Name: Effets différentiels des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Découvrez comment les médicaments hypolipidémiants modulent la morphologie des particules de cholestérol grâce à la méthode de plaque array. Cette approche permet d'évaluer les effets des statines et autres traitements sur la formation des particules VLDL et LDL.

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Ce travail a été financé par une recherche Plaxgen subvention octroyée à la SM (PLX-1008). Nous remercions Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute pour la collecte des échantillons de sérum de sujets à l’athérosclérose l’approbation de l’IRB.

1. préparation des fluorescents marqués au cholestérol et médicaments hypolipidémiants Remarque : agrégats Fluorescent-étiquetées de cholestérol et les statines ont été préparés comme indiqué dans notre précédent article 21. s’il vous plaît voir Table des matières pour plus de détails de réactifs, d’imagerie cytomètre en flux, analyseurs et logiciel d’analyse de données utilisées dans cette étude.
<ol><li>Solubiliser fluorescent-étiquetées lyophilisée cholestérol (mg 1, Ex / Em = 495 nm/507 nm) en poudre dans 1 mL d’alcool à 100 %.</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon pendant 3 min à 2 040 x g et utiliser les fractions surnageantes contenant des agrégats de cholestérol de fluorescence-étiquetée soluble dans l’essai de plaque tableau.</li>
	<li>Pour la préparation de médicaments, individuellement solubiliser les poudres (2 mg) de la simvastatine, la lovastatine, atorvastatine, ezetimibe et acides gras oméga-3 dans 1 ml d’alcool à 100 %.</li>
	<li>Après centrifugation pendant 3 min à 2 040 x g, utiliser les fractions surnageantes contenant des médicaments dans le dosage.</li>
	<li>De la même façon, solubiliser individuellement les poudres (2 mg) de la fluvastatine, rosuvastatine, niacine et fibrate dans 1 mL d’eau déminéralisée pour faire une solution de 2 mg/mL.</li>
	<li>Après centrifugation pendant 3 min à 2 040 x g, utiliser les fractions surnageantes contenant des médicaments dans l’essai de plaque tableau.</li>
</ol> 2. Plaque tableau dosage pour la Formation de particules de cholestérol examen In Vitro <ol><li>emploi chimie analyseur-1 (voir Table des matières) pour mettre en place le test de tableau de plaque pour la formation de particules de cholestérol. Effectuez le test dans un fond rond, plaque à 96 puits hypoprotidique liaison utilisant les réactifs préparés dans la Section 1. Maintenir le volume de réaction finale dans chaque puits à 200 µL et effectuer tous les essais en triple exemplaire.
	<ol><li>Tout d’abord, charge 194,5 µL de phosphate buffered saline (PBS) dans chaque puits.</li>
		<li>Pour chaque puits, ajouter 2,5 µL (5 µg) de chaque solution de médicaments hypolipidémiants et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur la plaque de réaction analyseur-1 chimie mélanger uniformément le médicament en solution. Aucun médicament n’est ajouté pour les échantillons de contrôle négatif.</li>
		<li>Enfin, ajouter 2 µL (2 µg) fluorescent-étiquetées cholestérol global solution dans chaque puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur la plaque de chimie réaction analyseur-1.</li>
		<li>Incuber la plaque sur un agitateur de laboratoire pendant 2 h à 37 ° C et 200 tr/min.</li>
		<li>Après l’incubation, acquérir les images de particules par imagerie cytométrie.</li>
	</ol></li></ol> 3. Capture d’Images de cholestérol des particules à l’aide d’imagerie Flow Cytometry <ol><li>ouvert le modèle d’acquisition de données pour charger les paramètres de l’instrument approprié. Cliquez sur " fichier ", puis sélectionnez " modèle Open … " et sélectionnez le modèle fichier.</li>
	<li>Cliquez " Flush, serrure, charge " de préparer l’instrument pour le chargement de l’échantillon.</li>
	<li>Lorsque la " Load Sample " dialogue boîte s’ouvre, cliquez sur " OK " pour charger 50 µL des échantillons de chaque bien préparés à l’article 2 dans le cytomètre imagerie.</li>
	Cliquez sur <li>" courir | Le programme d’installation " pour voir les particules de la zone d’imagerie en temps réel.</li>
	<li>Lorsque les particules dans la zone d’imagerie sont en bonne discussion, cliquez sur " exécuter | Acquérir " d’acquérir des images de chaque objet en même temps de manière à haut débit pour champ sombre (côté scatter/SSC), champ lumineux (BF), fluorescence verte et fluorescence jaune.</li>
	<li>Répétez les points 3.2-3.5 pour acquérir 5 000-10 000 particules de chaque échantillon.</li>
	<li>Analyser tous les fichiers image raw à l’aide de logiciels d’analyse de l’image permettant de déterminer l’intensité de fluorescence d’objet et de variations morphologiques.
	<ol><li>Cliquez le " outils " bouton en haut du logiciel d’analyse de l’image, puis sélectionnez " par lots des fichiers de données " dans le menu déroulant, qui ouvrira la " lots " fenêtre.</li>
		<li>Dans la " lots " fenêtre, cliquez sur le " ajouter lot " bouton, qui ouvrira ses portes le " définir un lot " fenêtre.</li>
		<li>Dans la " définir un lot " fenêtre, cliquez sur le " ajouter des fichiers " bouton et sélectionnez les fichiers image raw, cliquez sur le " modèle " bouton et sélectionnez le fichier de modèle de l’analyse de données approprié, puis sélectionnez " OK " et " lots de présenter " pour commencer le traitement et l’analyse des fichiers image raw.</li>
	</ol></li></ol> 4. Plaque tableau dosage selon évaluation de médicaments effet hypolipidémiant sur les particules de cholestérol purifié <ol><li>comme indiqué au point 2.1, effectuer le test de formation de particules de cholestérol utilisant des particules/lipoprotéines VLDL, LDL et HDL purifiées. Effectuer l’essai de tableau plaque dans une plaque à 96 puits.
	<ol><li>Tout d’abord, chargez tous les puits avec du PBS ; utiliser un volume final de 200 µL à chaque puits.</li>
	</ol></li> <li>Pour contrôle négatif, ajouter 4 µg VLDL, LDL, ou les protéines/particules HDL individuellement dans chaque bien sans drogue et secouer la plaque pendant 30 s.
	<ol><li>Pour étudier l’effet de médicaments hypolipidémiants, ajouter 4 µg VLDL, LDL, ou les protéines/particules HDL individuellement à chaque bien et secouer la plaque pendant 30 s.</li>
		<li>Wells additionné de 4 µg VLDL, LDL ou HDL, ajouter 2,5 µL (5 µg) de solution de l’ézétimibe, lovastatine, simvastatine ou niacine et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant dans l’analyseur de chimie-1.</li>
		<li>Enfin, ajouter 2 µL (2 µg) marqués par fluorescence cholestérol global solution à tous les puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur la plaque de chimie réaction analyseur-1.</li>
	</ol></li> <li>Incuber la plaque pendant 2 h dans un shaker lab fixé à 37 ° C et 200 tr/min.</li>
	<li>Acquérir les échantillons à l’aide d’imagerie cytométrie en suivant les étapes 3.1-3.5.</li>
	<li>Analyser les fichiers d’images raw à l’aide de logiciels d’analyse image comme indiqué au point 3.7.</li>
	<li>Dans le modèle d’analyse, utilisez le schéma suivant de blocage pour l’identification des sous-populations de particules de cholestérol.
	<ol><li>Sur un terrain de canal vert saturé de pixels (axe x) et le champ sombre canal saturé de pixels (axe y), rejeter les objets avec un ou plusieurs pixels saturés dans des canaux.</li>
		<li>Tracer les objets/particules sans pixel saturé en utilisant l’intensité du canal vert (axe x) et l’intensité SSC (axe y) : objets tombent dans l’une des trois régions (VLDL, LDL, HDL) selon leur couche verte et les intensités SSC. 
		Remarque : Ces portes ont été créés basés sur les données générées par des expériences de contrôle effectués à l’aide de VLDL, LDL et HDL particules/protéines purifiées sans médicament.</li>
	</ol></li> <li>Pour déterminer l’effet de médicaments hypolipidémiants pour chaque échantillon, calculer les concentrations de particules lipoprotéiques total, ainsi que le pourcentage de chaque sous-population (VLDL, LDL, HDL) comme décrit dans étape 6.5.
	Des concentrations de <ol><li>calculer les particules (particules/mL) selon l’équation suivante : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"> Remarque : les VLDL, LDL et HDL gating régions dans la fluorescence dot-parcelle détecter ~ 80 % de leurs populations respectives et les autres ~ 20 % des particules de chevauchement avec d’autres régions gating.</li>
	</ol></li></ol> 5. Mesure des Concentrations des lipides dans les échantillons de sérum <ol><li>pour la détermination des concentrations de LDL, HDL, cholestérol et triglycérides par analyseur de chimie-2, utiliser des échantillons de sérum prélevés appariés selon l’âge des sujets normaux et les dyslipidémies.</li>
	<li>Définir une concentration anormale de LDL, HDL, cholestérol et triglycérides selon leur concentration identifiée au-delà des valeurs de référence supérieure et inférieure dans le sérum.</li>
	<li>Suivre la référence normale valeur recommanDED par le fabricant de réactifs : cholestérol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4 à 100 mg/dL) et les triglycérides (9 à 200 mg/dL).</li>
	<li>Identifier les échantillons de sérum qui ont une valeur anormale que soit inférieure à la valeur de référence inférieure ou au-dessus de la mention plue de valeur pour le cholestérol et les triglycérides et utilisez-les pour le dépistage de la présence et l’absence de médicaments hypolipidémiants.</li>
</ol> 6. Analyser les effets de la drogue sur la Formation de particules de cholestérol dans le sérum <ol><li>utiliser la chimie analyseur-1 à mettre en place le test de tableau de plaque pour la formation de particules de cholestérol dans le sérum. Effectuez le test dans un fond rond, plaque à 96 puits liaison faible en protéines. Utiliser un réactionnel final de 200 µL/puits et effectuer tous les essais en triple exemplaire.</li>
	<li>Préparer le plateau en chargeant des réactifs de manière graduelle.
	<ol><li>Préparer les puits témoins de.</li>
		<li>Charge 193 µL de PBS dans chaque cupule.</li>
		<li>Ajouter de sérum de patient de 2,5 % (v/v) (échantillon de seul sérum / puits) et agiter la plaque pendant 30 s en le plaçant sur la plaque de réaction Chimie analyseur.</li>
		<li>Ajouter 2 µL (2 µg) de fluorescence-étiquetée cholestérol total solution dans chaque puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur une plaque de réaction analyseur-1 chimie.</li>
	</ol></li> <li>Préparer les puits avec des médicaments.
	<ol><li>Charge 191 µL de PBS dans chaque cupule.</li>
		<li>Ajouter de sérum de patient de 2,5 % (v/v) (échantillon de seul sérum / puits) et agiter la plaque pendant 30 s en le plaçant sur une plaque de réaction analyseur-1 chimie.</li>
		<li>Ajouter 2 µL ezetimibe, lovastatine, simvastatine ou niacine solution (4 µg) pour tous les puits sauf les puits de contrôle négatif. Ajouter qu’un seul médicament / puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur une plaque de réaction analyseur-1 chimie.</li>
		<li>Ajouter 2 µL de fluorescence-étiquetée cholestérol total solution (2 µg) dans chaque puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur la plaque de chimie réaction analyseur-1.</li>
	</ol></li> <li>Charger des drogues qu’après tous les puits (témoins et traités) ont été chargés avec leurs échantillons de sérum respectifs et ajouter le cholestérol marqués par fluorescence à la fin de cette étape.</li>
	<li>Incuber la plaque pendant 2 h dans un shaker lab fixé à 37 ° C et 200 tr/min.</li>
	<li>Acquérir les échantillons par imagerie cytomètre de flux après réglages décrits aux étapes 3.1-3.6.</li>
	<li>Utiliser l’image analyser les logiciels pour tous les fichiers d’image en utilisant le même modèle comme décrit aux étapes 3,7 de traitement par lot.
	<ol><li>Effectuer l’analyse des données en dessinant des portes sur le terrain, comme indiqué aux paragraphes 4.5 et 4.6.</li>
	</ol></li> <li>Pour déterminer la hypolipidémiants effet/réaction aux médicaments (faible, modérée et élevée) pour chaque échantillon, calculer la concentration de particules lipoprotéiques total, ainsi que le pourcentage du totales particules comprenant des VLDL, LDL et HDL sous-populations.</li>
	<li>Tracer les populations VLDL, LDL et HDL sur un histogramme de l’objet ' s lumineux zone image, largeur soustraite de longueur (longueur - largeur) et porte en régions globulaires ou linéaires : objets (longueur - largeur) ≤ 2 µm tombent dans le région globulaire pour calculer le pourcentage de forme globulaire et linéaire en forme de particules.</li>
	<li>Comparer le pourcentage de globulaires et linéaires en forme LDL et HDL cholestérol particules identifiées pour chaque échantillon de sérum incubé avec et sans drogue. Parmi les valeurs en triple obtenus pour chaque échantillon de sérum, accepter le pourcentage de forme globulaire et linéaire en forme des particules LDL et HDL qui entrent dans la gamme ±2 SD pour la détermination de l’effet de la drogue.</li>
</ol>

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<li>Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+HDL+and+the+best+way+to+measure+it%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The changing face of HDL and the best way to measure it.</a> Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).</li>
</ol>

Dr. Madasamy a reçu des subventions de Plaxgen, Inc et a un intérêt financier concurrent. Les autres auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes de divulguer.

En général, la distribution et les propriétés fonctionnelles des particules de cholestérol VLDL, LDL et HDL dans la circulation sanguine sont principalement déterminées par métabolique, génétique, épidémiologique, cellulaire et plasma facteurs22,23. Dans la présente étude, portant sur les effets des modificateurs de lipide drogues dans la mémoire tampon a révélé que les médicaments très lipophiles comme l’atorvastatine, lovastatine, simvastatine et ézétimibe induisaient une complexité de niveau supérieure sur la morphologie des particules de cholestérol par rapport à l’effet du niveau inférieur observé avec des médicaments hautement hydrophiles de la rosuvastatine et la fluvastatine. Ces résultats sont en accord avec notre étude précédente décrivant un effet non enzymatique mécanisme basé des statines dans la formation de particules de cholestérol LDL et HDL dans la mémoire tampon et le sérum échantillons21de modulation. En conséquence, les résultats de la présente étude a révélé un mécanisme non enzymatique d’action de l’ézétimibe, niacine, fibrate et acides gras oméga-3 les médicaments qui peuvent jouer un rôle direct dans la modulation de la formation de particules de cholestérol. Il est possible que les interactions entre les médicaments et les agrégats de cholestérol conduit à l’Assemblée de particules de cholestérol de grande taille qui sont 2-60 µm2, présentant des morphologies brin globuleux et linéaire.
En outre, les résultats obtenus à l’aide de particules lipoprotéiques purifiée suggèrent des interactions entre les agrégats de cholestérol et facteurs plasmatiques, y compris les VLDL, LDL et HDL des protéines qui peuvent altérer les compositions et les propriétés morphologiques du cholestérol particules. Les résultats de traitement de drogue impliquant les particules lipoprotéiques purifiée ont indiqué un effet de drogue de niveau supérieur sur la formation de particules de VLDL par rapport à leur effet observé sur la formation de particules de cholestérol LDL. Les médicaments de la lovastatine, simvastatine et ézétimibe servaient comme pro-médicaments et les doses dans les essais peuvent être plus élevées que les concentrations physiologiques.
Fait intéressant, dépistage des échantillons de sérum ont montré des variations des effets du médicament sur la modification des profils de formation de particules de cholestérol VLDL, LDL et HDL, en particulier leurs effets sur les formations de linéaire en forme de particules de LDL et HDL. Ces drogues a induit une réduction sur le linéaire en forme de formation de particules de cholestérol LDL et HDL dans la dyslipidémie et de sérums normaux appariés selon l’âge. Les effets des médicaments observés sur la réduction de la formation de particules en forme linéaire était plus élevée chez simvastatin ezetimibe, lovastatine et niacine. L’identification des particules de cholestérol avec des morphologies de brin globuleux et linéaire dans les échantillons de sérum normal et les dyslipidémies donne à penser que les particules avec des morphologies semblables peuvent se former dans des conditions in vivo . Des études antérieures ont identifié la présence du disque et de cristaux aciculaires de cholestérol dans les plaques d’athérosclérose de l’homme et ApoE- / - et LDLR- / - souris modèles24,25,26 ,27,28.
Les particules HDL circulant dans le sang existent comme un mélange hétérogène et le niveau de particules HDL de petite ou de grande envergure ainsi que de l’activité fonctionnelle sont des facteurs importants pour exercer leur effet cardioprotecteur via le transport du cholestérol inverse sentier29,30. Des études récentes ont mis en évidence l’importance d’identifier des HDL cholestérol particule sous-fractions pour élucider leur rôle dans plusieurs fonctions biologiques telles que l’efflux de cholestérol, anti-inflammatoire, antithrombotique et antioxydantes31 . En outre, un certain nombre d’études ont signalé l’effet du traitement hypolipidémiant en augmentant un faible à modérée des taux de HDL dans le plasma1,5,21. Par conséquent, les résultats de cette étude apportent un nouvel éclairage sur les caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol. Notamment, la détection d’un niveau plus élevé de particules en forme linéaires de cholestérol HDL dans les échantillons de sérum de sujets de dyslipidémie suggère qu’ils pourraient être le biomarqueur fiable pour diagnostic et évaluation des effets de la modification des lipides médicaments chez des patients. Toutefois, outre enquête est requise à l’aide de grands échantillons cliniques pour mieux comprendre les particules de cholestérol avec des morphologies distinctes et leur association aux MCV.
Dans l’essai de tableau de plaque pour examiner l’effet des drogues sur l’assemblage de particules de cholestérol, nous avons utilisé 2 µg de fluorescence étiqueté agrégats de cholestérol et 5 µgof de chaque drogue parce que : (1) médicaments competitivement lient à deux fluorescence étiqueté cholestérol et lipides endogènes présents dans les échantillons de sérum ; (2) de chaque échantillon, nous avons acquis des particules de cholestérol de 5 000 à 10 000 qui sont assemblés en grandes tailles et de formes allant de ~ 2-60 µ2; (3) nous avons observé une grandes variations de la réaction aux médicaments dans les échantillons de sérum incubé avec les médicaments (doses 300 ng à 5 µg) et ~ 1 à 5 % d'entre eux incubés avec de fortes doses ont montré aucun changement détectable dans le profil de la formation de particules de cholestérol ; et (4) l’interaction entre les agrégats de cholestérol et de médicaments hypolipidémiants est médiée par un processus non enzymatiques. Par conséquent, les concentrations des réactifs utilisés dans l’essai peuvent être supérieures à son niveau physiologique.
En conclusion, nous avons démontré avec succès les avantages d’un in vitro d’imagerie méthode décrite dans la présente étude pour déterminer l’effet d’un large spectre de médicaments hypolipidémiants sur modulant la morphologie et la composition du cholestérol particules. L’approche de visualiser et de quantifier la morphologie des particules lipidiques en employant une constellation d’algorithmes d’analyse image peut aider les deux le diagnostic d’athérosclérose et d’évaluer les résultats du traitement hypolipidémiant chez les patients.

De nombreuses études cliniques ont démontré les effets bénéfiques des médicaments hypolipidémiants dans la réduction des taux plasmatiques de cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL) et une faible à un niveau modéré de l’augmentation du cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL), qui empêche les primaires et secondaires de l’incidence des événements cardiovasculaires liées à l’athérosclérose1,2,3,4,5. Statines, un groupe d’inhibiteurs de l’enzyme HMG-CoA réductase, bloquent la synthèse du cholestérol endogène dans le foie qu’à son tour pour abaisser la circulation des niveaux de cholestérol LDL dans le sang6,7. De même, l’effet de la niacine hypolipidémiants est médiée par son inhibition directe et non compétitive des hépatocytes diacylglycerol acyltransferase-2, une enzyme du foie clée impliqués dans la synthèse de triglycérides8. Comparativement, ezetimibe réduit le taux plasmatique de LDL en limitant l’absorption du cholestérol exogène en se liant à la protéine de Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) situé dans les cellules épithéliales de l' intestin grêle9. Fénofibrate, un autre médicament hypolipidémiant, réduit considérablement les concentrations plasmatiques de triglycérides et aussi modérément réduit le cholestérol LDL dans les peroxysomes récepteurs activés par les proliférateurs voie10. En outre, acide gras oméga-3 est rapporté pour avoir l’effet anti-athérosclérotiques en raison de sa capacité de réduire les concentrations plasmatiques de LDL11.
Les médicaments hypolipidémiants, en plus de leur effet principal sur l’abaissement du cholestérol LDL, ont un certain nombre d’effets pléiotropiques bénéfiques, notamment améliorer le niveau de HDL, améliorer les fonctions endothéliales, réduisant l’inflammation et inhibition plaquettaire agrégations12,13,14. Toutefois, le mécanisme sous-jacent de ces médicaments en augmentant les particules de cholestérol HDL et en modifiant leurs caractéristiques structurelles ne sont pas entièrement compris. Puisque ces médicaments sont largement prescrits pour traiter les maladies cardiovasculaires liées à l’athérosclérose (CVDs), il est essentiel d’approfondir leur rôle possible dans la détermination des caractéristiques morphologiques et la distribution des particules lipidiques. Le lipidome de plasma humain se compose d’environ 600 lipides distinctes et 22 différents modèles moléculaires de cholestérol qui sont présents dans diverses tailles, formes, densités et compositions15,16,17 . Méthodes d’analyse telles qu’ultra-centrifugation, RMN et électrophorèse sur gel en gradient sont utilisées pour caractériser les particules de LDL et HDL et les sous-fractions18,19. Toutefois, l’application de ces méthodes est limitée à des études visant à déterminer l’effet des drogues dans la modulation de la morphologie et l’assemblage des particules lipidiques. Le tableau de base plaque cytomètre en flux est un dosage biochimique fonctionnel développé pour la détection et la visualisation de sérum provenant de particules plaque amyloïde et lipides20. Les avantages de in vitro méthode décrite dans la présente étude d’imagerie permettent d’identifier lipide-moduler les effets des médicaments dans l’altération de la morphologie et la distribution des particules de cholestérol dans les échantillons de sérum et de la mémoire tampon.

<table><tbody><tr><td>TopFluor cholestérol fluorescent</td><td>Avanti Polar lipides stocker 100</td><td></td><td>& micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>simvastatine (pro-médicament)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>magasin 100 &micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>lovastatine (pro-médicament)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>rosuvastatine</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>atorvastatine</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>fluvastatine</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 &micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>ezetimibe (pro-drogue)</td><td>Cayman Chemicals</td><td></td><td>store 100 & micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Niacin</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>magasin 100 & micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>fibrate</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>store 100 &micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>acide gras oméga-3</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>magasin 100 &micro ; l aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>protéines/particules VLDL purifiées</td><td>Lee Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>protéines/particules LDL purifiées</td><td>Lee Bio</td> protéines/particules HDL purifiées Lee Bio <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>Sérum</tr><tr><td>humain adapté à l’âge Dx</td><td>Biosamples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’athérosclérose humaine</td><td>Bioserve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum normal humain</td><td>Stanford Pack</td> de réactifs de mesure LDL Roche <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pack de réactifs de mesure HDL</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesure du cholestérol total</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques</td><td></td><td></td><td></td>de microtitrage 96 puits</tr><tr><td>Mesure des triglycérides</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux Amnis</td><td>Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images IDEAS</td><td>Amnis Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de chimie-1, ChemWel 2902</td><td>Analyseur de chimie Awarness Technology-2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Intergra 400</td><td>Roche Diangostics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effets différentiels des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Traitement des dyslipidémies diabétiques hypolipidémiants conduit à une réduction significative au niveau des lipoprotéines de basse densité (LDL) et un faible à un niveau modéré de l’augmentation du cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL) dans le plasma. Toutefois, un rôle éventuel de ces médicaments dans l’altération de la morphologie et la distribution des particules de cholestérol est mal compris. Nous décrivons ici l’évaluation in vitro des effets des médicaments hypolipidémiants dans la modulation des caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol à l’aide de la méthode array et plaque en combinaison avec l’imagerie de cytométrie en flux. Analyses d’image des particules de cholestérol indiquent que lovastatine, simvastatine, l’ézétimibe et l’atorvastatine induisent la formation de particules en forme de chapelet globulaires et linéaires, alors que la niacine et fibrates, fluvastatine, rosuvastatine induisent la formation de seulement des particules en forme de forme globulaire. Ensuite, très purifiée de lipoprotéines de basse densité (VLDL) et des particules de LDL incubées avec ces médicaments ont montré des changements dans la texture de la morphologie et l’image du cholestérol sous-populations de particules. En outre, dépistage de 50 échantillons de sérum ont révélé la présence d’un niveau plus élevé de particules en forme linéaires de cholestérol HDL chez les sujets atteints de dyslipidémie (moyenne de 18,3 %) comparée aux échantillons appariés selon l’âge normal (moyenne de 11,1 %). Nous avons également observé des variations considérables dans les effets des médicaments hypolipidémiants sur la réduction des linéaires en forme de formation de particules de cholestérol LDL et de HDL dans le sérum. Ces résultats indiquent que les médicaments hypolipidémiants, outre leurs effets hypolipémiants à médiation cellulaire, peuvent moduler directement la morphologie des particules de cholestérol par un mécanisme non enzymatique de l’action. Les résultats de ces résultats ont un potentiel pour informer le diagnostic d’athérosclérose et prévoir un traitement hypolipidémiant optimal.

L’objectif de cette étude était d’évaluer in vitro les effets des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol. Comparaison des médicaments hypolipidémiants ont révélé des variations dans leurs effets en modulant les caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol.

Effets différentiels des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

L’objectif général de cette étude est d’évaluer l’effet des médicaments hypolipidémiants dans la modulation des caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol à l’aide d’une méthode de réseau de plaques, et d’identifier des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic de l’athérosclérose et la détermination des effets des médicaments. Le rôle des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la formation des particules de cholestérol est mal compris. Nous démontrons ici que les médicaments hypolipidémiants jouent un rôle direct dans la modification des profils et des caractéristiques morphologiques de la formation des particules de cholestérol.Le principal avantage de la méthode d’imagerie in vitro basée sur la puce à plaques par rapport aux autres méthodes de détection de particules est qu’elle permet de visualiser les particules de cholestérol pour évaluer l’effet des médicaments hypolipidémiants dans le sérum. Jason Lundry, technicien de laboratoire chez Plaxgen, montrera comment nous configurons le test de matrice de plaques à l’aide d’un analyseur de chimie. Raymond Kong, scientifique principal chez Millipore Sigma, montrera comment nous traitons les échantillons à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie.Enfin, David Liu, technicien de laboratoire pour Plaxgen, fera une démonstration d’analyse de données pour des images de particules de cholestérol. Utilisez un analyseur de chimie-1 pour configurer le test de formation de particules de cholestérol. Tout au long de l’essai, maintenez le volume de réaction final dans chaque puits à 200 microlitres et effectuez tous les essais en trois exemplaires.Tout d’abord, chargez 194 virgule cinq microlitres de solution saline tamponnée au phosphate, ou PDS, dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond rond à faible liaison protéique. À chaque puits, ajoutez deux virgule cinq microlitres de chaque solution de médicament hypolipidémiant, aucun médicament n’est ajouté aux échantillons de contrôle négatifs. Ensuite, secouez la plaque pendant 30 secondes, en la plaçant sur la plaque de réaction de l’analyseur de chimie-1 pour mélanger uniformément le médicament dans la solution.Enfin, ajoutez deux microlitres de solution d’agrégat de cholestérol marquée par fluorescence dans chaque puits. Secouez la plaque pendant 30 secondes en la plaçant sur la plaque de réaction de l’analyseur de chimie-1 comme précédemment. Ensuite, incubez la plaque sur un agitateur de laboratoire pendant deux heures réglées à 37 degrés Celsius et 200 tr/min.Après l’incubation, acquérir les images des particules par cytométrie en flux d’imagerie. Ouvrez le modèle d’acquisition de données pour charger les paramètres corrects de l’instrument. Cliquez sur Fichier, puis sélectionnez Charger le modèle et sélectionnez le fichier de modèle.Cliquez sur Charger pour préparer l’instrument au chargement de l’échantillon. Lorsque la boîte de dialogue Charger l’échantillon s’ouvre, cliquez sur OK pour charger 50 microlitres d’échantillons dans le cytomètre en flux d’imagerie. Attendez que les particules soient visibles dans la zone d’imagerie en temps réel.Lorsque les particules de la zone d’imagerie sont bien nettes, cliquez sur Acquérir pour acquérir des images de chaque objet simultanément à haut débit pour le fond sombre, le fond clair, la fluorescence verte et la fluorescence jaune. À la fin de l’acquisition, cliquez sur le bouton Retour pour retourner l’échantillon. Répétez ces étapes pour obtenir 5 000 à 10 000 particules de chaque échantillon.Analysez tous les fichiers d’images brutes à l’aide du logiciel d’analyse d’images pour déterminer l’intensité de fluorescence de l’objet et les variations morphologiques, comme décrit dans le protocole texte. Préparez une plaque à fond rond à faible teneur en protéines de 96 puits en chargeant les réactifs par étapes, en utilisant un volume de réaction final de 200 microlitres par puits. Tout d’abord, préparez les puits de contrôle.Chargez 193 microlitres de PBS dans chaque puits. Ajouter 2,5 % du sérum du patient, en ne chargeant qu’un seul échantillon de sérum par puits. Ensuite, secouez la plaque pendant 30 secondes en la plaçant sur la plaque de réaction de l’analyseur de chimie.Ensuite, ajoutez deux microlitres de solution d’agrégat de cholestérol marquée par fluorescence dans chaque puits. Encore une fois, secouez la plaque pendant 30 secondes en la plaçant sur la plaque de réaction de l’analyseur de chimie-1. Pour préparer les puits avec des médicaments, chargez 191 microlitres de PBS dans chaque puits.Ensuite, ajoutez 2,5 % de chaque sérum de patient par puits et secouez la plaque pendant 30 secondes, en la plaçant sur une plaque réactionnelle d’analyseur de chimie-1. Ajoutez deux microlitres d’ézétimibe, de lovastatine, de simvastatine ou de solution de niacine dans tous les puits sauf les puits de contrôle négatif. En ajoutant un seul médicament par puits.Secouez la plaque pendant 30 secondes comme précédemment. Ensuite, ajoutez deux microlitres de solution d’agrégat de cholestérol marquée à fluorescence dans chaque puits avant de secouer la plaque pendant 30 secondes. Ensuite, incubez la plaque pendant deux heures dans un agitateur de laboratoire, réglé à 37 degrés Celsius et à 200 tr/min.Après l’incubation, acquérez les échantillons par cytométrie en flux d’imagerie en suivant les mêmes paramètres que précédemment. Utilisez le logiciel d’analyse d’images pour le traitement par lots de tous les fichiers image, comme décrit dans le protocole texte. On voit ici des résultats représentatifs montrant l’identification de particules de cholestérol globulaires et linéaires en forme de brin, induites par les statines, par un mécanisme non enzymatique.La confirmation de deux morphologies distinctes de formation de particules de cholestérol, induite par d’autres médicaments hypolipidémiants, est démontrée. Y compris l’ézétimibe, la niacine, le fibrate et l’acide gras oméga-3. Voici des diagrammes à points, où l’axe des X affiche un spectre de particules de cholestérol détectées dans le canal de fluorescence vert.Et l’axe Y affiche une diffusion latérale, le gating montre des régions de particules de lipoprotéines de très basse densité, de lipoprotéines de basse densité et de lipoprotéines de haute densité, détectées dans les diagrammes de fluorescence. Ces résultats démontrent comment l’effet hypolipidémiant modifie les profils des particules de cholestérol VLDL et LDL purifiées, en présence d’aucun médicament, d’ézémide, de lovastatine, de simvastatine et de niacine. Voici un criblage de trois échantillons de sérum différents pour l’identification d’un effet différentiel de divers médicaments hypolipidémiants, qui modulent les profils de formation de particules de cholestérol VLDL, LDL et HDL.Ces profils indiquent également qu’il existe une variation dans les niveaux de réponse entre les trois échantillons de sérum différents. Le criblage du premier échantillon sérique pour les particules de cholestérol globulaires et linéaires formées sans le médicament et en présence de divers médicaments hypolipidémiants, confirme deux morphologies distinctes de particules de cholestérol dérivées du sérum, présentant à la fois des formes globulaires et linéaires. Nous avons donc réussi à démontrer une approche d’imagerie in vitro pour l’identification de l’effet des médicaments hypolipidémiants, qui modulent la relation avec la formation de particules de cholestérol et leur signification clinique.Nos résultats préliminaires sont prometteurs et nous sommes en train de valider davantage ce test de réseau de plaques à l’aide d’échantillons cliniques à grande échelle. Votre panel lipidique standard mesure les taux de cholestérol LDL et HDL dans le sérum. Notre test sur puce à plaques espère améliorer la précision du risque d’athérosclérose et prédit la réponse médicamenteuse hypolipidémiante à l’aide du sérum.

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