Étude de la régénération des connexions fonctionnelles entre des coupes de moelle épinière à l’aide d’un réseau de multi-électrodes

Placez un réseau de multiélectrodes, ou MEA, dans une boîte de Pétri sous un stéréomicroscope. Le MEA comprend des électrodes disposées dans une grille à deux zones distinctes.

Ajoutez une goutte de plasma sanguin à l’AEM. Placez deux tranches de moelle épinière obtenues à partir d’embryons de rats, avec leurs côtés ventraux face à face.

Introduisez une solution de thrombine, mélangez-la avec le plasma et incuberez. La thrombine provoque la coagulation plasmatique, créant un échafaudage biologique qui facilite l’adhésion des tranches sur le MEA.

Ajouter un milieu nutritif et incuber sous agitation, favorisant la formation de connexions cellulaires entre les tranches et provoquant leur fusion.

Sous le stéréomicroscope, introduisez une lésion en coupant les connexions tissulaires entre les tranches. Ajouter un milieu nutritif et incuber.

Pendant l’incubation, les neurones se développent à travers la lésion pour relier les tranches.

À l’aide d’une chambre d’enregistrement, enregistrez l’activité électrique des deux coupes de la moelle épinière pour évaluer leurs connexions fonctionnelles régénérées.

Placez une boîte de Pétri avec un réseau de microélectrodes enrobées à l’intérieur, sous un stéréomicroscope. Mettez le réseau au point et centrez une gouttelette de 6 microlitres de plasma de poulet sur le réseau d’électrodes. À l’aide d’une petite spatule, glissez avec précaution deux sections de la moelle épinière avec leurs côtés ventraux face à face dans la gouttelette de plasma.

Ensuite, ajoutez 8 microlitres de thrombine autour de la gouttelette de plasma de poulet. Ensuite, utilisez l’embout de la pipette pour mélanger et étaler soigneusement le mélange de plasma de poulet et de thrombine. Juste avant que le mélange de plasma de poulet et de thrombine ne devienne trop filandreux et ne commence à coaguler, aspirez l’excès de liquide. Ensuite, bouchez la boîte de Pétri et placez-la dans une chambre humidifiée. Placez la chambre à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius pendant environ une heure.

Après l’incubation, ajoutez soigneusement 10 microlitres de milieu nutritif à l’échantillon. Fermez la boîte de Pétri et remettez-la dans l’incubateur pendant 45 minutes supplémentaires. Ensuite, placez chacun des assemblages de culture à plusieurs électrodes dans un tube à rouleaux et ajoutez 3 millilitres de milieu nutritif. Fermez bien le couvercle et placez le tube du rouleau dans le tambour à rouleaux. Faites tourner le tambour à 1 à 2 tr/min dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’une pince stérile à embout en caoutchouc, retirez les ensembles de culture à plusieurs électrodes du tube à rouleau et placez-les dans une boîte de Pétri sous un stéréomicroscope. Faites la mise au point sur le tissu et vérifiez que les deux tranches sont fusionnées.

Ensuite, maintenez l’ensemble stable et placez une lame de scalpel dans la rainure du réseau de multiélectrodes près des tranches de tissu. Tenez le scalpel plutôt horizontalement, puis soulevez le manche du scalpel, mais laissez la lame du scalpel rester dans le sillon du réseau de manière à ce que la lame roule de la base à la pointe, coupant à travers le tissu recouvrant le sillon. Sectionnez toutes les connexions tissulaires résiduelles avec une pointe d’aiguille de calibre 25 si nécessaire. Ne travaillez que dans la zone à l’intérieur de la rainure et ne touchez pas les bords tendres.

Remettez les assemblages de culture à plusieurs électrodes dans le tube à rouleaux et ajoutez 3 millilitres de milieu nutritif frais aux cultures. Ensuite, replacez le tube du rouleau sur le tambour à rouleaux dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Montez un ensemble de culture à plusieurs électrodes dans une chambre d’enregistrement et appliquez environ 500 microlitres de solution extracellulaire sur le réseau. Ensuite, montez l’ensemble sur le microscope. Attendez 10 minutes que le système se stabilise, puis enregistrez l’activité spontanée de base de chacune des électrodes de détection d’activité pendant 10 minutes.