires, y compris les adhésions cellule-cellule et cellule-substrat, qui seront discutées plus tard dans cet article. Avant de commencer: considé expérimentalevivres configuration de la mesure - La configuration se compose de plusieurs éléments distincts: l&#39;appareil ECIS avec l&#39;électronique de mesure; PC pour l&#39;acquisition de données, support de tableau pour le 8 - ou système à 96 puits; tableaux ECIS et de la culture cellulaire de choix. Le porte-matrice doit être placée dans un incubateur et relié au dispositif de ECIS l&#39;extérieur de la couveuse. Le PC doit être équipé du logiciel de l&#39;ECIS (1.2.123.0 du 14 Février 2013) et relié au dispositif de l&#39;ECIS. sélection Array - Il ya une variété sans cesse croissante de tableaux ECIS, conçus pour de multiples applications. Les réseaux classiques sont la 8W1E et les matrices de 8W10E, qui sont composées de 8 puits de culture (indiquées par W) comprenant une ou 10 électrodes de mesure (indiqués par E), respectivement. Un grand contre-électrode complète le circuit, mais son impédance est essentiellement négligeable dans la mesure proprement dite 6. Le titulaire du tableau 8 puits standard peut accueillir deux unerrays, résultant en un nombre total de 16 puits de culture. Les électrodes en or sont de 50 nm d&#39;épaisseur, délimitée par un film isolant et montées de part et d&#39;un substrat de polycarbonate Lexan optiquement clair ou une carte de circuit imprimé (PCB). Les tableaux contenant des BPC sont plus robustes et rentables. Les lames transparentes permettent de microscopie optique et d&#39;immunofluorescence. Ce qu&#39;il faut considérer, c&#39;est que le tableau 1E améliore les fluctuations du signal de résistance causé par les mouvements cellulaires et est nécessaire pour les études de cicatrisation des plaies. En outre, les électrodes individuelles permettent corrélation des signaux électriques et optiques. Dans les réseaux d&#39;électrodes multiples, le signal est moyenné sur plusieurs électrodes, qui en raison de la surface augmentée de mesure comprend plus de cellules dans la mesure, limite le biais des données par inoculation inégale et la croissance des cellules et réduit le flou du signal due à la cellule motions. Par conséquent, les matrices d&#39;électrodes multiples sont utiles pour étudier la prolifération cellulaire et la formation de la barrière. À côté detableaux standard, il ya des tableaux spéciaux pour l&#39;application de la contrainte de cisaillement 9, pour étudier la chimiotaxie 10, la migration cellulaire et la prolifération ainsi que des plaques à 96 puits pour les projections à haut débit. Pour conclure, le tableau doit être utilisé dépend fortement question scientifique et le type de cellule et doit être sélectionné et testé avec soin. fréquence de la mesure - La modélisation de Rb et alpha (voir l&#39;analyse de données) nécessite des mesures de fréquences multiples (MFT). Sinon impédance peut être mesurée au cours du temps à une fréquence spécifique de type cellulaire (SFT), avec l&#39;avantage que les données peuvent être recueillies avec une résolution temporelle plus élevée. La fréquence de mesure plus sensible pour un type de cellule spécifique peut être trouvée par des balayages de fréquence. Lors du traçage impédance respectivement résistance fonction de la fréquence dans un log-logarithmique de la fréquence où la différence entre le libre-cellule et cellule-électrode enrobée est la plus grande est la fréquence à laquelle bloquent les cellules Til courant le plus efficacement possible. Dans le cas des cellules endothéliales (CE) cette fréquence est d&#39;environ 4 kHz. Densité de semis - Comme à chaque densité régulière expérience ensemencement à base de cellules dépend du problème scientifique. Lorsque l&#39;on étudie l&#39;adhérence et d&#39;étalement ou de la formation de la barrière, les cellules endotheliales doivent être ensemencées avec une densité élevée de 40.000-60.000 cellules / cm 2 pour garantir un confluentes, barrière stable après 48 heures. Si la mise au point de l&#39;expérience est de prolifération, les cellules endotheliales doivent être ensemencées avec une faible densité d&#39;environ 2.000-10.000 cellules / cm 2.

<table><tbody><tr><td>ECIS Z&theta ;</td><td>Applied Biophysics Inc., Troie, NY, États-Unis</td><td>ibidi GmbH, Munich, Allemagne</td><td></td></tr><tr><td>8W1E PCB Electrode</td><td>Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, États-Unis</td><td>ibidi GmbH, Munich, Allemagne</td><td></td></tr><tr><td>8W1E Lexan Electrode Array</td><td>Applied Biophysics Inc., Troy, NY, États-Unis</td><td>ibidi GmbH, Munich, Allemagne</td><td></td></tr><tr><td>8W10E PCB Electrode</td><td>Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, États-Unis</td><td>ibidi GmbH, Munich, Allemagne</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Merck Millipore</td><td>102838</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Merck Millipore</td><td>104070</td><td></td></tr><tr><td>Thrombine bovine</td><td>Merck Millipore</td><td>604980</td><td></td></tr><tr><td>Albumane (albumine sérique humaine)</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris Biosciences</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Stylo/Strep</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr></tbody></table>

Électrique cell-substrat impedance sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS) est un système de mesure d&#39;impédance in vitro pour quantifier le comportement des cellules dans des couches de cellules adhérentes. À cette fin, les cellules sont cultivées dans des chambres de culture spéciales sur le dessus de opposées, des électrodes d&#39;or circulaires. Un petit courant alternatif constant est appliqué entre les électrodes et le potentiel aux bornes est mesurée. Les propriétés isolantes de la membrane cellulaire créent une résistance à la circulation du courant électrique résultant en une augmentation de potentiel électrique entre les électrodes. Mesure de l&#39;impédance cellulaire de cette manière permet l&#39;étude automatisée de l&#39;attachement cellulaire, la croissance, la morphologie, la fonction et la motilité. Bien que la mesure de l&#39;ECIS lui-même est simple et facile à apprendre, la théorie sous-jacente est complexe et le choix des bons réglages et l&#39;analyse et l&#39;interprétation des données correcte n&#39;est pas évident. Pourtant, un protocole clair décrivant les différentes étapes de l&#39;expérimentationla conception de la préparation, la réalisation et l&#39;analyse de l&#39;expérience n&#39;est pas disponible. Dans cet article, le principe de mesure de base ainsi que les applications possibles, des considérations expérimentales, les avantages et les limites du système de ECIS sont discutées. Un guide est prévu pour l&#39;étude de la fixation des cellules, d&#39;étalement et de la prolifération, la quantification du comportement des cellules dans une couche confluente, en ce qui concerne la fonction de barrière, la motilité cellulaire, de la qualité des adhérences cellule-cellule et cellule-substrat, et la quantification de la cicatrisation des plaies et réponses cellulaires à des stimuli vasoactifs. Les résultats représentatifs sont décrits sur la base de micro-vasculaire humain (MVEC) et ombilicaux cellules endothéliales humaines de veine (HUVEC), mais sont applicables à toutes les cellules en croissance adhérentes.

Ce protocole d&#39;évaluations Cell-substrat électrique impédance de détection, un procédé pour enregistrer et analyser le spectre de cellules adhérentes d&#39;impédance pour la quantification de la fixation cellulaire, la prolifération, la motilité et la réponse cellulaire aux stimuli pharmacologiques et toxiques. La détection de la perméabilité endothéliale et l&#39;évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat sont mis en évidence.

Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser la détection d'impédance électrique par substrat cellulaire, appelée EIS, pour caractériser les comportements cellulaires. Cela est réalisé en cultivant des cellules sur des électrodes disposées en réseau et en effectuant des mesures dans différents modes afin de quantifier la formation, la maturation et la fonction de la barrière endothéliale. Des manipulations telles qu'un traumatisme électrique ou l'ajout de stimulateurs sont ensuite effectuées pour tester la motilité cellulaire et la fonction de la barrière. Les résultats obtenus permettent de décrire l'attachement cellulaire, la prolifération, la migration, la détection de la perméabilité endothéliale et l'évaluation des contacts cellule-cellule et cellule-substrat, basés sur l'EIS.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, par exemple en fournissant une génération en continu de données quantitatives, ou en caractérisant les cellules dans leur état naturel de confluence, dans leurs conditions standard de culture cellulaire. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car la théorie sous-jacente semble complexe, et il est nécessaire de prendre en compte plusieurs aspects fondamentaux avant de commencer une expérience. Pour commencer, les réseaux doivent être nettoyés et stabilisés afin de prévenir la dérive des électrodes, d'améliorer la reproductibilité et d'augmenter le rapport signal sur bruit.Par conséquent, ajoutez 200 microlitres de EL ine à 10 millimolaire dans chaque puits d'un réseau de huit puits après 15 minutes. À température ambiante, éliminez la cystine EL par deux lavages avec de l'eau ultrapure, et non par des tampons phosphates. En outre, n'exposez pas les électrodes à des solutions contenant du sérum avant le revêtement, car elles pourraient interférer avec l'absorption des protéines. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de gélatine à 1 % préchauffée dans chaque puits et incubez le réseau pendant une demi-heure à 37 degrés Celsius.Pour éliminer la gélatine, utilisez de l'eau ultrapure et veillez à ce que les surfaces des électrodes ne s'assèchent pas. Ensuite, remplissez les puits avec 400 microlitres de milieu de culture complet, qui peut désormais contenir du sérum. Insérez la matrice dans le support.Vérifiez les neuf carrés dorés. Ils doivent entrer en contact avec les broches POGO. Fixez soigneusement le dispositif en place manuellement, en resserrant la vis de réglage sur l'ordinateur.Ouvrez le logiciel de mesure. Appuyez sur configuration, puis vérifiez dans la section collecte de données pour effectuer une mesure d'impédance rapide de chaque puits à la fréquence par défaut de 4 000 hertz. Les valeurs seront stockées dans la section des commentaires.Vérifiez que la sélection a correctement identifié le type de réseau de SIE utilisé dans la section configuration des puits sur le schéma du réseau. Le rouge et le vert indiquent le fonctionnement des connexions. Si le nettoyage et le codage ont été effectués avec succès, huit réseaux W un E sys devraient afficher environ cinq à six NANOFA RAD et huit réseaux W 10 E.La résistance de base de 50 à 60 nanofarads avant l'ensemencement des cellules est donc d'environ 2000 ohms. Pour modéliser les données à l'aide de RB alpha et cm, démarrez un enregistrement MFT avec le réseau présentant un défaut du milieu. Enregistrez 15 minutes de données sans cellules, puis terminez l'expérience en ajoutant les cellules.Retirez maintenant le réseau et semez 400 microlitres de suspension cellulaire unique dans chaque puits. Pour étudier la croissance cellulaire, semez 10 000 cellules par centimètre carré afin de commencer avec une population quasi confluente ; semez 60 000 cellules par centimètre carré. Après avoir chargé le réseau dans le support, sélectionnez, dans la section de configuration des puits, les puits à mesurer.Ensuite, accédez aux options de collecte des données et sélectionnez un mode de mesure pour une série temporelle à fréquence fixe : choisissez SFT, puis sélectionnez la fréquence de mesure pour évaluer la couverture de l'électrode et modéliser RB et alpha ; choisissez MFT, et l'appareil effectuera automatiquement des mesures à toutes les fréquences disponibles. Exécutez la mesure en mode multifréquence chaque fois que possible. Cela nécessite des données à toutes les fréquences disponibles et fournit ainsi les informations les plus complètes.Pour l'analyse des micro-mouvements, sélectionnez RTC et ajustez la fréquence d'échantillonnage. La résolution temporelle standard est d'un hertz, mais elle peut être augmentée pour suivre les changements rapides d'impédance. La valeur peut être portée à 25 hertz pour le z theta.Pour mesurer successivement les micro-mouvements dans de nombreux puits, sélectionnez le menu d'aide. Ensuite, choisissez les éléments du menu afficher la barre d'outils expert et acquérir le RTC multi-puits. Dans la section collecte des données, veillez à préciser la limite de temps en heures.Lorsque vous utilisez ce paramètre, le logiciel demandera le nombre de cycles après le démarrage de l'acquisition des données. Lors de la collecte des données à l'aide de SFT ou de MFT, sélectionnez l'intervalle de temps entre les mesures, indiqué en secondes. Pour une acquisition de données maximale, laissez cette option non cochée.Appuyez maintenant sur démarrer et spécifiez où les données doivent être stockés. L'exécution s'arrête en appuyant sur terminer. En appuyant sur pause, l'acquisition des données s'interrompt, mais l'horloge expérimentale continue de fonctionner.Retirez maintenant le dispositif et, sous une hotte à flux laminaire, manipulez les puits. Après avoir remis le dispositif dans son support, cliquez sur « vérifier la connexion » pour contrôler les connexions électriques, puis reprenez l'expérience afin de continuer la collecte des données. Si les cellules n'ont pas besoin d'être stériles après la manipulation, un stimulus tel que la thrombine peut être ajouté directement dans un puit pendant l'acquisition des données.De telles variations introduites peuvent être marquées sur l'horloge expérimentale en appuyant sur « mark » et en ajoutant un commentaire. Une autre option consiste à provoquer une blessure électrique aux cellules. Les réglages nécessitent quelques ajustements pour obtenir un temps de blessure court, car cette méthode n'est pas efficace si elle est trop longue, et vous risquez d'endommager les électrodes.Commencez simplement par les paramètres par défaut fournis par le logiciel, puis procédez à partir de là. Allez à la section Configuration du parcours électro-blessure et activez la fonctionnalité de blessure. Sélectionnez ensuite les puits à blesser dans la configuration des puits.Seulement les puits cochés seront blessés. Cliquer sur activer affiche une fenêtre contextuelle invitant à effectuer la blessure. Après la blessure, vérifier que le signal chute jusqu'à une valeur correspondant à un électrode presque dépourvue de cellules.S'il ne répétait pas généralement la blessure pour travailler avec les données, utilisez l'option d'exportation des données et sélectionnez Excel. La modélisation RB et alpha, en revanche, peut être effectuée directement dans le logiciel. À partir des données MFT, rappelez-vous que la modélisation n'est valide que pour des couches cellulaires confluentes.Et n'oubliez pas d'ajouter la référence sans cellules. Commencez par sélectionner automatiquement une référence sans cellules à l'aide de la fonction de recherche dans la section de modélisation et d'analyse du balayage de fréquence. Acceptez la valeur en cliquant sur définir.Appuyez ensuite sur modèle pour démarrer les calculs. Ne soyez pas inquiet si cela prend plusieurs minutes. Au cours d'une expérience typique, les cellules passent d'une phase de croissance à une phase de plateau.Lorsqu'elles atteignent la confluence, des images sont acquises directement à partir de l'électrode au cours de ce processus. La phase suivante correspond à la formation et à la maturation de la barrière endothéliale. Une lésion électrique est ensuite utilisée pour étudier la migration cellulaire.Une baisse caractéristique du signal jusqu'à la ligne de base est suivie par la réinstauration de l'état de confluence. Enfin, la réponse aux stimuli est suivie en temps réel. Ici, l'agent vasoactif thrombine a été appliqué.Cela a provoqué une contraction cellulaire et, par conséquent, une ouverture transitoire de petits intervalles dans la barrière, ce qui a entraîné une diminution des mesures d'impédance, de résistance et de capacité, fournissant des informations complémentaires sur l'adhésion cellulaire et la résistance à la croissance dans le relevé le plus sensible. La fréquence reflète la qualité et la fonction de la barrière cellulaire et tient compte de la résistance au passage du courant paracellulaire et transcellulaire. Lorsque les cellules s'attachent aux électrodes, elles limitent le passage du courant et la capacité diminue proportionnellement.Cette phase fournit une mesure globale de la couverture des électrodes et est mieux quantifiée lors de l’enregistrement de la capacité à une fréquence supérieure à 40 kilohertz. La résistance indique clairement dans quelle mesure les cellules peuvent bloquer le passage du courant et, par conséquent, la qualité de la barrière cellulaire. Ainsi, les cellules provenant de différents passages et de différents types présentent des résistances différentes.Notre RB et alpha permettent de distinguer les adhésions entre cellules des adhésions cellule-matrice. La RB est la résistivité des contacts entre cellules au passage du courant, ou une mesure inverse de la perméabilité. L'alpha est une mesure des contributions à l'impédance provenant des jonctions cellule-électrode.Les deux valeurs RB et alpha peuvent être calculées à l'aide du logiciel ISIS. De légères fluctuations du signal de résistance peuvent résulter de mouvements subtils au sein de la couche cellulaire confluentes ou de micro-mouvements. Elles peuvent être mesurées à l'aide d'un seul réseau E à la fréquence la plus sensible et analysées par transformation de Fourier rapide dans le cadre des manipulations offertes par le logiciel EIS, permettant ainsi d'obtenir des informations précises sur le comportement cellulaire.Par exemple, il est possible de créer une lésion électrique de 250 microns qui se refermera en quelques heures afin d'étudier la migration cellulaire. La spectroscopie d'impédance convient également bien à l'analyse de l'effet de substances ajoutées. Comme mentionné précédemment, la thrombine rend la barrière cellulaire hyperperméable en réduisant la tension basale des cellules ; avec un inhibiteur de la kinase ARO, l'effet de la thrombine pourrait être atténué. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la SIÉ est extrêmement sensible aux changements de l'environnement cellulaire, tels que la température, le pH, l'épuisement du milieu, etc.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la ology pour étudier les tendances et les effets des agents vasoactifs sur des cultures cellulaires confluentes en temps réel.

electric-cell-substrate-impedance-sensing-for-quantification

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Une technique basée Impédance électrique en temps réel pour mesurer Invasion de monocouche de cellules endothéliales par les cellules cancéreuses

Le transistor électrochimique organique est intégré avec des cellules vivantes et utilisé pour contrôler le flux d'ions à travers la barrière épithéliale gastro-intestinal. Dans cette étude, une augmentation du flux d'ions, lié à la perturbation des jonctions serrées, induite par la présence du chélateur de calcium EGTA (ethylene glycol-bis (éther bêta-amino-éthyl)-N, N, N ', acétique N'-tétra acide), est mesurée.

Détection de perturbation des tissus barrière avec un transistor électrochimique organique

Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d'adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d'une manière non-invasive par l'impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation adhérence dépendant.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Ici, nous décrivons un modèle murin in vitro de la barrière hémato-encéphalique qui utilise la spectroscopie cellulaire d’impédance, en mettant l’accent sur les conséquences sur l’intégrité et la perméabilité des cellules endothéliales lors de l’interaction avec les cellules T activées.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Cette publication décrit la fabrication d’un dispositif d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées pour la quantification directe de résistance électrique transendothéliale (TEER). Pour la validation, la barrière hémato - encéphalique a été imitée à l’intérieur de ce dispositif microfluidique et sa fonction de barrière a été suivie. Les méthodes présentées pour l’intégration de l’électrode et quantification directe de TEER sont généralement applicables.

Fabrication et Validation d’un système d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées à quantifier directement transendothéliale résistance électrique

Ici, nous démontrons comment mettre en place un volt-amperemètre bon marché avec la fréquence de sortie programmable qui peut être utilisé avec des électrodes de baguette disponibles dans le commerce pour les mesures de résistance électrique transépithéliale/endothéliale.

Une approche simple pour effectuer des mesures TEER à l'aide d'une Volt-Amperemètre auto-faite avec fréquence de sortie programmable

Le cancer est une maladie mortelle en raison de sa capacité à métastaser à différents organes. Déterminer la capacité des cellules cancéreuses à migrer et à envahir dans diverses conditions de traitement est crucial pour évaluer les stratégies thérapeutiques. Ce protocole présente une méthode pour évaluer les capacités métastatiques en temps réel d’une lignée de cellules cancéreuses de glioblastome.

Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses

La présente étude décrit un protocole permettant de surveiller les changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) au cours d’une infection virale à l’aide d’un système d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA).

Surveillance des changements dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine lors d’une infection virale à l’aide de l’analyse cellulaire en temps réel basée sur l’impédance

L’étude suivante évalue le profil toxicologique d’un cadre métallo-organique sélectionné à l’aide de la détection d’impédance cellule-substrat électrique (ECIS), une technique de criblage à haut débit en temps réel.

Détection électrique cellule-substrat pour l’évaluation en temps réel des profils toxicologiques des structures organométalliques

Ce protocole décrit un modèle in vitro fiable et efficace de la barrière hémato-encéphalique. La méthode utilise des cellules endothéliales vasculaires cérébrales de souris bEnd.3 et mesure la résistance électrique transmembranaire.

Enregistrement de l’intégrité fonctionnelle de la barrière sur les cellules endothéliales vasculaires bEnd.3 via la détection de résistance électrique transendothéliale

Nous démontrons ici la technique d’utilisation de biocapteurs basés sur l’impédance : ECIS et cellZscope, pour mesurer la force de la barrière endothéliale cérébrale. Nous détaillons la préparation et la technique d’ajout de divers stimuli à un modèle in vitro de l’endothélium cérébral. Nous mesurons, enregistrons et donnons une analyse représentative des résultats.

Mesure des changements dans l’intégrité de la barrière endothéliale cérébrale à l’aide de deux biocapteurs basés sur l’impédance en réponse aux cellules cancéreuses et aux cytokines

Découvrez la technique ECIS pour quantifier la prolifération endothéliale, la fonction barrière et la motilité cellulaire en temps réel. Cette méthode bioélectrique permet une analyse automatisée et non invasive des comportements cellulaires.

Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité (Vidéo) | JoVE Journal

Électrique Cell-substrat Impedance Sensing pour la quantification de la prolifération endothéliale, de la fonction barrière, et la motilité

Explorer plus de vidéos