Automated Modular High Throughput exopolysaccharide plateforme de criblage Couplé avec très sensible Analyse Glucides d'empreintes digitales

L’objectif global de cette approche est le dépistage rapide et fiable des producteurs d’exopolysaccharides microbiens et l’identification de leur empreinte glucidique. Il s’agit d’une étape essentielle afin d’utiliser la diversité inexplorée des exopolysaccharides. Notre méthode peut aider à accélérer la recherche sur les polymères dans le domaine des exopolysaccharides microbiens.

Il permet d’identifier rapidement de nouvelles variantes de polysaccharides avec des propriétés différentes pour des applications spécifiques. Le principal avantage de cette technique est la combinaison de différents systèmes de détection d’exopolysaccharides dans un concept de dépistage modulaire et entièrement automatisé. Cela le rend extrêmement rapide et fiable.

Cette technique peut également être réalisée manuellement dans les laboratoires où il n’y a pas de plate-forme d’automatisation disponible, son utilisation est donc très flexible et peut être ajustée aux différents besoins de dépistage. Cette plateforme de dépistage d’exopolysaccharides, ou EPS, dispose d’une configuration modulaire, qui permet une séparation du protocole en deux parties principales, le dépistage automatisé et l’empreinte glucidique. La première tâche consiste à cultiver les souches pour le criblage et à éliminer les cellules par centrifugation.

Les souches sont cultivées sur du glucose comme source de carbone dans des plaques de 96 puits recouvertes d’un film d’étanchéité respirant sur un agitateur à plaque de microtitration à 30 degrés Celsius et 1 000 tr/min. Le jour de l’écran, préparez la table de travail du robot et le carrousel de stockage comme décrit dans le texte du protocole. Retirez le film d’étanchéité respirant des plaques et répartissez les cultures principales dans les positions de carrousel 1-1 à 1-4.

Démarrez le programme robotique automatisé. Pour prélever les cellules après la culture, transférez les plaques de puits profonds de culture principale du carrousel dans la centrifugeuse, et centrifugez à 4, 300 x g et 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour la précipitation avant la filtration, déplacez les plaques de microtitration, ainsi que les plaques de micro-titration indicatrices de pH, du carrousel à la table de travail.

Transférez également les plaques de filtration, qui assurent l’élimination complète de toutes les cellules bactériennes, ainsi que les plaques collectrices sur leur position de travail. Après la centrifugation, transférez 180 microlitres du surnageant de culture principal sur la plaque de filtration. Aspirez 150 microlitres du surnageant de la culture principale et distribuez 50 microlitres dans la plaque de microtitrage pour la précipitation avant la filtration, et 100 microlitres dans la plaque indicatrice de pH.

La précipitation du surnageant avec le 2-propanol est effectuée pour évaluer la production d’EPS. À l’aide d’une pipette multi-étapes de 12,5 millilitres, ajoutez manuellement 150 microlitres de 2-propanol dans chaque puits. Après avoir secoué les plaques de microtitrage à température ambiante pendant 10 minutes à 900 tr/min, observez visuellement les formations de fibres ou de flocons qui indiquent la production d’EPS.

Une fois les plaques de culture principales rangées dans le carrousel, examinez les bouillons de fermentation, qui devraient montrer une diminution de la sédimentation après la centrifugation. L’augmentation de la viscosité est une autre indication de la production d’EPS. La deuxième tâche consiste à assurer l’élimination complète des cellules du bouillon de fermentation visqueux via une filtration à 96 puits.

Centrifugez les plaques de filtration à 3 000 x g et 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Remettez ensuite les plaques dans leur position d’origine du carrousel et effectuez l’équilibrage de la filtration sur gel comme décrit dans le texte du protocole. Ensuite, pipetez 35 microlitres de filtrat au centre de la plaque de filtration en gel équilibrée, et 50 microlitres à la plaque de micro-titrage utilisée pour la précipitation.

Déplacez les plaques de filtration au gel vers la centrifugeuse et ramenez toutes les autres plaques de la table de travail vers les positions d’origine dans le carrousel. Après le stockage de toutes les plaques dans le carrousel, notez les surnageants très visqueux indiqués par les résidus dans la plaque filtrante. Un manque de filtrat peut entraîner des résultats faussement négatifs dans les modules d’analyse suivants.

La troisième tâche du criblage automatisé consiste à éliminer les sucres monomères restants du milieu de croissance via une filtration sur gel à 96 puits. Centrifugez les plaques de filtration en gel à 1 000 x g et 20 degrés Celsius pendant deux minutes. Préparez la table de travail à l’aide du manipulateur robotisé pour le traitement des filtrats de gel.

Pour détecter le glucose restant après la filtration sur gel, nous conseillons de transférer 25 microlitres d’eau doublement distillée dans une plaque de micro-titrage fraîche. Aspirez 20 microlitres d’eau doublement distillée, cinq microlitres d’air et 5 microlitres de gel-filtrat, et distribuez-les dans la même plaque. Prenez des pointes de 200 microlitres et aspirez 50 microlitres de mélange de réactifs de dosage du glucose à partir de la position 1-2 de la table de travail pour commencer le premier test.

Déplacez les plaques de microtitration dans l’incubateur. Après 30 minutes d’incubation, déplacez les plaques de l’incubateur vers le lecteur de micro-titres, et enregistrez l’absorbance à 418 et 480 nanomètres. Pour déterminer la teneur totale en glucides par la méthode phénol-sulfurique-acide sulfurique, pipetez 20 microlitres de gel-filtrat sur les plaques de micro-titrage.

Retirez manuellement les plaques du carrousel et placez-les dans le poste de manipulation des liquides. Incluez la plaque d’étalonnage avec 20 microlitres de différentes concentrations de glucose en trois exemplaires. Placez un conteneur à déchets en position 1, une boîte d’embouts de 300 microlitres en position 2 et une auge de 250 millilitres avec 110 millilitres d’acide phénol-sulfurique fraîchement préparé en position 3.

À l’aide d’une pipette à 8 canaux avec des pointes de 300 microlitres, transférez 180 microlitres d’acide phénol-sulfurique dans chaque rangée de toutes les plaques. Couvrez toutes les plaques de microtitration avec des couvercles et mélangez en agitant pendant cinq minutes à 900 tr/min à température ambiante. Incuber pendant 35 minutes à 80 degrés Celsius dans un four pour la réaction de couleur.

Après avoir refroidi les plaques sous une hotte, mesurez l’extinction à 480 nanomètres. Les souches issues du dépistage automatisé sont désignées comme EPS positives si elles remplissent au moins deux des trois critères suivants. Contrôle de la viscosité, détection du polymère et calcul de l’équivalent de glucose.

L’équivalent en glucose est calculé à l’aide de cette équation. L’empreinte glucidique de la plate-forme de dépistage contient les trois dernières tâches qui sont effectuées manuellement. Le filtrat restant des résultats positifs de la deuxième tâche fournit la base du filtrat de gel de la cinquième tâche.

La sixième tâche est la micro-hydolyse à 96 puits du filtrat de gel. Pour ce faire, utilisez d’abord une pipette à 12 canaux de 50 microlitres pour transférer 20 microlitres de filtrat de gel sur une nouvelle plaque PCR. Ensuite, utilisez une pipette multi-étapes de 1,25 millilitre pour ajouter 20 microlitres de quatre molaires d’acide trifluoroacétique dans chaque puits.

Couvrez la plaque PCR avec un tapis de finition en élastomère thermoplastique et placez la plaque PCR dans un dispositif de serrage spécial. Mélangez les solutions en inversant 10 fois le dispositif de serrage. Après avoir centrifugé la plaque PCR et l’avoir fixée dans le dispositif de serrage, placez le dispositif de serrage sécurisé dans un bain de sable préchauffé et incubez à 121 degrés Celsius pendant 90 minutes.

À l’aide d’une pipette à 12 canaux de 200 microlitres, ajoutez une solution d’ammoniac à 3,2 % pour ajuster le pH à environ huit. Couvrez la plaque PCR avec un tapis de finition en élastomère thermoplastique et secouez-la manuellement à l’aide du dispositif de serrage. La dernière tâche consiste à analyser l’empreinte glucidique via la méthode à haut débit 1-phényl-3-méthyl-5-pyrazolone, ou HTPMP.

Pour commencer cette procédure, utilisez une pipette à 12 canaux de 50 microlitres pour transférer 25 microlitres d’hydrolysat neutralisé sur une plaque PCR fraîche. Ajoutez 75 microlitres de mélange de réactifs de dérivatisation et recouvrez la plaque d’un tapis de capuchon en élastomère thermoplastique. Placez la plaque PCR dans un cycleur PCR à 70 degrés Celsius pendant 100 minutes, puis refroidissez-la à 20 degrés Celsius.

Transférez une aliquote de 20 microlitres dans une nouvelle plaque de microtitrage, puis utilisez une pipette à 12 canaux de 200 microlitres pour ajouter 130 microlitres d’acide acétique de 19,23 millimolaires à chaque ligne. Mélangez directement par aspiration et distribution au moins six fois, et transférez tout le liquide sur une plaque filtrante de 0,2 micromètre avec une plaque collectrice de microtitre. Centrifugez la plaque à 1 000 x g pendant cinq minutes, retirez la plaque filtrante et scellez la plaque collectrice de microtitres avec un tapis de capuchon en silicone.

Placez la plaque de micro-titrage dans l’UHPLC-UV-ESI-MS pour la détermination de l’empreinte glucidique. Ce tableau présente les résultats de trois nouvelles souches exemplaires identifiées avec succès grâce à cette plateforme de criblage. La partie gauche du tableau présente les résultats des modules de dépistage automatisés concernant la formation de la viscosité, la production de polymères et l’équivalent en glucose de l’hydrolyse totale, qui ont été utilisés comme paramètres d’évaluation pour l’analyse détaillée des empreintes glucidiques.

L’empreinte glucidique basée sur les sucres calibrés ainsi que les sucres, dimères et substituants inconnus est donnée dans la partie droite du tableau. À l’aide de ces informations, la composition monomère peut être calculée et comparée avec des structures polymères déjà connues. De plus, un criblage ciblé de compositions monomères intéressantes et de glucides rares peut être effectué.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée pour 386 souches en seulement cinq heures. Suite à cette procédure, des dosages supplémentaires comme le pyruvate déjà existant ou d’autres dosages pour les acétates ou le phosphate peuvent être inclus afin de répondre à une question supplémentaire de déclaration d’exopolysaccharide. Après son développement, cette technique, par sa grande sensibilité, a ouvert la voie à nos recherches dans le domaine des producteurs d’exopolysaccharides microbiens modifiés par génie génétique pour explorer l’effet des voies de biosynthèse des exopolysaccharides modifiés sur la structure chimique résidente.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier de nouveaux producteurs d’exopolysaccharides de manière très rapide et fiable.