Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et d’associer des tissus neuronaux de souris E17, afin de cultiver, d’enregistrer et de stimuler des réseaux neuronaux sur des réseaux de microélectrodes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude de la dynamique des réseaux, car elles se rapportent aux mécanismes de base de l’apprentissage et de la mémoire. Le principal avantage de cette technique est que les réseaux de micro-électrodes sont capables d’enregistrer à partir de plusieurs sites simultanément et peuvent donc donner une meilleure résolution spatiale et temporelle, par rapport à la pipette en verre plus traditionnelle sur un seul site.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la dynamique de réseau de l’apprentissage et de la mémoire, elle peut également être utilisée pour étudier la toxicité des médicaments ou concevoir des paradigmes pour la médecine personnalisée de nouvelle génération. La démonstration visuelle de ce processus est essentielle, car la manipulation des tissus, pendant le processus de dissection et de dissociation est difficile à apprendre en lisant simplement les protocoles. Pour préparer le réseau, ajoutez 40 à 50 microlitres de laminine décongelée au centre de chaque MEA, et 0,2 millilitre de laminine aux plaques de contrôle, à l’aide d’embouts de pipette stériles.

Couvrez tous les AEM et les plats de contrôle dans le biocapot et transférez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Au bout d’une heure, retirez soigneusement l’excès de laminine du centre des AEM à l’aide d’une aspiration avec des pipettes Pasteur stériles, et laissez la surface sécher à l’air libre avant de plaquer. Ensuite, versez le milieu L-15 dans quatre boîtes de Pétri de 100 millimètres, couvrez-les et placez-les dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant environ 40 à 60 minutes, jusqu’à ce que le milieu ait une consistance fondante, mais ne soit pas congelé.

Pour préparer la dissection, placez une boîte de Pétri en verre face vers le bas dans un plateau rempli de glace. Vaporisez maintenant le bas-ventre de l’animal avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide de petits ciseaux chirurgicaux, faites une incision en forme de V à travers la peau et la graisse sous-cutanée du bas-ventre, en prolongeant la coupure jusqu’aux extrémités distales de la cavité thoracique et en exposant l’utérus.

À l’aide d’une pince, soulevez délicatement l’utérus entre les embryons. Coupez le tissu conjonctif avec des ciseaux de dissection jusqu’à ce que tout l’utérus soit libre. Ensuite, rincez brièvement l’utérus avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer tout sang, et placez-le dans l’une des quatre boîtes de Pétri remplies de L-15 froid.

Par la suite, libérez chaque embryon de l’utérus et du sac embryonnaire intérieur, à l’aide de deux paires de pinces à pointe fine. Placez les embryons libérés dans le deuxième plat rempli de L-15 froid, puis transférez les têtes dans la troisième boîte de Pétri et les corps dans la quatrième. Dans le biohood, placez un coin de papier filtre autoclavé sur la boîte de Pétri en verre réfrigéré et placez une tête d’embryon sur le papier filtre.

Ensuite, placez le bord tranchant du cisaillement inférieur des ciseaux à iris dans la base du crâne, en gardant le cisaillement inférieur contre la surface interne du crâne et loin du cerveau, coupez à travers la plaque occipitale, puis le long de la ligne médiane entre les plaques pariétales. Continuez à couper rostralement entre les plaques frontales cartilagineuses du crâne. Ensuite, en commençant par le centre de la plaque occipitale, faites une coupe perpendiculaire à gauche et à droite de la coupe centrale.

Après cela, glissez soigneusement une petite spatule entre la surface ventrale du cerveau et les plaques crâniennes inférieures, jusqu’à ce qu’elle soit complètement sous le cerveau. Soulevez ensuite la spatule pour retirer le cerveau. À l’aide d’une spatule propre, retirez d’abord le bulbe olfactif, puis disséquez le lobe frontal selon un motif trapézoïdal.

Ensuite, transférez le tissu dans un tube à centrifuger de 15 millilitres contenant un support de stockage. Dans cette procédure, utilisez deux lames de scalpel stériles pour hacher le tissu. Ajoutez ensuite 2,5 millilitres du mélange de papaïne Dnase au tissu haché dans la boîte de Pétri.

Faites tourner doucement la boîte de Pétri pour vous assurer que tous les tissus sont libres dans la solution et qu’ils n’adhèrent pas au fond de la boîte. Ensuite, placez le plat dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Dans le biohood, utilisez une pipette de transfert stérile à large diamètre pour transférer tous les milieux et tissus dans un tube cryogénique stérile de cinq millilitres.

Placez l’extrémité de la même pipette de transfert près du fond du tube et chitérez doucement le mélange 10 à 15 fois. Ajoutez ensuite deux millilitres de DMEM 5/5 réchauffé au mélange de cellules dissociées et bouchez le tube à centrifuger. Mélangez-le doucement par inversion et centrifugez-le à 573 fois g pendant cinq minutes à température ambiante.

Dans le biocapuchon, jetez tout le surnageant sans casser la palette. Par la suite, ajoutez un millilitre de DMEM 5/5 réchauffé à la palette dans le tube pour remettre les cellules en suspension. À l’aide d’une pipette de transfert stérile de petit calibre, cassez la palette en la pipetant doucement de haut en bas jusqu’à ce que le mélange soit homogène.

Transférez ensuite 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation. À l’extérieur du biohood, ajoutez 10 microlitres de bleu trypan aux 10 microlitres de suspension cellulaire dans le tube de la microcentrifugeuse. Chargez ensuite 10 microlitres de la suspension de cellules bleues de trypan sur une puce d’hémocytomètre d’élimination afin de compter les cellules.

Dans le biohood, utilisez une micropipette stérile pour transférer 50 microlitres de suspension cellulaire au centre de chaque réseau et de chaque boîte de Pétri de contrôle. Placez ensuite les boîtes de Pétri couvertes dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures. Ensuite, ajoutez doucement un millilitre de DMEM 5/5 réchauffé à chaque AEM.

Ajoutez soigneusement le fluide, une goutte à la fois, sur les bords intérieurs du MEA et évitez de laver les cellules loin du centre du réseau. Ensuite, placez un capuchon contenant une membrane FEP perméable aux gaz sur chaque MEA avant de les remettre dans l’incubateur. Après deux jours, effectuez un remplacement complet du milieu avec du DMEM+ réchauffé en retirant le milieu du plat.

Placez soigneusement l’extrémité de la pipette sur la paroi intérieure et distribuez un millilitre de DMEM+ réchaufféPour les alimentations suivantes, prélevez 500 microlitres de milieu de la boîte et distribuez à nouveau 500 microlitres de DMEM + réchauffé. Dans cette procédure, inspectez les échantillons de la boîte tous les deux jours au microscope, afin de détecter la couverture cellulaire sur le réseau et la contamination par des bactéries ou des champignons. Avant de sortir les cultures de l’incubateur, branchez le régulateur de température et allumez le système, permettant à la plaque de base chauffée du préamplificateur d’atteindre 35 degrés Celsius.

Placez ensuite la culture bouchée dans le préamplificateur, de sorte que la ligne noire dans le puits MEA s’aligne avec le sol de référence. Assurez-vous que les broches du préamplificateur sont alignées de manière à ce que le haut du préamplificateur soit fixé et que le capuchon de culture soit toujours en place. Ensuite, appuyez sur démarrer dans l’environnement logiciel pour commencer à visualiser les signaux.

Dans la fenêtre principale, sélectionnez Pics, Détection, Automatique, modifiez la valeur de l’écart type à moins cinq, puis cliquez sur Actualiser pour réinitialiser le seuil. Après avoir visualisé les signaux, cliquez sur Arrêter, Enregistrer et Lire pour commencer l’activité d’enregistrement. Les neurones embryonnaires de souris sont reliés à 60 canaux MEA, ce qui permet l’enregistrement simultané de l’activité neuronale sur le réseau à partir de chaque électrode.

Voici un graphique matriciel représentatif de l’activité de huit électrodes en réponse à la stimulation avant et après l’entraînement. La ligne rouge verticale indique le moment du stimulus et les coches noires indiquent les potentiels d’action. Lors du pré-entraînement, il y a une réponse immédiate à l’impulsion de stimulus à travers les canaux.

En post-entraînement, le réseau présente une réponse à l’activité plus prolongée, ainsi qu’une réponse immédiate à la stimulation. La moyenne de 12 réseaux entraînés et de 10 réseaux de contrôle indique des fréquences de pointe significativement modifiées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’associer des tissus neuronaux de souris embryonnaires, et être capable de cultiver, d’enregistrer et de stimuler des réseaux neuronaux à partir de réseaux de microélectrodes.