Caractérisation biochimique et structurelle de l’hydrate de carbone Transport substrat-GRB2 SP0092

L’objectif global de cette procédure est la caractérisation biochimique et structurale d’une protéine de liaison au substrat glucidique de Streptococcus pneumoniae. Cette méthode peut aider à fournir des données clés pour faciliter les études pédagogiques des protéines de liaison au substrat, telles que l’identification des profils de stabilité du tampon, des états d’oligomérisation et des structures atomiques. L’avantage de cette procédure est qu’elle fournit des données qui peuvent augmenter le taux de réussite de la cristallisation et la solution de structure pour les protéines de liaison au substrat de manière robuste et simple.

Tout d’abord, préparez 48 solutions tampons avec un pH compris entre 4,0 et 9,5 et des concentrations de chlorure de sodium allant de zéro à 0,5 molaire. Distribuez 40 microlitres de chaque solution dans une plaque de 96 puits. Obtenez une solution purifiée de la protéine de liaison au substrat choisie.

Ajoutez cinq microlitres de solution SBP dans chaque puits pour une concentration d’un à deux milligrammes par millilitre. Ajoutez ensuite cinq microlitres d’une coloration fluorescente 20 fois concentrée dans chaque puits. Mélangez les solutions en pipetant de haut en bas.

Scellez la plaque avec un film adhésif transparent. Centrifugez la plaque à 112 fois G à température ambiante pendant deux minutes. Configurez un système de PCR en temps réel pour passer de quatre à 99 degrés Celsius à une vitesse de trois degrés par minute avec un temps d’attente de 10 secondes.

Réglez le système pour qu’il prenne des lectures de fluorescence tous les demi-degrés. Réglez le paramètre du filtre de fluorescence. et attribuez les échantillons.

Exécutez l’expérience et identifiez la condition de tampon avec la température de fusion la plus élevée. Ensuite, préparez un tampon avec le pH et la concentration de chlorure de sodium choisis qui comprennent 2,5 % en volume de glycérol et une concentration de PTCE de 0,5 millimolaire. Caractériser la TAS purifiée par chromatographie analytique d’exclusion stérique avec diffusion de la lumière multi-angle.

Identifiez les espèces les plus stables qui conviennent à la cristallisation et utilisez des SEC préparatoires pour obtenir des fractions pures de ces espèces. Effectuer des tests de pré-cristallisation pour déterminer la concentration optimale de protéines pour la cristallisation. Utilisez un système robotisé de cristallisation pour distribuer les solutions de cristallisation commerciales souhaitées dans les réservoirs de solution d’une plaque de chute optique à 96 puits.

Ensuite, utilisez le système pour distribuer 100 nanolitres de la solution protéique dans chaque puits de cristallisation. Transférez 100 nanolitres de chaque solution de cristallisation des puits du réservoir aux gouttes de puits correspondantes. Scellez la plaque avec un film adhésif optique.

Utilisez un microscope ou un système d’imagerie automatisé pour évaluer la formation et la croissance des cristaux tous les un à deux jours pendant deux semaines, et une fois par semaine par la suite. Lorsque des cristaux suffisamment gros et bien formés se sont formés, préparez un lot de la solution de cristallisation avec 25 % supplémentaires en volume de glycérol pour servir de cryoprotecteur. Ensuite, remplissez un dewar de mousse avec de l’azote liquide.

Immergez un enclos d’échantillon unipuck dans l’azote liquide et laissez-le refroidir. Découpez ensuite le film sur une goutte contenant un cristal d’intérêt. Déposez 0,5 microlitre de cryoprotecteur sur une lame de couverture à proximité de la goutte ou dans la chambre de descente vide du même état si disponible.

Fixez à une baguette magnétique un cryoloop monté sur une base standard SPINE. Utilisez le cryoloop pour transférer le cristal d’intérêt à la goutte de cryoprotecteur. Utilisez ensuite le cryoloop pour transférer le cristal du cryoprotecteur vers la première position vide de l’enceinte d’échantillon unipuck immergée.

Répétez ce processus pour récolter des cristaux supplémentaires. Une fois que tous les cristaux d’intérêt ont été chargés dans l’enceinte de l’échantillon, utilisez la baguette de rondelle pour placer la plaque de base de l’unipuck sur l’enceinte. Transporter l’unipuck dans de l’azote liquide jusqu’à la ligne de faisceau.

Utilisez une pince cryogénique et un outil de chargement de dewar de rondelle pour charger l’unipuck dans le dewar du changeur d’échantillons de ligne de faisceau et pour détacher l’enceinte de l’échantillon. Sélectionnez ensuite l’échantillon dans le logiciel de ligne de faisceau à charger et centrez automatiquement l’échantillon dans le faisceau de rayons X. Acquérir un spectre fluorescent à rayons X et identifier tous les éléments qui peuvent être utilisés dans une expérience de diffraction anormale.

Déterminez la longueur d’onde optimale pour la collecte de données de diffraction anormale en effectuant un balayage de l’énergie du bord d’absorption des rayons X. Acquérez ensuite trois modèles de diffraction des rayons X à des intervalles de 45 degrés en mode d’oscillation standard pour déterminer automatiquement les paramètres de la cellule unitaire du cristal, la symétrie et la limite de diffraction. Importez les paramètres de collecte de données recommandés dans le logiciel de ligne de faisceau et exécutez une expérience de diffraction anormale à une ou plusieurs longueurs d’onde, selon le cas.

La stabilité de la protéine de liaison au substrat SP0092 dans divers tampons salins a été évaluée afin d’identifier la solution tampon optimale. Les températures de fusion les plus élevées ont été observées pour les tampons ayant un pH de 6,5 et des concentrations de chlorure de sodium allant de zéro à 0,2 molaire. Un tampon avec un pH de 6,5 et une concentration de chlorure de sodium de 0,2 molaire a été sélectionné pour la procédure.

Les différents états d’oligomérisation de SP0092 ont été identifiés et séparés avec des SEC-MALS. Une analyse du profil SEC à différentes concentrations de protéines a indiqué qu’une concentration accrue de protéines déclenche l’oligomérisation, ce qui suggère que les oligomères plus gros sont plus stables à des concentrations élevées. En conséquence, les grands oligomères ont produit des cristaux dans les essais de cristallisation, alors que le monomère ne l’a pas fait.

fluorescence X des cristaux SP0092 natifs et marqués à la sélénométhionine a indiqué que le zinc s’est lié à la protéine sous les deux formes. Le signal anormal a été maximisé en ajustant la longueur d’onde des rayons X incidente aux bords d’absorption des rayons X du zinc ou du sélénium. Un ensemble complet de données anormales a ensuite été obtenu, et une analyse automatisée déclenchée par la présence d’un signal anormal a généré des cartes initiales des structures protéiques.

Les modèles intégrés à ces cartes initiales ont ensuite été affinés et validés pour produire les modèles finaux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser une caractérisation structurelle complète d’une protéine de liaison au substrat ou de toute cible protéique potentielle. Les implications de cette technique s’étendent au développement de nouvelles thérapies pour la maladie myrococcique, car elle fournit des informations fondamentales pour la conception basée sur la structure d’inhibiteurs pour cette classe de protéines.

Ces méthodes peuvent également être appliquées aux protéines de liaison au substrat d’autres organismes, et elles peuvent potentiellement être utilisées pour n’importe quel type de protéine.