Quantification des informations codées par Gene Expression niveaux pendant la durée de vie Modulation sous large gamme diététique Restriction chez c. elegans

L’objectif général de ce cadre est d’identifier les gènes impliqués dans la restriction alimentaire à large spectre, de quantifier l’information environnementale codée par leurs niveaux d’expression et de comprendre la stratégie de codage sous-jacente qui relie l’environnement à la durée de vie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie du vieillissement, telles que les gènes qui transmettent des informations de l’environnement pour moduler la durée de vie. Bien que ce cadre puisse fournir un aperçu du système sensoriel de C Elegan, il peut également être appliqué plus généralement à tout système biologique dont les composants coopèrent pour traiter l’information environnementale.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle quantifie l’information environnementale codée par des groupes de neurones et détermine la stratégie de codage employée par les neuroselquites pour transmettre cette information aux cibles en aval. Après la culture de l’OP50 sur des plaques MGM selon le protocole de texte, préparez 500 millilitres de milieu LB dans chacun des flacons erlenmeyer de deux litres et autoclavez-les. Inoculez chaque flacon avec une seule colonie d’OP50 et cultivez les cultures à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant environ 14 heures.

Ensuite, complétez les cultures avec 50 microgrammes par millilitre de streptomycine. Ensuite, secouez les flacons pendant 30 minutes supplémentaires à 37 degrés Celsius, avant de placer les flacons sur de la glace pendant 15 minutes. Transférez 450 millilitres de chaque culture dans des flacons de centrifugeuse stériles séparés de 500 millilitres, conservez la culture restante sur de la glace, car elle sera utilisée pour déterminer la concentration des bactéries.

Faites tourner les bouteilles à 4500 x G et quatre degrés Celsius pendant 25 minutes, puis jetez le surnageant et conservez les bouteilles sur de la glace. Avec 900 microlitres de LB stérile, diluez 100 microlitres de culture restante de chaque flacon. Utilisez un millilitre de LB stérile pour mettre le spectrophotomètre à zéro, puis déterminez la DO 600 de la dilution 10 fois de chaque culture.

Si, par exemple, la DO 600 de la dilution 10 fois de la culture pendant la nuit est de 0,28, alors la culture avait une DO 600 réelle de 2,8. À partir de cet exemple, pour arriver à une solution mère de travail de 1,12 x 10 à la 10e cellule OP50 par millilitre, ce qui équivaut à une OD600 de 56, remettez en suspension la pastille de la culture de 450 millilitres dans un 20e du volume d’origine ou 22,5 millilitres de solution basale S stérile ou SB, complétée par 50 microgrammes par millilitre de streptomycine. Calculer toutes les concentrations ultérieures utilisées dans les expériences sur le SB et le streptocoque, à partir de dilutions en série du matériel de travail, en utilisant les facteurs de dilution indiqués dans ce tableau.

Après avoir cultivé et synchronisé les souches rapporteures de C Elegans conformément au protocole de texte, utilisez 15 millilitres de SB pour laver en série les vers des trois plaques et recueillir le liquide dans un tube stérile de 15 millilitres. Laissez les larves L4 sédimenter naturellement, puis aspirez tout le liquide, sauf environ 0,5 millilitre. Dans les souches rapporteures de type sauvage, ce type élimine toutes les larves plus jeunes que L4.In les arrière-plans mutants, cette étape aide à l’élimination de toutes les larves arrêtées, comme la nôtre, dans le cas de la mort d’un OK3125.

Ensuite, utilisez neuf millilitres de SB pour remettre les vers en suspension. Encore une fois, surveillez la vitesse de sédimentation des larves L4, puis aspirez tout le surnageant, sauf environ 0,5 millilitre, une fois que la plupart des larves L4 ont granulé avant de répéter le processus. Ajouter 10 microlitres de milieu de base S stérile, complété par 0,1 % de F127 pluronique au liquide contenant les larves L4.

Celui-ci agit comme un tensioactif et empêche les larves de coller à la surface intérieure des pointes de pipette en plastique. À l’aide d’une pointe de pipette à faible rétention P200, remettez doucement les larves en suspension, puis aliquotez-en 150 microlitres sur trois plaques d’ARNi de 10 centimètres qui sont ensemencées avec 5 x 225 microlitres d’œufs cinq bactéries ARNi. Assurez-vous que les vers sont répartis uniformément sur les cinq pelouses bactériennes.

Une fois que le liquide a été absorbé dans la gélose, retirez toutes les larves non L4 des plaques qui n’ont pas été éliminées par la procédure de lavage, en les retirant manuellement. Conservez ensuite les plaques à 20 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour amorcer une RD à grande échelle, il faut enlever les jeunes larves qui ont échappé à l’étape d’élimination manuelle précédente, en ne laissant que les adultes d’un jour sur les plaques.

Pour chaque souche, utilisez 15 millilitres de streptocoque SB stérile, pour laver les adultes âgés d’un jour des trois plaques, dans un tube de 15 millilitres. Laissez les vers sédimenter naturellement, puis aspirez tout sauf 0,5 millilitre de surnageant. Remettez les vers en suspension avec 9,5 millilitres de streptocoque SB et répétez les étapes de sédimentation et de lavage.

Après le lavage final et l’aspiration de tous les surnageants sauf 0,5 millilitre, ajoutez 10 microlitres de SB Plu et utilisez une pointe de pipette P200 pour remettre doucement les larves en suspension. Disposez de 100 microlitres de larves sur une plaque de NSC, ensemencée de 5 x 225 microlitres de bactéries, à une concentration de 2 x 10 à la neuvième cellules par millilitre. Répartissez uniformément les 100 microlitres sur les cinq pelouses bactériennes.

Au microscope, estimez le nombre d’animaux présents sur la plaque, en visant entre 100 et 150 vers par plaque. Déterminez le volume de liquide nécessaire pour atteindre une densité de vis sans fin dans cette plage, puis aliquotez-le sur deux plaques supplémentaires. Ajustez le nombre de vers sur la première plaque pour qu’il se situe également dans cette plage.

Et puis conservez les plaques à 20 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, récupérez les adultes âgés de deux jours et distribuez les vers dans de nouvelles plaques NSC ensemencées avec le désir d’expérimenter la concentration de la nourriture. Une fois que le liquide est absorbé dans l’agar, déplacez les plaques à la température expérimentale souhaitée pendant 24 heures.

Le lendemain, récupérez les adultes âgés de trois jours et distribuez-les dans des assiettes fraîches de NSC, ensemencées avec la même concentration expérimentale de nourriture. Une fois que le liquide est absorbé dans l’agar, ramenez les plaques à la température expérimentale pendant 48 heures. Enfin, à l’aide d’un dispositif microfluidique, imagez les animaux avant d’assembler et de quantifier les données selon le protocole texte.

Comme le montre ici, la durée de vie moyenne de la souche sauvage n2 présente une réponse complexe à une large gamme de DR. L’ampleur de cette réponse est atténuée chez un tout mutant du gène daf-7, ce qui suggère que ce gène affecte la capacité du ver à répondre correctement aux changements dans l’abondance de nourriture. Les niveaux d’expression moyens d’un rapporteur transcriptionnel pour le gène daf-7 et le fond de type sauvage, montrent également une réponse non monotone complexe à une large gamme DR.In le patrimoine génétique daf-7, l’expression de ce rapporteur transcriptionnel est fortement atténuée et montre peu de réponse aux changements de niveau alimentaire. Cette figure illustre l’estimation de la distribution conjointe de l’expression de TPH1 dans les neurones ADF et de l’expression de daf-7 dans les neurones ASI pour un niveau alimentaire donné.

Ces diagrammes à barres présentent les informations alimentaires codées, de manière combinatoire ou individuelle, par les neurones ADF, ASI et NSM, en fonction des niveaux d’expression génique de TPH1 et daf-7. Les caractères redondants et synergiques de l’encodage, résultent de la comparaison entre les informations combinatoires et individuelles codées par les neurones représentées par la différence de hauteur des barres empilées à droite et les informations codées par le circuit complet. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la réplication de la théorie de l’information pour quantifier la stratégie de codage nécessite une estimation précise des distributions d’expression génique.

Pour cette raison, la taille de l’échantillon est un facteur critique pour l’applicabilité générale de ce cadre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de restriction alimentaire à grande échelle pour identifier et caractériser de nouveaux gènes qui lient l’abondance alimentaire à la durée de vie.