Effets différentiels des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol

L’objectif général de cette étude est d’évaluer l’effet des médicaments hypolipidémiants dans la modulation des caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol à l’aide d’une méthode de réseau de plaques, et d’identifier des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic de l’athérosclérose et la détermination des effets des médicaments. Le rôle des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la formation des particules de cholestérol est mal compris. Nous démontrons ici que les médicaments hypolipidémiants jouent un rôle direct dans la modification des profils et des caractéristiques morphologiques de la formation des particules de cholestérol.

Le principal avantage de la méthode d’imagerie in vitro basée sur la puce à plaques par rapport aux autres méthodes de détection de particules est qu’elle permet de visualiser les particules de cholestérol pour évaluer l’effet des médicaments hypolipidémiants dans le sérum. Jason Lundry, technicien de laboratoire chez Plaxgen, montrera comment nous configurons le test de matrice de plaques à l’aide d’un analyseur de chimie. Raymond Kong, scientifique principal chez Millipore Sigma, montrera comment nous traitons les échantillons à l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie.

Enfin, David Liu, technicien de laboratoire pour Plaxgen, fera une démonstration d’analyse de données pour des images de particules de cholestérol. Utilisez un analyseur de chimie-1 pour configurer le test de formation de particules de cholestérol. Tout au long de l’essai, maintenez le volume de réaction final dans chaque puits à 200 microlitres et effectuez tous les essais en trois exemplaires.

Tout d’abord, chargez 194 virgule cinq microlitres de solution saline tamponnée au phosphate, ou PDS, dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond rond à faible liaison protéique. À chaque puits, ajoutez deux virgule cinq microlitres de chaque solution de médicament hypolipidémiant, aucun médicament n’est ajouté aux échantillons de contrôle négatifs. Ensuite, secouez la plaque pendant 30 secondes, en la plaçant sur la plaque de réaction de l’analyseur de chimie-1 pour mélanger uniformément le médicament dans la solution.

Enfin, ajoutez deux microlitres de solution d’agrégat de cholestérol marquée par fluorescence dans chaque puits. Secouez la plaque pendant 30 secondes en la plaçant sur la plaque de réaction de l’analyseur de chimie-1 comme précédemment. Ensuite, incubez la plaque sur un agitateur de laboratoire pendant deux heures réglées à 37 degrés Celsius et 200 tr/min.

Après l’incubation, acquérir les images des particules par cytométrie en flux d’imagerie. Ouvrez le modèle d’acquisition de données pour charger les paramètres corrects de l’instrument. Cliquez sur Fichier, puis sélectionnez Charger le modèle et sélectionnez le fichier de modèle.

Cliquez sur Charger pour préparer l’instrument au chargement de l’échantillon. Lorsque la boîte de dialogue Charger l’échantillon s’ouvre, cliquez sur OK pour charger 50 microlitres d’échantillons dans le cytomètre en flux d’imagerie. Attendez que les particules soient visibles dans la zone d’imagerie en temps réel.

Lorsque les particules de la zone d’imagerie sont bien nettes, cliquez sur Acquérir pour acquérir des images de chaque objet simultanément à haut débit pour le fond sombre, le fond clair, la fluorescence verte et la fluorescence jaune. À la fin de l’acquisition, cliquez sur le bouton Retour pour retourner l’échantillon. Répétez ces étapes pour obtenir 5 000 à 10 000 particules de chaque échantillon.

Analysez tous les fichiers d’images brutes à l’aide du logiciel d’analyse d’images pour déterminer l’intensité de fluorescence de l’objet et les variations morphologiques, comme décrit dans le protocole texte. Préparez une plaque à fond rond à faible teneur en protéines de 96 puits en chargeant les réactifs par étapes, en utilisant un volume de réaction final de 200 microlitres par puits. Tout d’abord, préparez les puits de contrôle.

Chargez 193 microlitres de PBS dans chaque puits. Ajouter 2,5 % du sérum du patient, en ne chargeant qu’un seul échantillon de sérum par puits. Ensuite, secouez la plaque pendant 30 secondes en la plaçant sur la plaque de réaction de l’analyseur de chimie.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de solution d’agrégat de cholestérol marquée par fluorescence dans chaque puits. Encore une fois, secouez la plaque pendant 30 secondes en la plaçant sur la plaque de réaction de l’analyseur de chimie-1. Pour préparer les puits avec des médicaments, chargez 191 microlitres de PBS dans chaque puits.

Ensuite, ajoutez 2,5 % de chaque sérum de patient par puits et secouez la plaque pendant 30 secondes, en la plaçant sur une plaque réactionnelle d’analyseur de chimie-1. Ajoutez deux microlitres d’ézétimibe, de lovastatine, de simvastatine ou de solution de niacine dans tous les puits sauf les puits de contrôle négatif. En ajoutant un seul médicament par puits.

Secouez la plaque pendant 30 secondes comme précédemment. Ensuite, ajoutez deux microlitres de solution d’agrégat de cholestérol marquée à fluorescence dans chaque puits avant de secouer la plaque pendant 30 secondes. Ensuite, incubez la plaque pendant deux heures dans un agitateur de laboratoire, réglé à 37 degrés Celsius et à 200 tr/min.

Après l’incubation, acquérez les échantillons par cytométrie en flux d’imagerie en suivant les mêmes paramètres que précédemment. Utilisez le logiciel d’analyse d’images pour le traitement par lots de tous les fichiers image, comme décrit dans le protocole texte. On voit ici des résultats représentatifs montrant l’identification de particules de cholestérol globulaires et linéaires en forme de brin, induites par les statines, par un mécanisme non enzymatique.

La confirmation de deux morphologies distinctes de formation de particules de cholestérol, induite par d’autres médicaments hypolipidémiants, est démontrée. Y compris l’ézétimibe, la niacine, le fibrate et l’acide gras oméga-3. Voici des diagrammes à points, où l’axe des X affiche un spectre de particules de cholestérol détectées dans le canal de fluorescence vert.

Et l’axe Y affiche une diffusion latérale, le gating montre des régions de particules de lipoprotéines de très basse densité, de lipoprotéines de basse densité et de lipoprotéines de haute densité, détectées dans les diagrammes de fluorescence. Ces résultats démontrent comment l’effet hypolipidémiant modifie les profils des particules de cholestérol VLDL et LDL purifiées, en présence d’aucun médicament, d’ézémide, de lovastatine, de simvastatine et de niacine. Voici un criblage de trois échantillons de sérum différents pour l’identification d’un effet différentiel de divers médicaments hypolipidémiants, qui modulent les profils de formation de particules de cholestérol VLDL, LDL et HDL.

Ces profils indiquent également qu’il existe une variation dans les niveaux de réponse entre les trois échantillons de sérum différents. Le criblage du premier échantillon sérique pour les particules de cholestérol globulaires et linéaires formées sans le médicament et en présence de divers médicaments hypolipidémiants, confirme deux morphologies distinctes de particules de cholestérol dérivées du sérum, présentant à la fois des formes globulaires et linéaires. Nous avons donc réussi à démontrer une approche d’imagerie in vitro pour l’identification de l’effet des médicaments hypolipidémiants, qui modulent la relation avec la formation de particules de cholestérol et leur signification clinique.

Nos résultats préliminaires sont prometteurs et nous sommes en train de valider davantage ce test de réseau de plaques à l’aide d’échantillons cliniques à grande échelle. Votre panel lipidique standard mesure les taux de cholestérol LDL et HDL dans le sérum. Notre test sur puce à plaques espère améliorer la précision du risque d’athérosclérose et prédit la réponse médicamenteuse hypolipidémiante à l’aide du sérum.