Name: Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez la culture de tissu neuronal de souris E17 sur réseaux de microélectrodes pour étudier les dynamiques réseau liées à l'apprentissage et à la mémoire. Cette méthode offre une résolution spatiale et temporelle supérieure.

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Ce travail a été financé par la subvention de la National Science Foundation CMMI-1300007. Nous souhaitons remercier les anciens membres du laboratoire, qui ont contribué à la conception de ces protocoles et au maintien des cultures depuis plus de cinq ans à l&#39;Université George Mason: le Dr Joseph J. Pancrazio, le Dr Hamid Charkhkar, le Dr Gretchen Knaack , Le Dr Franz Hamilton, Michael Maquera et Robert Graham.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les étapes décrites dans ce protocole fournissent suffisamment de détails pour que le débutant prenne ses propres cultures neuronales sur les AME et enregistre l&#39;activité du réseau. Ce protocole aidera à s&#39;assurer que les cultures adhèrent correctement, en formant une couche de tapis sur les matrices des électrodes et restent en bonne santé et sans contaminants pendant des mois. Bien qu&#39;il soit préférable d&#39;adhérer à toutes les parties du protocole, il existe des étapes tout au long du processus qui sont essentielles à la réussite. L&#39;utilisation de la technique aseptique tout au long du processus est impératif pour empêcher les cultures de se contaminer. Les nouveaux MEA doivent être hydrophiles, comme décrit dans le protocole, ou bien une faible adhésion cellulaire résultera. L&#39;évitement des pipettes sévères et la formation de bulles d&#39;air pendant la dissociation réduiront le nombre de cellules endommagées et conduiront à un rendement plus élevé et plus sain. Passer du DMEM 5/5 au DMEM + après le premierL&#39;alimentation est également importante. DMEM 5/5 contient du sérum de cheval, ce qui entraînera des cellules gliales à dominer la culture si elles sont utilisées en continu et entraîneront une activité neuronale médiocre, même si les cultures apparaîtront en bonne santé 17 . L&#39;alimentation des cultures comme prévu et leur maintien dans des conditions d&#39;incubation appropriées est également crucial. Le plaquage des cultures de cellules sur les AME implique de nombreuses variables qui peuvent conduire à des résultats moins optimistes. Bien que l&#39;objectif soit un &quot;tapis&quot; parfait des cellules, le fait de ne pas aborder les étapes critiques mentionnées ci-dessus entraînera une mauvaise maturation cellulaire ou une contamination. Une mauvaise adhésion cellulaire, qui est différente de la mauvaise maturation cellulaire, est également une préoccupation. Cela peut être causé par plusieurs facteurs, y compris une mauvaise préparation des MEA avant le placage ou l&#39;utilisation d&#39;un ancien milieu. Si un ancien milieu contenant une forme stabilisée de L-glutamine et un complément sans sérum pour la culture de cellules neurales (voir Tableau des matériaux) Est utilisé, les cellules adhèrent initialement mais ensuite flottent après environ deux semaines. Si la contamination bactérienne est un problème persistant, un antibiotique, tel que l&#39;ampicilline ou la streptocoque, peut être ajouté au milieu. Il existe également des fongicides disponibles pour traiter la contamination fongique. Voici quelques-unes des variables les plus communes qui peuvent affecter les résultats des cultures. Il y en a beaucoup d&#39;autres qui ne seront rencontrés qu&#39;après de temps et d&#39;expérience. Par rapport à l&#39;utilisation de microélectrodes en verre, cette technique est excellente pour étudier la dynamique du réseau et les réponses pharmacologiques. Il permet d&#39;utiliser de nombreux motifs de stimulation spatio-temporels différents et permet l&#39;enregistrement de réponses neuronales à partir de plusieurs zones à la fois. Les groupes précédents ont démontré des résultats intéressants en utilisant des protocoles similaires à ceux décrits ici 18 . Comme les cultures durent des semaines ou des mois et que les mêmes cultures peuvent être réutilisées, cette technique est aussi unePour des expériences multiples au fil du temps sur le même réseau. Cependant, il existe des limites à cette technique. Les AME ne sont pas invasifs. Par conséquent, ils ne peuvent enregistrer que l&#39;activité extracellulaire, par opposition à un clampage ou un enregistrement intracellulaire avec des pipettes. En outre, comme chaque électrode dans un réseau est couverte par plusieurs cellules, il n&#39;est pas possible de résoudre l&#39;activité d&#39;un seul neurone. À l&#39;inverse, parce que ce sont des cultures in vitro , ils ne peuvent pas reproduire pleinement les propriétés structurelles des réseaux dans le cerveau. En outre, l&#39;activité ne peut être enregistrée que pendant moins de 30 minutes à la fois sans un mécanisme fournissant une atmosphère de CO 2 pour que les cellules maintiennent leur équilibre de pH. Une fois que cette technique est maîtrisée, des manipulations pharmacologiques avec ou sans stimulation électrique peuvent être explorées. De nouveaux protocoles pour sondage de l&#39;apprentissage et la formation de la mémoire dans les réseaux neuronaux peuvent également être conçus et testés, avec pRotocoles pour les réseaux d&#39;halo-ormea ​​ou de la moelle épinière. Des protocoles pour la stimulation et la formation des réseaux ont été précédemment publiés, et certains d&#39;entre eux ont été développés dans des protocoles in vivo , tels que l&#39;adaptation sélective proposée par Eytan et al. 19 . Plusieurs protocoles ont été testés. Cependant, seuls les résultats d&#39;une modification de la procédure du tétanos proposée par Ruaro en 2005 sont présentés ici 14 , 20 .

Les tableaux de microélectrolyse (MEA) peuvent être utilisés pour étudier la toxicité du médicament, les paradigmes de conception pour la médecine personnalisée de prochaine génération et étudier la dynamique du réseau dans les cultures neuronales 1 . Contrairement aux méthodes plus traditionnelles, telles que le patch-clamping, qui ne peuvent enregistrer que l&#39;activité à partir d&#39;une seule cellule, ou enregistrer sur le terrain avec une pipette en verre, qui peut enregistrer des réponses extracellulaires des neurones entourant l&#39;électrode sur un seul site, les MEA peuvent simultanément Enregistrer à partir de sites multiples dans une culture cellulaire sans nécessiter la tâche ardue de placer chaque électrode individuellement. Cela permet d&#39;étudier les interactions dynamiques entre les groupes de cellules qui forment un réseau au sein de cette culture. En outre, les effets de la stimulation électrique sur les modèles de tir de réseau 2 , 3 , 4 , 5 et le contrôle du réseau 6 &lt;/ Sup&gt; dans les cultures neuronales ont été bien documentées, et de nombreuses configurations de stimulation électrique et de contrôles peuvent être facilement appliquées dans la même configuration expérimentale, ce qui permet d&#39;explorer une large gamme de dynamiques spatio-temporelles. L&#39;une des principales dynamiques d&#39;intérêt pour ces études in vitro a été la mesure dans laquelle les réseaux cultivés affichent des propriétés indicatives d&#39;apprentissage 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Le Laboratoire Peixoto a précédemment examiné les effets des signaux de formation à haute fréquence, comme décrit dans Ruaro et al. 14 , sur des réseaux de neurones de souris plaqués sur des tableaux de microélectrodes 15 . Dans ces expériences, les réseaux affichent une augmentation de la réponse suiteG formation induite par la stimulation électrique. La réponse accrue a été considérée comme une forme d&#39;apprentissage grâce à la reconnaissance de stimulus, grâce à laquelle les réseaux ont répondu de manière cohérente à un changement de stimulus après l&#39;application d&#39;un protocole de stimulation spécifique ( c.-à-d. Formation). Ce protocole démontre comment cultiver les cellules neuronales sur les AME, enregistrer avec succès sur plus de 95% des plats plaqués, établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation, trier l&#39;activité à une unité, tracer des histogrammes et interpréter les résultats de De telles expériences. L&#39;utilisation d&#39;un système exclusif (voir la Table des matières ) pour la stimulation et l&#39;enregistrement des cultures neuronales est démontrée, ainsi que l&#39;application de logiciels (voir la Table des matériaux ) pour trier les unités neuronales . Une interface utilisateur graphique personnalisée (voir la table des matières ) sert à visualiser les post-sLes histogrammes de temps timulus, les intervalles inter-éclatement et la durée de l&#39;éclatement, ainsi que pour comparer la réponse cellulaire à la stimulation avant et après un protocole de formation.

<table><tbody><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>Faire 4 mg/mL d’aliquotes</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Supplément sans sérum pour la culture de cellules neurales. Fabriquer des aliquotes de 1 mL et les congeler</td></tr><tr><td>Béchers - verre - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>Béchers - verre - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pouce à pointe arrondie</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>Flacon cryogénique - stérile, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Flacon cryogénique - stérile, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM avec technologie Glutamax</td><td>Gibco Life</td><td>10569-010</td><td>Milieux de culture cellulaire contenant une forme stabilisée de L-glutamine</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Worthington</td><td>Biochemical LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td> <td>à pouce à pointe fineWorld Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en verre</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>Une forme stabilisée de L-glutamine utilisée comme complément</td></tr><tr><td>Puce d’hémocytomètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB complete</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>CO2 support de stockage cellulaire</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MCS amplificateur de filtre</td><td>Système multicanaux</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCS headstage/préamplificateur</td><td>Système multicanaux</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS réseau de microélectrodes</td><td>Système multicanaux</td><td>60MEA200/ Alimentation 10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS Système</td><td>multicanal</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>Diviseur de signal MCS</td><td>Système multicanal</td><td>Générateur de stimulus SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>MCS</td><td>Système multicanal</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de température MCS</td><td>Système multicanal</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille de stockage de média - verre 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Microtubes à centrifuger - 0,4 mL</td><td>Autoclave</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger - 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Pointes de micropipette - 10 &mu ; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Pointes de micropipette - 1 000 &mu ; L&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Pointes de micropipette - 200 &mu ; L&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td><td>Micropipeteur autoclave</td></tr><tr><td>- 10 &mu ; L&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette - 1 000 &mu ; L&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette - 200 &mu ; L&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>Papain - 0,22 Filtre</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri -100 mm jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri -100 mm en verre</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri -35 mm&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin (PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Système de nettoyage au plasma</td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromhydrate de poly-D-lysine (PDL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique en polyéthylène (centrifugeuse) -15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique en polypropylène (centrifugeuse) -50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Masques de procédure</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp ; 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux - iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux - grands</td><td>World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp ; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique stérile, 1 mL&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique stérile, 2 mL&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique stérile, 25 mL&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique stérile, 50 mL&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel : Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>Utilisé pour analyser les fichiers .mat. Disponible gratuitement sur demande. Contactez-npeixoto@gmu.edu pour demander une copie.</td></tr><tr><td>Logiciel : MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour l’acquisition de données</td></tr><tr><td>Logiciel : NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp ;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>Utilisé pour convertir des fichiers .nex en .mat</td></tr><tr><td>Logiciel : Trieur hors ligne</td><td>Plexon&nbsp ;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>Utilisé pour trier les pics neuronaux et convertir les fichiers de données en .plx puis en .nex</td></tr><tr><td>Manuel du logiciel : MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>Software Manual : NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf Manuel du logiciel : Trieur hors ligne</td><td>Plexon&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatule www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf - petite à double extrémité</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp ; 503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0.22 & micro ; Filtre à pores - 250 mL</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert - grand alésage&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert - petit alésage&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan bleu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman</td><td>Whatman</td><td>1442 150</td><td>Coupé en 8 quartiers de tarte et autoclave dans une boîte de Pétri en verre</td></tr></tbody></table>

augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Les tableaux de micro-électrodes (MEA) peuvent être utilisés pour étudier la toxicité du médicament, les paradigmes de conception pour la médecine personnalisée de prochaine génération et étudier la dynamique du réseau dans les cultures neuronales. Contrairement aux méthodes plus traditionnelles, comme le patch-clamping, qui ne peuvent enregistrer que l&#39;activité à partir d&#39;une seule cellule, les MEA peuvent enregistrer simultanément à partir de plusieurs sites dans un réseau, sans nécessiter la tâche ardue de placer chaque électrode individuellement. En outre, de nombreuses configurations de contrôle et de stimulation peuvent être facilement appliquées dans la même configuration expérimentale, ce qui permet d&#39;explorer une large gamme de dynamiques. L&#39;une des principales dynamiques d&#39;intérêt pour ces études in vitro a été la mesure dans laquelle les réseaux cultivés affichent des propriétés indicatives de l&#39;apprentissage. Les cellules neuronales de la souris cultivées sur les AME affichent une augmentation de la réponse suite à une formation induite par une stimulation électrique. Ce protocole démontre comment faire la culture des cellules neuronales sur les AME; Re re reCordon de plus de 95% des plats plaqués; Établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation; Et trier, tracer et interpréter les résultats de ces expériences. L&#39;utilisation d&#39;un système exclusif pour stimuler et enregistrer des cultures neuronales est démontrée. Les packages logiciels sont également utilisés pour trier les unités neuronales. Une interface utilisateur graphique personnalisée est utilisée pour visualiser les histogrammes temporels post-stimulus, les intervalles inter-éclatement et la durée de l&#39;éclatement, ainsi que pour comparer la réponse cellulaire à la stimulation avant et après un protocole de formation. Enfin, les résultats représentatifs et les orientations futures de cet effort de recherche sont discutés.

Les cellules neuronales de la souris cultivées sur des matrices multi-électrodes affichent une augmentation de la réponse suite à une stimulation électrique. Ce protocole démontre comment culture des neurones, comment enregistrer l&#39;activité et comment établir un protocole pour former les réseaux pour répondre aux modèles de stimulation.

Augmentation de la réponse du réseau à la stimulation des cultures cellulaires neuronales sur les tableaux de microélectrodes

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et d'associer du tissu neuronal de souris E17, afin de cultiver, enregistrer et stimuler des réseaux neuronaux sur des matrices de microélectrodes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude de la dynamique des réseaux, en lien avec les mécanismes fondamentaux de l'apprentissage et de la mémoire. Le principal avantage de cette technique est que les matrices de microélectrodes permettent d'enregistrer simultanément à partir de plusieurs sites et offrent ainsi une meilleure résolution spatiale et temporelle, par rapport à l'enregistrement classique à un seul site à l'aide de pipettes en verre.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la dynamique des réseaux liée à l'apprentissage et à la mémoire, elle peut également être utilisée pour étudier la toxicité des médicaments ou concevoir des paradigmes destinés à la médecine personnalisée de nouvelle génération. La démonstration visuelle de ce processus est essentielle, car la manipulation du tissu au cours des étapes de dissection et de dissociation est difficile à maîtriser uniquement par la lecture de protocoles. Pour préparer la matrice, ajouter de 40 à 50 microlitres de laminine décongelée au centre de chaque MEA, et 0,2 millilitre de laminine dans les plaques témoins, en utilisant des embouts de pipette stériles.Couvrez toutes les MEA et les boîtes témoins dans la hotte de biosécurité, puis transférez-les dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après une heure, retirez soigneusement l'excès de laminine au centre des MEA par aspiration à l'aide de pipettes Pasteur stériles, et laissez la surface sécher à l'air avant le semis. Ensuite, versez le milieu L-15 dans quatre boîtes de Pétri de 100 millimètres, couvrez-les, puis placez-les dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant environ 40 à 60 minutes, jusqu'à ce que le milieu ait une consistance boueuse, mais ne soit pas complètement gelé.Pour préparer la dissection, placez une boîte de Pétri en verre retournée dans un plateau rempli de glace. Pulvérisez ensuite l'abdomen inférieur de l'animal avec de l'éthanol à 70 %. À l'aide de petites ciseaux chirurgicaux, effectuez une incision en forme de V à travers la peau et la graisse sous-cutanée de l'abdomen inférieur, en prolongeant l'incision jusqu'aux extrémités distales de la cavité thoracique, afin d'exposer l'utérus.À l’aide de pinces, soulevez délicatement l’utérus entre les embryons. Retirez le tissu conjonctif avec des ciseaux de dissection jusqu’à ce que l’utérus soit entièrement libéré. Rincez ensuite brièvement l’utérus avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer tout résidu sanguin, puis placez-le dans l’une des quatre boîtes de Pétri remplies de L-15 froid.Ensuite, libérez chaque embryon de l'utérus et du sac embryonnaire interne à l'aide de deux paires de pinces fines. Placez les embryons libérés dans la deuxième boîte de Pétri remplie de L-15 froid, puis transférez les têtes dans la troisième boîte de Pétri et les corps dans la quatrième. Dans la hotte biosécurisée, placez un morceau de papier filtre stérilisé par autoclavage sur le plateau en verre refroidi de la boîte de Pétri, puis déposez une tête d'embryon sur le papier filtre.Ensuite, insérez le bord tranchant de la lame inférieure des ciseaux à iris à la base du crâne, en maintenant cette lame inférieure contre la surface interne du crâne et à distance du cerveau, puis sectionnez la plaque occipitale, suivie de la ligne médiane située entre les plaques pariétales. Poursuivez la coupe en direction rostrale, entre les plaques crâniennes frontales cartilagineuses. Puis, en partant du centre de la plaque occipitale, effectuez une incision perpendiculaire vers la gauche et vers la droite par rapport à la coupe médiane.Ensuite, glissez délicatement une petite spatule entre la surface ventrale du cerveau et les plaques osseuses inférieures du crâne, jusqu'à ce qu'elle se trouve entièrement sous le cerveau. Soulevez ensuite la spatule pour extraire le cerveau. À l'aide d'une spatule propre, retirez d'abord le bulbe olfactif, puis disséquez le lobe frontal selon un motif trapézoïdal.Ensuite, transférez le tissu dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant le milieu de conservation. Dans cette procédure, utilisez deux lames de scalpel stériles pour hacher finement le tissu. Puis ajoutez 2,5 millilitres du mélange DNase-papaine au tissu haché dans la boîte de Pétri.Agiter doucement la boîte de Pétri pour s'assurer que tous les tissus sont libres dans la solution et ne sont pas adhérents au fond de la boîte. Ensuite, placer la boîte dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Dans la hotte biologique, utiliser une pipette de transfert stérile à large orifice pour transférer tout le milieu et le tissu dans un tube cryogénique stérile de cinq millilitres.Placer l'extrémité de la même pipette de transfert près du fond du tube et pipeter doucement le mélange de 10 à 15 fois. Ensuite, ajouter deux millilitres de DMEM 5/5 préchauffé au mélange de cellules dissociées, puis boucher le tube de centrifugation. Mélanger délicatement par retournement et centrifuger à 573 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.Dans la hotte, jetez tout le surnageant sans détacher le culot. Ensuite, ajoutez un millilitre de DMEM 5/5 réchauffé au culot dans le tube afin de remettre en suspension les cellules. Utilisez une pipette de transfert stérile à petit orifice pour désagréger le culot en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas jusqu'à ce que le mélange soit homogène.Ensuite, transférez 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse. En dehors de la hotte biohazard, ajoutez 10 microlitres de bleu de trypan à 10 microlitres de la suspension cellulaire dans le tube de microcentrifugeuse. Chargez ensuite 10 microlitres de la suspension cellulaire au bleu de trypan sur une lame d'hémocytomètre jetable afin de compter les cellules.Dans la hotte, utilisez une micropipette stérile pour transférer 50 microlitres de suspension cellulaire au centre de chaque réseau et de chaque boîte de Pétri témoin. Ensuite, placez les boîtes de Pétri couvertes dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius pendant trois à quatre heures. Puis, ajoutez délicatement un millilitre de DMEM 5/5 réchauffé à chaque MEA.Ajoutez soigneusement le milieu une goutte à la fois le long des bords internes de la MEA, en évitant de faire partir les cellules du centre de la matrice. Ensuite, placez un couvercle contenant une membrane FEP perméable aux gaz sur chaque MEA avant de les remettre dans l’incubateur. Après deux jours, effectuez un changement complet de milieu avec du DMEM+ réchauffé en aspirant le milieu de la boîte.Placer soigneusement la pointe de la pipette sur la paroi interne et délivrer un millilitre de DMEM+ réchauffé. Pour les alimentations suivantes, prélever 500 microlitres de milieu depuis la boîte, puis délivrer 500 microlitres de DMEM+ réchauffé à nouveau. Au cours de cette procédure, examiner les échantillons de boîtes tous les deux jours au microscope afin d’évaluer la couverture cellulaire de la matrice et de détecter toute contamination bactérienne ou fongique. Avant de sortir les cultures de l’incubateur, brancher le contrôleur de température et mettre le système en marche, afin que la plaque chauffante de l’amplificateur préamplificateur atteigne 35 degrés Celsius.Ensuite, placer la culture bouchée dans le préamplificateur, de sorte que la ligne noire du puits MEA s'aligne avec la masse de référence. S'assurer que les broches du préamplificateur soient bien alignées afin que le haut du préamplificateur soit fixé, tout en laissant le bouchon de la culture en place. Puis, appuyer sur démarrer dans l'environnement logiciel pour commencer la visualisation des signaux.Dans la fenêtre principale, sélectionnez Spikes, Détection, Automatique, modifiez la valeur de l'écart type à moins cinq, puis cliquez sur Actualiser pour réinitialiser le seuil. Après avoir visualisé les signaux, cliquez sur Arrêter, Enregistrer, puis Lecture pour commencer l'enregistrement de l'activité. Des neurones de souris embryonnaires sont mis en culture sur des MEA à 60 canaux, ce qui permet l'enregistrement simultané de l'activité neuronale à travers le réseau à partir de chaque électrode.Voici un exemple de tracé raster de l'activité enregistrée par huit électrodes en réponse à une stimulation avant et après l'entraînement. La ligne rouge verticale indique le moment du stimulus, et les petites marques noires représentent les potentiels d'action. Avant l'entraînement, on observe une réponse immédiate à l'impulsion de stimulus sur tous les canaux.Après l'entraînement, le réseau présente une réponse d'activité plus prolongée, ainsi qu'une réponse immédiate à la stimulation. Ce graphique montre la moyenne de 12 réseaux entraînés et de 10 réseaux témoins ; les réseaux entraînés montrent des fréquences de décharge significativement modifiées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et associer du tissu neuronal provenant de souris embryonnaires, et être capable de cultiver, enregistrer et stimuler des réseaux neuronaux à l’aide de matrices de microélectrodes.

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Ce protocole fournit les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l'enregistrement à partir et à stimuler électriquement les cultures sur les AME.

Comment la culture, d&#39;enregistrement et stimuler les réseaux neuronaux sur les micro-électrodes Arrays (AME)

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