Combinée des nucléotides et des Extractions de protéine chez Caenorhabditis elegans

L’utilisation de ce protocole pour éliminer la variation inter-échantillon peut donner un aperçu de la régulation différentielle des macromolécules basée sur les écarts intra-échantillon entre l’ARNm et les niveaux de protéines. L’utilisation du même échantillon pour isoler l’ADN, l’ARN et les protéines est une tentative de réduire la variabilité, d’améliorer la reproductibilité et de faciliter l’interprétation. Les avantages comprennent le temps et les ressources économisés au moment de la collecte de l’échantillon et de l’analyse transversale d’échantillons précieux et limités.

Pour commencer, grainez 1000 oeufs de ver dans une assiette de 10 cm avec des conditions de croissance appropriées. Incuber à 20 degrés Celsius pendant 72 heures. Ensuite, lavez la plaque avec 5 millilitres de tampon M9 et transférez 1000 vers adultes dans un tube.

Centrifugez les vers à 1000 g pendant une minute, jetez le supernatant, et transférez les vers granulés, avec un millilitre de tampon M9, dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Centrifugeuse à nouveau à 845 g pendant une minute et jeter la plupart des supernatants. Conservez les vers granulés à moins 80 degrés Celsius pendant plus de quatre heures.

Ensuite, retirez tout supernatant de la pastille décongelée. Ajouter un millilitre de réaccageur GTCP froid, bien mélanger en pipetant de haut en bas et placer l’échantillon sur la glace pendant 10 minutes. Ajouter ensuite 200 microlitres de chloroforme froid.

Secouez vigoureusement le tube pendant 15 secondes et laissez-le à température ambiante pendant trois minutes. Ensuite, centrifuger le tube à 13 500 g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. À l’aide d’une micro-pipette, transférer la couche supérieure claire dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse sans RNase de 1,5 millilitre.

Transférer la couche d’interphase blanc nuageux dans un nouveau tube étiqueté B2 et transférer la couche rose, de la pastille restante, dans un nouveau tube étiqueté B et placer les deux sur la glace. Il peut être difficile de séparer clairement les trois couches. Je recommande de transférer la couche nuageuse interphase dans son propre tube plutôt que de précipiter l’ADN de cette couche de la couche organique, ou rose.

Pour isoler l’ARN, ajoutez d’abord 500 microlitres de 100% isopropanol au tube A pour précipiter l’ARN. Ensuite, incuber le tube à température ambiante pendant 10 minutes. Après incubation, centrifuger le tube à 13 500 g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, jetez le supernatant et ajoutez un millilitre de 75% d’éthanol au tube A pour laver la pastille. Centrifuger le tube à 5300 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jeter le surnatant et laisser sécher l’air granulé pendant cinq à dix minutes.

Ajouter 50 microlitres d’eau sans RNase pour reconstituer la pastille d’ARN et incuber la pastille à 55 à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes pour la dissoudre. Enfin, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration de l’ARN isolé à 260 nanomètres et pour identifier les impuretés à 230 et 280 nanomètres. Pour isoler l’ADN, ajoutez d’abord 300 microlitres de 100% d’éthanol à la phase organique du tube B et à la couche blanche trouble du tube B2 pour précipiter l’ADN, mélanger par inversion et laisser les tubes à température ambiante pendant deux à trois minutes.

Puis, les tubes de centrifugeuse B et B2 à 376 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour granuler l’ADN. Combinez le supernatant des tubes B et B2 dans un nouveau tube de deux millilitres étiqueté C et laissez-le sur la glace pour un isolement protéique ultérieur. Ensuite, lavez la pastille d’ADN dans le tube B2 avec un millilitre de citrate de sodium molaire de 0,1 molaire dans 10 % d’éthanol pendant 30 minutes.

Tube de centrifugeuse B2 à 376 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Répétez l’étape de lavage, puis suspendez la pastille en 1,5 millilitres de 75 % d’éthanol et laissez-la à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, centrifugeuse tube B2 à 376 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, puis jeter le supernatant et laisser sécher la pastille pendant cinq à 10 minutes.

Dissoudre la pastille en 150 microlitres d’hydroxyde de sodium de huit millilitres. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 376 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Enfin, avec une micropipette, transférer le supernatant contenant l’ADN dans un nouveau tube.

Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration de l’ADN isolé à 260 nanomètres et pour identifier les impuretés à 230 et 280 nanomètres. Pour précipiter la protéine, ajoutez d’abord jusqu’à 1,5 millilitres de 100% isopropanol au supernatant rose dans le tube C, mélangez en inversant plusieurs fois, et incubez à la température ambiante pendant 10 minutes. Puis, centrifugeuse tube C à 13,500 g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Jeter le supernatant et laver la pastille avec deux millilitres d’hydrochlorure de guanidine molaire de 0,3 molaire dans 95% d’éthanol pendant 20 minutes à température ambiante. Centrifuger le tube à nouveau à 5300 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et répéter l’étape de lavage comme avant. Transférer la pastille protéique dans un nouveau tube de 1,5 millilitre étiqueté C2 et ajouter jusqu’à 1,5 millilitres d’éthanol à 95 %, vortex, et laisser reposer à température ambiante pendant 20 minutes.

Centrifuger le tube à 5300 g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jeter le surnatant et laisser sécher la pastille à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, dissoudre la pastille en 300 microlitres de 5%SDS à 50 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Enfin, centrifuger le tube à 13 500 g à 17 degrés Celsius pendant 10 minutes. Et transférer le supernatant contenant la protéine dans un nouveau tube. Pour effectuer une transcription quantitative inverse PCR.

Tout d’abord, utilisez un nanogramme de l’ARN isolé pour préparer l’ADND par transcription inverse. Pour fabriquer une plaque de stock d’ADNC, ajouter 100 microlitres d’une à 100 dilutions de chaque échantillon d’ADNC à des puits individuels d’une plaque de puits de 96 puits, y compris des contrôles appropriés, tels que des puits à eau seulement et des échantillons dilués en série, afin d’établir l’efficacité de l’amorce pour chaque gène. Pour faire un mélange maître pour chaque ensemble d’amorces, ajoutez jusqu’à sept microlitres d’eau, un colorant de cyanure d’ADN-intercalating, et cinq micro-molaires chacun des amorces avant et arrière.

Ajouter sept microlitres du mélange maître aux puits appropriés d’une plaque RT-qPCR. Ensuite, ajoutez trois microlitres de l’ADNC à partir de la plaque de stock et exécutez la plaque à l’aide d’un protocole RT-qPCR adapté aux amorces utilisées. L’analyse rt-qPCR des ARNM isolés à partir de quatre échantillons indépendants de trois souches de vers a été effectuée pour confirmer les cibles identifiées par l’essai de qG de l’ARN.

Le gène F07C4.12 a été régulé dans les deux analyses chez les vers eat-2, mais son upregulation chez les vers rsks-1 n’a pas été détectée par l’analyse RT-qPCR. En outre, le seq d’ARN a détecté des changements d’expression de mrp-1 dans les vers eat-2 et rsks-1 ont été confirmés par RT-qPCR. L’upregulation ou la régulation vers le bas des gènes de marqueur d’organelle dans les vers mutants ont été également détectées par l’analyse de RT-qPCR.

La comparaison de la protéine GTCp par rapport à la protéine extraite ripa chez les vers séparés par la page SDS et tachés de bleu coomassie a montré une qualité similaire avec une meilleure résolution de protéines plus grandes pour les protéines extraites du GTCp. L’analyse occidentale de tache a montré des niveaux semblables de protéine dans la plupart des cas ;cependant, les protéines plus grandes que 75 kilodalton ont montré des niveaux inférieurs dans la protéine RIPA-extraite. La comparaison entre les cibles de l’ARNm et les niveaux de protéines de quatre échantillons individuels de trois souches de vers a montré une faible variabilité des niveaux d’ARNm avec une plus grande variabilité au niveau des protéines.

Dans le contexte de l’isolement de l’ADN, le rendement dépend fortement de la compétence nécessaire pour récupérer la couche nuageuse d’interphase de la couche organique ou rose. Pour améliorer la solubilisation des protéines de la pastille augmentant le volume de tampon de resolubilisation ou en ajoutant d’autres détergents en dehors de SDS peut être nécessaire. L’utilisation de cette méthode peut aider à identifier correctement les cas où la traduction de l’ARNm en protéine n’est pas corelative et peut mener à une étude plus approfondie des mécanismes de régulation post-transcriptionnels et post-translationnels dans diverses conditions.

Dans notre laboratoire, ce protocole a été utilisé pour conserver des échantillons de base précieux et limités dans le temps. En outre, je peux imaginer que ce serait un protocole utile à adopter dans le domaine du rythme circadien. Le reagent et les solvants GCTP utilisés dans l’isolement de l’ARN sont des dangers et doivent être utilisés avec prudence.