Name: Automated Modular High Throughput exopolysaccharide plateforme de criblage Couplé avec très sensible Analyse Glucides dempreintes digitales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Découvrez une méthode automatisée modulaire pour le criblage à haut débit des exopolysaccharides microbiens et l'identification de leurs empreintes glucidiques. Cette technique accélère la recherche sur les polymères et permet de détecter rapidement de nouvelles variantes polysaccharidiques.

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Nous remercions sincèrement Thomas Howe et Jörg Carsten pour la programmation et le support technique avec les systèmes de manipulation des liquides.

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</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Détection polysaccharidique avec la méthode phénol-acide sulfurique: monosaccharides différents présentent des maxima d&#39;absorption différentes et des coefficients d&#39;extinction molaires par l&#39; utilisation de ce procédé 9. Il en résulte des différents maxima d&#39;absorption des polymères, qui contiennent plusieurs sucres dans des quantités différentes. Les différentes longueurs d&#39;ondes des maxima d&#39;absorption pour les 16 polymères disponibles dans le commerce différents sont donnés dans le tableau 5. Les polymères ont été dissous (1 g / L) dans le trou DDH 2 O, sous agitation (150 tpm) pendant une nuit et mesurée avec le phénol-acide sulfurique, procédé . la gomme diutane a montré les maxima d&#39;absorption la plus faible à 470 nm, et l&#39;acide hyaluronique, le scléroglucane et le plus élevé à 484 nm. Sur la base de ces résultats 480 nm a été choisie pour cette plate-forme de criblage. L&#39;absorbance relative des polymères a été calculé sur la base absorbance obtenue avec 1 g / L de glucose (défini comme 100%). Les résultats les plus faibles ont été obtenus avec scléroglucane et succinoglycane, tous deux avec 92%. Cela a été expète parce scléroglucane ne contient que le glucose et le succinoglycane contient du glucose et du galactose dans un rapport de 7: 1. Les deux polymères commerciaux ont des pertes de séchage et des teneurs en cendres, c&#39;est la raison pour laquelle la valeur théorique de ~ 110% n&#39;a pas été atteint. Xylan a montré l&#39;absorbance relative la plus élevée avec 311%. La raison pour cela est le coefficient d&#39;extinction molaire élevée obtenue à partir du xylose en raison de la forme furanose plus dominante. À un niveau de 0,1 g / litre de glucose à la limite de quantification a été atteinte, ainsi que la limite de détection à une concentration &lt;0,05 g / l. Cependant, la limite de détection pour les souches positives dans le criblage est supérieure à 0,7 g / L et, par conséquent, l&#39;essai a montré une bonne performance. Afin d&#39;obtenir des résultats fiables, le glucose restant après la filtration sur gel a été déterminée par un dosage du glucose-et cette valeur a été soustraite de la valeur de la méthode phénol-acide sulfurique. Automated dilution glucose-test: La performancela détermination du glucose après la culture (dilution 1: 100) a été étudiée. Pour ce faire , 10 pl de surnageant ont été transférés dans 990 pl de ddH 2 O dans une plaque de puits profonds et mélangés par l&#39; intermédiaire de dix fois aspirer et distribuer 180 ul de cette dilution. La deuxième étape critique a été le pipetage correct de seulement 5 aliquote ul pour la dilution 1:10 du glucose-test après filtration sur gel. Afin de générer la dilution 25 pi de ddH 2 O ont été transférés avec un pl-tip 50 d&#39; abord, après , 20 pl de ddH 2 O et 5 pi gel filtrat ont été aspirés ensemble. Ceci assure une meilleure évacuation de l&#39;aliquote de 5 ul de la pointe. Les deux étapes de dilution ont été vérifiées avec différentes normes de glucose via un glucose-dosage. Les résultats pour deux concentrations exemplaires sont donnés dans le Tableau 6 1:. 100 dilution pour la détermination de la teneur en glucose après la culture a montré une grande précision pour les deux normes avec un CV &amp; #60; 1,2%. Dans le même temps, la précision de la norme plus élevée était à 11,6 (erreur%). Cependant, ceci est négligeable devant la détermination du glucose ne représente que la teneur en glucose restant après la culture et par conséquent, n&#39;a pas d&#39;importance pour la détection du polymère. La dilution 1:10 pour le glucose restant après la filtration sur gel a montré des résultats très fiables avec un CV &lt;1,4% et une précision &lt;d&#39;erreur de 2,1%. Examen de l&#39;évaporation: La projection nécessite 3,5 heures de la première étape à la première glucose-test. Pour savoir, si ce laps de temps a une influence sur le stockage des MTP non plafonnés, 50 pl d&#39;étalons glucose-test ont été stockés avec et sans couvercle pendant 3,5 heures dans le carrousel de robot. Dans la gamme d&#39;étalonnage (45 à 4,5 mg / L), la concentration de l&#39;échantillon à peine augmenté. Une augmentation - causée par l&#39;évaporation - était inférieur à 2,1%, et seulement pour les deux concentrations les plus faibles (1,8 et 0,9 mg / L), il a atteint jusqu&#39;à 12,4% ( <strong&gt; Tableau 7). Filtration sur gel: Des quantités élevées de glucose non métabolisé perturbent la détection quantitative du glucose à partir du polymère hydrolyse. Par conséquent, une étape de filtration sur gel a été nécessaire pour éliminer le glucose restant après la culture. En outre, la filtration sur gel purifie le polymère contenant du surnageant à partir des sels et des composés d&#39;hydrates de carbone monomères, autres que le glucose, afin de minimiser l&#39;arrière-plan analytique dans l&#39;analyse du monomère. Lors de l&#39;étape de filtration sur gel de 35 ul de filtrat ont été placés au centre du puits. La validation de la robustesse de la filtration sur gel dans le système automatisé, huit étalons de calibrage de 0,045 jusqu&#39;à 9 g / L de glucose ont été filtrés (n = 8). Le glucose de chaque concentration a toujours été réduite de plus de 95% de la valeur initiale (tableau 8). Ce faisant, la filtration sur gel a montré de très bons résultats pour diverses concentrations de glucose. En outre, le glucose restant après gel filtration a également été déterminée avec un glucose-titrage et soustraite de la détermination de phénol-acide sulfurique pour recevoir la bonne quantité de glucose équivalente pour le polymère hydrolysé. Pyruvate-essai: Tout d&#39;abord, on a cherché à savoir si le (1:10) TFA matrice neutralisée et diluée à l&#39;étape d&#39;hydrolyse interfère avec la réaction enzymatique. Par conséquent, le test complet a été effectué deux fois, une fois avec et sans matrice une fois et a donné des résultats fiables. Enfin, la teneur en pyruvate de 16 polymères disponibles dans le commerce a été mesurée avec succès et est représenté sur la figure 3. Il est généralement connu que , sur ces 16 polymères ne succinoglycane et xanthane contiennent naturellement du pyruvate. Avec notre pyruvate-dosage de ces deux polymères ont été correctement identifiés. En scléroglucane, la gomme welan et xylane pyruvate a aussi été détecté dans des quantités importantes. Dans l&#39;ensemble, la capacité de l&#39;approche a été validée et la pyruvate-test showed une haute performance. Il est avéré être capable de détecter le pyruvate dans différents polymères après l&#39;hydrolyse. empreintes digitales Glucides: Après avoir effectué tous les modules analytiques dans le criblage automatisé, les producteurs EPS potentiels ont été sélectionnés pour l&#39;analyse des glucides d&#39;empreintes digitales. Pour cela, plusieurs critères ont été appliqués: 1) l&#39;observation positive de la viscosité après centrifugation et / ou après la filtration. 2) Les précipitations avant et après filtration. fibres et flocons observés ont été évalués comme positifs. 3) une valeur équivalente de glucose par la méthode phénol-acide sulfurique. Valeurs&gt; 700 mg / L ont été jugés positifs et des valeurs comprises entre 300 et 700 mg / L ont été classés en tant que producteurs EPS putatifs. Lorsque deux ou trois critères ont été évalués comme positifs, les souches ont été sélectionnées pour une analyse ultérieure d&#39;empreintes digitales glucides. Les critères peuvent être personnalisés vers le but individuel de l&#39;examen des EPS (par exemple , faible viscosité EPS). Notre approche vise à trouver efficient EPS producteurs. Lors de la recherche pour les souches qui ne produisent que de petites quantités d&#39;EPS la limite d&#39;évaluation de l&#39;équivalent de glucose doit être réduite. avantages techniques et applications futures: Une caractéristique intéressante de ce protocole est le caractère modulaire des étapes et des différents modules d&#39;analyse. Ils peuvent être combinés de différentes manières, ajustée aux besoins individuels et de nouveaux modules peuvent être facilement mis en oeuvre. Par ailleurs, les modules d&#39; analyse peuvent être utilisés séparément, par exemple le module d&#39;hydrolyse en combinaison avec le module HT-PMP-dérivatisation est capable d&#39;effectuer une analyse de la composition de monomère à partir de solutions de polymères différents (1 g / L) dans un format à 96 puits. Pour les laboratoires, sans avoir accès à un système de traitement des liquides du dépistage complet puisse être manipulé manuellement sans aucun changement dans le schéma de pipetage. Cependant, en utilisant un système de traitement des liquides augmente le débit jusqu&#39;à 768 souches (au lieu de 192 souches si screeneD manuellement) par jour. Le protocole décrit ici est capable d&#39;un dépistage de genres différents et donc, pour le criblage de grandes collections de souches pour identifier les producteurs nouveaux EPS et analyser leur empreinte glucides dans une approche (Figure 4). En outre, un dépistage ciblé pour les polysaccharides contenant des sucres rares comme fucose, les acides uroniques ou même des sucres inconnus peut être effectuée via l&#39;analyse monosaccharide détaillée. En outre, différentes combinaisons de sucres dans des rapports définis peuvent être détectés. Cela permet de la simple identification des variants structurellement apparentés de EPS déjà connus ou nouveaux EPS.

exopolysaccharides microbiens (EPS) sont un groupe structurellement très diversifié de polymères qui remplissent diverses fonctions biologiques. Ils sont généralement construits de motifs répétitifs complexes, qui se distinguent par différents types de monomères (sucre, dérivés de sucre, des acides de sucre), les liaisons entre ces monomères et leurs substitutions. La diversité structurale des polysaccharides microbiens confère plutôt des caractéristiques différentes aux membres de cette classe de molécule, ce qui permet leur application dans différents domaines tels que la nourriture 1, cosmétiques 2,3, la construction de la chimie 4 ou traitement de l&#39; eau 5. Pour étendre le champ d&#39;application de ces polymères durables à base biologique et de tels l&#39;identification de nouveaux polysaccharides microbiens naturels ainsi que l&#39;ingénierie des variantes structurelles représente des approches prometteuses. De toute façon, une méthode de dépistage rapide est nécessaire pour analyser rapidement un grand nombre de souches microbiennes pour Their la formation d&#39;un polysaccharide, et d&#39;analyser leurs produits. Par conséquent, nous avons récemment développé une plate - forme de 96 puits HT-criblage pour l&#39;analyse de la production microbienne de polysaccharides à partir d&#39; isolats naturels ou variants de souches modifiées qui comprend l&#39;identification de la composition de monomère 6. L&#39;application de cette plate-forme pour un premier tour de dépistage de ~ 500 isolats naturels nous a permis d&#39;identifier seulement environ 10 à 20% des souches isolées comme étant capable de produire des EPS (données non présentées). Cela signifie que 80 à 90% des souches analysées ne produisait pas EPS dans les conditions appliquées, et par conséquent, une nouvelle analyse des hydrates de carbone détaillée empreinte n&#39;a pas été nécessaire. Comme cette identification très sophistiquée de la composition monomère est un processus qui prend du temps, en particulier pour l&#39;analyse des données, une méthode de pré-criblage rapide pour identifier les souches positives dans la production d&#39;EPS, augmenterait considérablement l&#39;efficacité. En outre, les réactifs,consommables et temps de mesure à l&#39;UHPLC-UV-ESI-MS seraient réduits. En outre, les différents modules d&#39;analyse, alors que d&#39;une part rendre la méthode très fiable, sont d&#39;autre part ce qui complique la manutention manuelle de plus de deux plaques à 96 puits en parallèle, et en tant que telle restreindre le plein potentiel de la méthode. Pour ces raisons, nous avons décidé de développer une plateforme de criblage automatisé. Par conséquent, on a combiné le format modulaire de la technique existante d&#39;hydrate de carbone d&#39;empreinte digitale avec une méthode de détection rapide entièrement automatique de la teneur en sucres totaux, fondé sur la mesure d&#39;absorbance. La méthode phénol-acide sulfurique représente encore la méthode de choix pour la détermination rapide de la teneur totale en glucides des polysaccharides bactériens et végétales 7,8. Cette méthode a été décrite par Dubois et al. 9 et adapté pour différentes applications et la taille des échantillons, même pour petite échelle dans des plaques à 96 puits 10,11. Le phéProcédé nol-acide sulfurique mesure la teneur totale en hydrates de carbone par une valeur sommant tous les monomères, oligomères et polymères d&#39;hydrates de carbone des échantillons. En prenant en compte ces aspects, le choix d&#39;un milieu de culture approprié est essentiel d&#39;appliquer cette méthode. Des milieux complexes contenant des composés oligomères ou polymères glucidiques comme extrait de levure pourrait conduire à une teneur en polymère modifié et, par conséquent, doivent absolument être évités. En outre, des quantités élevées de sucres sont utilisés en tant que source de carbone pour la culture des souches. Des niveaux élevés d&#39;hydrates de carbone restants du processus de culture peuvent interférer négativement avec la mesure de la teneur en EPS. Par conséquent, l&#39;utilisation de sucres purs définis et est conseillée. Dans nos expériences, nous avons utilisé le glucose pour la culture des cellules. Le glucose restant après la culture a été réduit par l&#39;intermédiaire d&#39;un gel-filtration et déterminé par un glucose-dosage. Enfin, l&#39;équivalent de glucoses des polysaccharides ont été calculées en soustrayant le glucose restant après la filtration sur gel à partir de la teneur totale en glucides qui ont été détectées par la méthode phénol-acide sulfurique. La filtration sur gel et la glucose-dosage en combinaison avec la méthode phénol-acide sulfurique garantissent des résultats fiables et sont capables d&#39;être notre premier système de détection, entièrement automatisé. Deux nouveaux modules d&#39;analyse ont été inclus dans la plate-forme de criblage automatisé pour augmenter la quantité d&#39;informations provenant du système de détection d&#39;EPS: la précipitation et l&#39;observation d&#39;une augmentation de la viscosité. Beaucoup EPS différents - par exemple succinoglycane, xanthane et colique acide 12 - sont signalés à être modifié avec un non-hydrate de carbone pyruvate cétal sur les positions de sucre C4 et C6. Ces cétals pyruvate (tout comme les esters succinyl demi et acides uroniques) contribuent à la nature polyanionique et donc, à la prope physiquerties du polymère par interaction par l&#39; intermédiaire de ponts de cations divalents 13. Afin d&#39;identifier ces polymères particuliers la détermination du pyruvate a été établi comme un autre module d&#39;analyse supplémentaire. Cela augmente les informations sur les substituants de polysaccharides et de leurs propriétés macroscopiques potentiels. La combinaison de tous les modules permet l&#39;identification des différents EPS ainsi qu&#39;une détermination rapide et efficace des producteurs EPS. Par cette approche , la plate - forme de dépistage pourrait être divisé en deux grandes parties (figure 1). Dans le criblage automatisé (partie I) le flux de travail se produit entièrement automatisé (tableau 1) pour présélectionner rapidement les EPS produisant des souches. L&#39;analyse des glucides d&#39;empreintes digitales (partie II) détermine quantitativement la composition de monomère des EPS produits par les souches présélectionnées. De ce fait, l&#39;analyse des données a été réduite au minimum afin d&#39;optimiser le criblage de grandes collections de souches. Ceoffre la possibilité d&#39;analyser 384 souches en un seul passage de criblage automatisé et avec deux points qui sont possibles par jour de 768 souches par jour. En outre, l&#39;analyse des glucides d&#39;empreintes digitales donne un aperçu encore plus détaillé de tous les EPS identifiés. Cela permet l&#39;analyse et l&#39;identification des variantes légèrement différentes EPS ou complètement nouveaux par rapport aux structures chimiques déjà décrites des EPS dirigée.

<table><tbody><tr><td>Plaque à puits profonds à 96 puits 2,0 ml (DWP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>Culture principale (CP 1-1 à 1-4), plaques d’équilibrage pour la filtration sur gel (CP 1-6, 1-7, 2-6 et 2-7), dilution 1:100 pour le dosage du glucose (CP 4-1 à 4-4) contenant 990&nbsp ; et micro ; l de ddH2O Film d’étanchéité</td></tr><tr><td>respirant</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S</td><td>Film d’incubation pour la pré- et la culture principale</td></tr> Film <tr><td>d’étanchéité en aluminium</td> DWP <td>Axygen</td><td>PCR-AS-200-80</td> <td>&deg ; Film de stockage C pour plaques de glycérol</td></tr><tr><td>MCA96 Embouts jetables emboîtés 200 & micro ; l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>Position de la table de travail (WTP 2-1 à 2-4)</td></tr><tr><td>A/B verre-filtre-plaque 1&nbsp ; et micro ; m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>Stocké sur plaque collectrice (CP 2-1 à 2-4)</td></tr><tr><td>Plaque de microtitration à 96 puits V-Bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>Plaque collectrice pour plaque de filtration (CP 2-1 à 2-4)</td></tr><tr><td>SpinColumn G-25 à 96 puits</td><td>Appareil Harvard</td><td>74-5612</td><td>Stocké sur DWP de lavage (CP 1-6, 1-7, 2-6 et 2-7)</td></tr><tr><td>Plaque de micro-titration à 96 puits V-Bottom</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>Plaque collectrice pour plaque de filtration gel (CP 3-1 à 3-4)</td></tr><tr><td>Embouts jetables emboîtés SBS 50 &micro ; l pointes</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>Position du carrousel (CP 4-6, 4-7 et 5-1 à 5-6)</td></tr><tr><td>Auge 250 ml</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>Eau WTP 1-1, Mélange de réactifs de dosage du glucose WPT 1-2, Tampon d’acétate d’ammonium pH 5,6 (CP 5-7)</td></tr><tr><td>Plaque de titrage micro à 96 puits F-Bottom (MTP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>précipitation 1 (CP 6-1 à 6-4), valeur du pH (CP 7-1 à 7-4), précipitation 2 (CP 8-1 à 8-4), méthode de l’acide phénol-sulfurique (CP 8-5 à 8-8), dosage de la glycémie (CP 9-1 à 9-9), plaques factices (WTP 3-1, 3-2)</td></tr><tr><td>Tapis de recouvrement en silicium à 96 puits&nbsp ;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>Tapis de couverture pour MTP</td></tr><tr><td>200 &micro ; l pointes de pipette</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>Pour la manipulation manuelle</td></tr><tr><td>1 000 & micro ; l pointes de pipette</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>Pour la manipulation manuelle</td></tr><tr><td>de la plaque de micro-titrage PCR à 96 puits&nbsp ;</td><td>Marque</td><td>781350</td><td>Hydrolyse, PMP-dérivatisation</td></tr><tr><td>TPE (élastomère thermoplastique) capuchon mat&nbsp ;</td><td>Marque</td><td>781405</td><td>Hydrolyse, dérivation PMP</td></tr><tr><td>Plaque filtrante 0,2&nbsp ; et micro ; m Supor</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>Filtration d’échantillons pour l’analyse UHPLC-ESI-MS avec une plaque collectrice MTP</td></tr><tr><td>Pointes de pipette LHS 5-300&nbsp ; et micro ; l</td><td>Marque</td><td>732150</td><td>Marque Système LHS</td></tr><tr><td>Glucose oxydase&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>Dosage du glucose</td></tr><tr><td>Raifort peroxydase&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Dosage du glucose, dosage du pyruvat</td></tr><tr><td>DA-64 (N-(Carboxyméthylaminocarbonyl)-4.4'-bis(diméthylamino)-diphénylamine sel sodique de sodium)</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>Dosage du pyruvat</td></tr><tr><td>Pyruvate oxydase&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>Dosage au Pyruvat</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Carl-Roth</td><td>P749.3</td><td>Dosage au Pyruvat et au glucose</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Carl-Roth</td><td>3904.3</td><td>Dosage au Pyruvat et au glucose</td></tr><tr><td>Pyrophosphate de thiamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>Dosage au Pyruvat</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>Dosage au pyruvat</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>Précipitation</td></tr><tr><td>Phénol</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>Méthode à l’acide phénol-sulfurique</td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>Méthode à l’acide phénol-sulfurique</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Hydrolyse</td></tr><tr><td>Solution d’ammonium</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>Hydrolyse, dérivation du PMP</td></tr><tr><td>Absolu d’éthanol</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>Hydrolyse, dérivation du PMP</td></tr><tr><td>Rouge de phénol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>Hydrolyse, dérivation PMP</td></tr><tr><td>1-phényl-3-méthyl-5-pyrazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>PMP dérivation</td></tr><tr><td>Méthanol LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>PMP dérivation</td></tr><tr><td>Acétonitril LC-MS</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>PMP dérivation</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>PMP dérivée</td></tr><tr><td>Éthanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>PMP-dérivatisation</td></tr><tr><td>Rouge de méthyle</td><td>Alfa Aesar</td><td>36667</td><td>valeur</td></tr> pH <tr><td>Système robotisé de manipulation des liquides&nbsp ;</td><td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>Configuration de la table de travail en Figure 2</td></tr><tr><td>Station de manipulation de liquides LHS</td><td>Brand</td><td>709400</td> Configuration de la <td>table de travail en Figure 2</td></tr><tr><td>Tip-Adapter</td><td>Marque</td><td>709434</td><td>Configuration de la table de travail en Figure 2</td></tr><tr><td>Liquid Ends MC 20-300&nbsp ; et micro ; l</td><td>Marque</td><td>709416</td><td>Configuration de la table de travail en Figure 2</td></tr><tr><td>Adaptateur 60 mm</td><td>Marque</td><td>709430</td><td>Configuration de la table de travail en Figure 2</td></tr></tbody></table>

automated modular high throughput exopolysaccharide plateforme de criblage couplé avec très sensible analyse glucides d&#39;empreintes digitales

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

De nombreux micro-organismes sont capables de produire et de sécréter exopolysaccharides (EPS), qui ont des implications importantes dans le domaine médical, les applications alimentaires ou dans le remplacement des produits chimiques à base pétrochimiques. Nous décrivons une plate-forme d&#39;analyse à un système automatisé de manipulation de liquide qui permet une analyse rapide et fiable du type et de la quantité d&#39;EPS produite par des micro-organismes. Il permet à l&#39;utilisateur d&#39;identifier de nouveaux producteurs naturels exopolysaccharide microbiennes et d&#39;analyser l&#39;empreinte des hydrates de carbone polymères correspondants à moins d&#39;un jour à haut débit (HT). L&#39;utilisation de cette plate-forme, collections de souches ainsi que des banques de variants de souches qui pourraient être obtenus dans les approches d&#39;ingénierie peuvent être criblés. La plate-forme présente une configuration modulaire, ce qui permet une séparation du protocole en deux parties principales. Tout d&#39;abord, il existe un système de contrôle automatique, qui combine différents modules de détection de polysaccharide: une analyse semi-quantitative de viscositformation de y par une étape de centrifugation, une analyse de la formation de polymère par précipitation à l&#39;alcool et la détermination de la teneur totale en glucides par l&#39;intermédiaire d&#39;une transformation phénol-acide sulfurique. Ici, il est possible de filtrer jusqu&#39;à 384 souches par cycle. La deuxième partie présente une analyse monosaccharide détaillée pour tous les producteurs EPS sélectionnés identifiés dans la première partie en combinant deux modules essentiels: l&#39;analyse de la composition de monomère complète par chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à ultra-violet et la détection de piège à ions d&#39;ionisation électrospray ( CLUHP UV-ESI-MS) et la détermination du pyruvate en tant que substituant polymérique (présence de pyruvate cétal) par oxydation enzymatique qui est couplée à une formation de couleur. Tous les modules analytiques de cette plate-forme de criblage peuvent être combinés de différentes manières et ajusté aux exigences individuelles. En outre, ils peuvent tous être manipulés manuellement ou réalisés avec un système de manipulation de liquide. Ainsi, le pla de dépistagetform permet une grande flexibilité afin d&#39;identifier les différents EPS.

Nous présentons une méthode modulaire automatisée à haut débit pour l’identification et la caractérisation d’exopolysaccharides microbiens à petite échelle. Cette méthode combine une présélection rapide pour analyser la quantité totale de polysaccharides sécrétés avec une empreinte glucidique détaillée pour permettre le criblage rapide de souches bactériennes nouvellement isolées ou de collections entières de souches.

Automated Modular High Throughput exopolysaccharide plateforme de criblage Couplé avec très sensible Analyse Glucides d&#39;empreintes digitales

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

L’objectif global de cette approche est le dépistage rapide et fiable des producteurs d’exopolysaccharides microbiens et l’identification de leur empreinte glucidique. Il s’agit d’une étape essentielle afin d’utiliser la diversité inexplorée des exopolysaccharides. Notre méthode peut aider à accélérer la recherche sur les polymères dans le domaine des exopolysaccharides microbiens.Il permet d’identifier rapidement de nouvelles variantes de polysaccharides avec des propriétés différentes pour des applications spécifiques. Le principal avantage de cette technique est la combinaison de différents systèmes de détection d’exopolysaccharides dans un concept de dépistage modulaire et entièrement automatisé. Cela le rend extrêmement rapide et fiable.Cette technique peut également être réalisée manuellement dans les laboratoires où il n’y a pas de plate-forme d’automatisation disponible, son utilisation est donc très flexible et peut être ajustée aux différents besoins de dépistage. Cette plateforme de dépistage d’exopolysaccharides, ou EPS, dispose d’une configuration modulaire, qui permet une séparation du protocole en deux parties principales, le dépistage automatisé et l’empreinte glucidique. La première tâche consiste à cultiver les souches pour le criblage et à éliminer les cellules par centrifugation.Les souches sont cultivées sur du glucose comme source de carbone dans des plaques de 96 puits recouvertes d’un film d’étanchéité respirant sur un agitateur à plaque de microtitration à 30 degrés Celsius et 1 000 tr/min. Le jour de l’écran, préparez la table de travail du robot et le carrousel de stockage comme décrit dans le texte du protocole. Retirez le film d’étanchéité respirant des plaques et répartissez les cultures principales dans les positions de carrousel 1-1 à 1-4.Démarrez le programme robotique automatisé. Pour prélever les cellules après la culture, transférez les plaques de puits profonds de culture principale du carrousel dans la centrifugeuse, et centrifugez à 4, 300 x g et 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour la précipitation avant la filtration, déplacez les plaques de microtitration, ainsi que les plaques de micro-titration indicatrices de pH, du carrousel à la table de travail.Transférez également les plaques de filtration, qui assurent l’élimination complète de toutes les cellules bactériennes, ainsi que les plaques collectrices sur leur position de travail. Après la centrifugation, transférez 180 microlitres du surnageant de culture principal sur la plaque de filtration. Aspirez 150 microlitres du surnageant de la culture principale et distribuez 50 microlitres dans la plaque de microtitrage pour la précipitation avant la filtration, et 100 microlitres dans la plaque indicatrice de pH.La précipitation du surnageant avec le 2-propanol est effectuée pour évaluer la production d’EPS. À l’aide d’une pipette multi-étapes de 12,5 millilitres, ajoutez manuellement 150 microlitres de 2-propanol dans chaque puits. Après avoir secoué les plaques de microtitrage à température ambiante pendant 10 minutes à 900 tr/min, observez visuellement les formations de fibres ou de flocons qui indiquent la production d’EPS.Une fois les plaques de culture principales rangées dans le carrousel, examinez les bouillons de fermentation, qui devraient montrer une diminution de la sédimentation après la centrifugation. L’augmentation de la viscosité est une autre indication de la production d’EPS. La deuxième tâche consiste à assurer l’élimination complète des cellules du bouillon de fermentation visqueux via une filtration à 96 puits.Centrifugez les plaques de filtration à 3 000 x g et 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Remettez ensuite les plaques dans leur position d’origine du carrousel et effectuez l’équilibrage de la filtration sur gel comme décrit dans le texte du protocole. Ensuite, pipetez 35 microlitres de filtrat au centre de la plaque de filtration en gel équilibrée, et 50 microlitres à la plaque de micro-titrage utilisée pour la précipitation.Déplacez les plaques de filtration au gel vers la centrifugeuse et ramenez toutes les autres plaques de la table de travail vers les positions d’origine dans le carrousel. Après le stockage de toutes les plaques dans le carrousel, notez les surnageants très visqueux indiqués par les résidus dans la plaque filtrante. Un manque de filtrat peut entraîner des résultats faussement négatifs dans les modules d’analyse suivants.La troisième tâche du criblage automatisé consiste à éliminer les sucres monomères restants du milieu de croissance via une filtration sur gel à 96 puits. Centrifugez les plaques de filtration en gel à 1 000 x g et 20 degrés Celsius pendant deux minutes. Préparez la table de travail à l’aide du manipulateur robotisé pour le traitement des filtrats de gel.Pour détecter le glucose restant après la filtration sur gel, nous conseillons de transférer 25 microlitres d’eau doublement distillée dans une plaque de micro-titrage fraîche. Aspirez 20 microlitres d’eau doublement distillée, cinq microlitres d’air et 5 microlitres de gel-filtrat, et distribuez-les dans la même plaque. Prenez des pointes de 200 microlitres et aspirez 50 microlitres de mélange de réactifs de dosage du glucose à partir de la position 1-2 de la table de travail pour commencer le premier test.Déplacez les plaques de microtitration dans l’incubateur. Après 30 minutes d’incubation, déplacez les plaques de l’incubateur vers le lecteur de micro-titres, et enregistrez l’absorbance à 418 et 480 nanomètres. Pour déterminer la teneur totale en glucides par la méthode phénol-sulfurique-acide sulfurique, pipetez 20 microlitres de gel-filtrat sur les plaques de micro-titrage.Retirez manuellement les plaques du carrousel et placez-les dans le poste de manipulation des liquides. Incluez la plaque d’étalonnage avec 20 microlitres de différentes concentrations de glucose en trois exemplaires. Placez un conteneur à déchets en position 1, une boîte d’embouts de 300 microlitres en position 2 et une auge de 250 millilitres avec 110 millilitres d’acide phénol-sulfurique fraîchement préparé en position 3.À l’aide d’une pipette à 8 canaux avec des pointes de 300 microlitres, transférez 180 microlitres d’acide phénol-sulfurique dans chaque rangée de toutes les plaques. Couvrez toutes les plaques de microtitration avec des couvercles et mélangez en agitant pendant cinq minutes à 900 tr/min à température ambiante. Incuber pendant 35 minutes à 80 degrés Celsius dans un four pour la réaction de couleur.Après avoir refroidi les plaques sous une hotte, mesurez l’extinction à 480 nanomètres. Les souches issues du dépistage automatisé sont désignées comme EPS positives si elles remplissent au moins deux des trois critères suivants. Contrôle de la viscosité, détection du polymère et calcul de l’équivalent de glucose.L’équivalent en glucose est calculé à l’aide de cette équation. L’empreinte glucidique de la plate-forme de dépistage contient les trois dernières tâches qui sont effectuées manuellement. Le filtrat restant des résultats positifs de la deuxième tâche fournit la base du filtrat de gel de la cinquième tâche.La sixième tâche est la micro-hydolyse à 96 puits du filtrat de gel. Pour ce faire, utilisez d’abord une pipette à 12 canaux de 50 microlitres pour transférer 20 microlitres de filtrat de gel sur une nouvelle plaque PCR. Ensuite, utilisez une pipette multi-étapes de 1,25 millilitre pour ajouter 20 microlitres de quatre molaires d’acide trifluoroacétique dans chaque puits.Couvrez la plaque PCR avec un tapis de finition en élastomère thermoplastique et placez la plaque PCR dans un dispositif de serrage spécial. Mélangez les solutions en inversant 10 fois le dispositif de serrage. Après avoir centrifugé la plaque PCR et l’avoir fixée dans le dispositif de serrage, placez le dispositif de serrage sécurisé dans un bain de sable préchauffé et incubez à 121 degrés Celsius pendant 90 minutes.À l’aide d’une pipette à 12 canaux de 200 microlitres, ajoutez une solution d’ammoniac à 3,2 % pour ajuster le pH à environ huit. Couvrez la plaque PCR avec un tapis de finition en élastomère thermoplastique et secouez-la manuellement à l’aide du dispositif de serrage. La dernière tâche consiste à analyser l’empreinte glucidique via la méthode à haut débit 1-phényl-3-méthyl-5-pyrazolone, ou HTPMP.Pour commencer cette procédure, utilisez une pipette à 12 canaux de 50 microlitres pour transférer 25 microlitres d’hydrolysat neutralisé sur une plaque PCR fraîche. Ajoutez 75 microlitres de mélange de réactifs de dérivatisation et recouvrez la plaque d’un tapis de capuchon en élastomère thermoplastique. Placez la plaque PCR dans un cycleur PCR à 70 degrés Celsius pendant 100 minutes, puis refroidissez-la à 20 degrés Celsius.Transférez une aliquote de 20 microlitres dans une nouvelle plaque de microtitrage, puis utilisez une pipette à 12 canaux de 200 microlitres pour ajouter 130 microlitres d’acide acétique de 19,23 millimolaires à chaque ligne. Mélangez directement par aspiration et distribution au moins six fois, et transférez tout le liquide sur une plaque filtrante de 0,2 micromètre avec une plaque collectrice de microtitre. Centrifugez la plaque à 1 000 x g pendant cinq minutes, retirez la plaque filtrante et scellez la plaque collectrice de microtitres avec un tapis de capuchon en silicone.Placez la plaque de micro-titrage dans l’UHPLC-UV-ESI-MS pour la détermination de l’empreinte glucidique. Ce tableau présente les résultats de trois nouvelles souches exemplaires identifiées avec succès grâce à cette plateforme de criblage. La partie gauche du tableau présente les résultats des modules de dépistage automatisés concernant la formation de la viscosité, la production de polymères et l’équivalent en glucose de l’hydrolyse totale, qui ont été utilisés comme paramètres d’évaluation pour l’analyse détaillée des empreintes glucidiques.L’empreinte glucidique basée sur les sucres calibrés ainsi que les sucres, dimères et substituants inconnus est donnée dans la partie droite du tableau. À l’aide de ces informations, la composition monomère peut être calculée et comparée avec des structures polymères déjà connues. De plus, un criblage ciblé de compositions monomères intéressantes et de glucides rares peut être effectué.Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée pour 386 souches en seulement cinq heures. Suite à cette procédure, des dosages supplémentaires comme le pyruvate déjà existant ou d’autres dosages pour les acétates ou le phosphate peuvent être inclus afin de répondre à une question supplémentaire de déclaration d’exopolysaccharide. Après son développement, cette technique, par sa grande sensibilité, a ouvert la voie à nos recherches dans le domaine des producteurs d’exopolysaccharides microbiens modifiés par génie génétique pour explorer l’effet des voies de biosynthèse des exopolysaccharides modifiés sur la structure chimique résidente.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier de nouveaux producteurs d’exopolysaccharides de manière très rapide et fiable.

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