Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et d'associer du tissu neuronal de souris E17, afin de cultiver, enregistrer et stimuler des réseaux neuronaux sur des matrices de microélectrodes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude de la dynamique des réseaux, en lien avec les mécanismes fondamentaux de l'apprentissage et de la mémoire. Le principal avantage de cette technique est que les matrices de microélectrodes permettent d'enregistrer simultanément à partir de plusieurs sites et offrent ainsi une meilleure résolution spatiale et temporelle, par rapport à l'enregistrement classique à un seul site à l'aide de pipettes en verre.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la dynamique des réseaux liée à l'apprentissage et à la mémoire, elle peut également être utilisée pour étudier la toxicité des médicaments ou concevoir des paradigmes destinés à la médecine personnalisée de nouvelle génération. La démonstration visuelle de ce processus est essentielle, car la manipulation du tissu au cours des étapes de dissection et de dissociation est difficile à maîtriser uniquement par la lecture de protocoles. Pour préparer la matrice, ajouter de 40 à 50 microlitres de laminine décongelée au centre de chaque MEA, et 0,2 millilitre de laminine dans les plaques témoins, en utilisant des embouts de pipette stériles.

Couvrez toutes les MEA et les boîtes témoins dans la hotte de biosécurité, puis transférez-les dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après une heure, retirez soigneusement l'excès de laminine au centre des MEA par aspiration à l'aide de pipettes Pasteur stériles, et laissez la surface sécher à l'air avant le semis. Ensuite, versez le milieu L-15 dans quatre boîtes de Pétri de 100 millimètres, couvrez-les, puis placez-les dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant environ 40 à 60 minutes, jusqu'à ce que le milieu ait une consistance boueuse, mais ne soit pas complètement gelé.

Pour préparer la dissection, placez une boîte de Pétri en verre retournée dans un plateau rempli de glace. Pulvérisez ensuite l'abdomen inférieur de l'animal avec de l'éthanol à 70 %. À l'aide de petites ciseaux chirurgicaux, effectuez une incision en forme de V à travers la peau et la graisse sous-cutanée de l'abdomen inférieur, en prolongeant l'incision jusqu'aux extrémités distales de la cavité thoracique, afin d'exposer l'utérus.

À l’aide de pinces, soulevez délicatement l’utérus entre les embryons. Retirez le tissu conjonctif avec des ciseaux de dissection jusqu’à ce que l’utérus soit entièrement libéré. Rincez ensuite brièvement l’utérus avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer tout résidu sanguin, puis placez-le dans l’une des quatre boîtes de Pétri remplies de L-15 froid.

Ensuite, libérez chaque embryon de l'utérus et du sac embryonnaire interne à l'aide de deux paires de pinces fines. Placez les embryons libérés dans la deuxième boîte de Pétri remplie de L-15 froid, puis transférez les têtes dans la troisième boîte de Pétri et les corps dans la quatrième. Dans la hotte biosécurisée, placez un morceau de papier filtre stérilisé par autoclavage sur le plateau en verre refroidi de la boîte de Pétri, puis déposez une tête d'embryon sur le papier filtre.

Ensuite, insérez le bord tranchant de la lame inférieure des ciseaux à iris à la base du crâne, en maintenant cette lame inférieure contre la surface interne du crâne et à distance du cerveau, puis sectionnez la plaque occipitale, suivie de la ligne médiane située entre les plaques pariétales. Poursuivez la coupe en direction rostrale, entre les plaques crâniennes frontales cartilagineuses. Puis, en partant du centre de la plaque occipitale, effectuez une incision perpendiculaire vers la gauche et vers la droite par rapport à la coupe médiane.

Ensuite, glissez délicatement une petite spatule entre la surface ventrale du cerveau et les plaques osseuses inférieures du crâne, jusqu'à ce qu'elle se trouve entièrement sous le cerveau. Soulevez ensuite la spatule pour extraire le cerveau. À l'aide d'une spatule propre, retirez d'abord le bulbe olfactif, puis disséquez le lobe frontal selon un motif trapézoïdal.

Ensuite, transférez le tissu dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant le milieu de conservation. Dans cette procédure, utilisez deux lames de scalpel stériles pour hacher finement le tissu. Puis ajoutez 2,5 millilitres du mélange DNase-papaine au tissu haché dans la boîte de Pétri.

Agiter doucement la boîte de Pétri pour s'assurer que tous les tissus sont libres dans la solution et ne sont pas adhérents au fond de la boîte. Ensuite, placer la boîte dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Dans la hotte biologique, utiliser une pipette de transfert stérile à large orifice pour transférer tout le milieu et le tissu dans un tube cryogénique stérile de cinq millilitres.

Placer l'extrémité de la même pipette de transfert près du fond du tube et pipeter doucement le mélange de 10 à 15 fois. Ensuite, ajouter deux millilitres de DMEM 5/5 préchauffé au mélange de cellules dissociées, puis boucher le tube de centrifugation. Mélanger délicatement par retournement et centrifuger à 573 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.

Dans la hotte, jetez tout le surnageant sans détacher le culot. Ensuite, ajoutez un millilitre de DMEM 5/5 réchauffé au culot dans le tube afin de remettre en suspension les cellules. Utilisez une pipette de transfert stérile à petit orifice pour désagréger le culot en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas jusqu'à ce que le mélange soit homogène.

Ensuite, transférez 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse. En dehors de la hotte biohazard, ajoutez 10 microlitres de bleu de trypan à 10 microlitres de la suspension cellulaire dans le tube de microcentrifugeuse. Chargez ensuite 10 microlitres de la suspension cellulaire au bleu de trypan sur une lame d'hémocytomètre jetable afin de compter les cellules.

Dans la hotte, utilisez une micropipette stérile pour transférer 50 microlitres de suspension cellulaire au centre de chaque réseau et de chaque boîte de Pétri témoin. Ensuite, placez les boîtes de Pétri couvertes dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures. Puis, ajoutez délicatement un millilitre de DMEM 5/5 réchauffé à chaque MEA.

Ajoutez soigneusement le milieu une goutte à la fois le long des bords internes de la MEA, en évitant de faire partir les cellules du centre de la matrice. Ensuite, placez un couvercle contenant une membrane FEP perméable aux gaz sur chaque MEA avant de les remettre dans l’incubateur. Après deux jours, effectuez un changement complet de milieu avec du DMEM+ réchauffé en aspirant le milieu de la boîte.

Placer soigneusement la pointe de la pipette sur la paroi interne et délivrer un millilitre de DMEM+ réchauffé. Pour les alimentations suivantes, prélever 500 microlitres de milieu depuis la boîte, puis délivrer 500 microlitres de DMEM+ réchauffé à nouveau. Au cours de cette procédure, examiner les échantillons de boîtes tous les deux jours au microscope afin d’évaluer la couverture cellulaire de la matrice et de détecter toute contamination bactérienne ou fongique. Avant de sortir les cultures de l’incubateur, brancher le contrôleur de température et mettre le système en marche, afin que la plaque chauffante de l’amplificateur préamplificateur atteigne 35 degrés Celsius.

Ensuite, placer la culture bouchée dans le préamplificateur, de sorte que la ligne noire du puits MEA s'aligne avec la masse de référence. S'assurer que les broches du préamplificateur soient bien alignées afin que le haut du préamplificateur soit fixé, tout en laissant le bouchon de la culture en place. Puis, appuyer sur démarrer dans l'environnement logiciel pour commencer la visualisation des signaux.

Dans la fenêtre principale, sélectionnez Spikes, Détection, Automatique, modifiez la valeur de l'écart type à moins cinq, puis cliquez sur Actualiser pour réinitialiser le seuil. Après avoir visualisé les signaux, cliquez sur Arrêter, Enregistrer, puis Lecture pour commencer l'enregistrement de l'activité. Des neurones de souris embryonnaires sont mis en culture sur des MEA à 60 canaux, ce qui permet l'enregistrement simultané de l'activité neuronale à travers le réseau à partir de chaque électrode.

Voici un exemple de tracé raster de l'activité enregistrée par huit électrodes en réponse à une stimulation avant et après l'entraînement. La ligne rouge verticale indique le moment du stimulus, et les petites marques noires représentent les potentiels d'action. Avant l'entraînement, on observe une réponse immédiate à l'impulsion de stimulus sur tous les canaux.

Après l'entraînement, le réseau présente une réponse d'activité plus prolongée, ainsi qu'une réponse immédiate à la stimulation. Ce graphique montre la moyenne de 12 réseaux entraînés et de 10 réseaux témoins ; les réseaux entraînés montrent des fréquences de décharge significativement modifiées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et associer du tissu neuronal provenant de souris embryonnaires, et être capable de cultiver, enregistrer et stimuler des réseaux neuronaux à l’aide de matrices de microélectrodes.