Évaluation Spécificité de Anticancer Drugs In vitro

L'objectif de ce protocole est d'évaluer la spécificité des médicaments anticancéreux in vitro en utilisant des cultures mixtes contenant des cellules tumorales à la fois et non tumorales.

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer le changement de proportion dose-dépendant des cellules tumorales dans une culture contenant à la fois des cellules tumorales et non tumorales. Cette méthode fournit un outil génétique pour évaluer l’effet in vitro et la spécificité des médicaments anticancéreux. Il a un potentiel d’application dans la découverte de médicaments et dans les soins personnalisés contre le cancer.

Le principal avantage de cette méthode est que lorsqu’un médicament anticancéreux est testé dans une culture contenant à la fois des cellules tumorales et des cellules non tumorales, la réponse des cellules tumorales peut être séparée de celle des cellules non tumorales. Eena, une technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Commencez cette procédure en cultivant à la fois des cellules tumorales et des fibroblastes dans un milieu DMA standard à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

À la sous-confluence, récoltez les cellules avec 0,05 % de trypsine et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, mélangez 400 cellules tumorales et 1 600 cellules non tumorales dans chaque puits d’une plaque de culture de 96 puits avec 0,2 ml de milieu et mettez en place quatre répétitions pour chaque concentration de médicament. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Ensuite, préparer les solutions mères de Nilotinib dans du DMSO à 0, 2, 4 et 20 mM. Diluez chacun d’eux par 200 fois dans 5 mL de milieu DMA pour obtenir des solutions médicamenteuses concentrées deux fois de 0, 10, 20 et 100 uM. Ensuite, retirez 0,1 mL du milieu de chaque puits.

Ajouter 0,1 mL de milieu contenant le médicament et continuer à incuber les cellules pendant cinq jours. À la fin du traitement, inspectez les cellules attachées à l’aide d’un microscope à contraste facial et prenez des photos. Aspirez le milieu et lavez une fois les cellules adhésives survivantes avec 0,2 ml de PBS.

Pour lyser les cellules à l’aide de la méthode HotSHOT, ajoutez 50 μL de solution de lyse alcaline dans chaque puits. Scellez les puits avec du papier d’aluminium. Ensuite, incubez la plaque à 95 degrés Celsius dans un four ou sur une plaque chauffante pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, vérifiez au microscope qu’il ne reste plus de cellules intactes à la surface des puits. Dans le cas où les cellules ne se lysent pas complètement, augmentez le temps de chauffage ou ajoutez du détergent. Les congeler une fois à 20 degrés Celsius améliore également la rupture des cellules.

Par la suite, ajoutez 50 μL de la solution neutralisante dans chaque puits, puis transférez tous les lysats dans les puits en forme de U d’une plaque PCR et séchez-les dans un cycleur PCR à 95 degrés Celsius pendant 10 à 30 minutes. Ensuite, reconstituez les lysats avec 20 μL d’eau distillée. Pour dessaler l’ADN à l’aide de la dialyse par goutte, divisez un filtre à membrane de 25 mm de diamètre en quatre zones et numérotez les zones.

Faites flotter les filtres sur de l’eau distillée avec le côté brillant vers le haut dans un puits d’une plaque de 12 puits. Ensuite, transvasez soigneusement les 20 μL de lysat reconstitué sur le filtre. Couvrez l’assiette et dialysez pendant 30 à 60 minutes.

Ensuite, aspirez l’eau sous le filtre sans retourner le filtre ni déranger les gouttes. Transférez les gouttes de lysat dans les puits d’une nouvelle plaque PCR. Ensuite, séchez les gouttes d’ADN en chauffant la plaque à 95 degrés Celsius pendant 10 à 30 minutes dans un cycleur PCR.

Reconstituez ensuite les lysats dans 10 μL d’eau. Ensuite, préparez le mélange principal contenant tous les composants sauf l’ADN pour la réaction PCR numérique à sonde double. Vortex et faites tourner le mélange maître pendant 10 secondes à la force maximale dans la centrifugeuse et distribuez 15 μL du mélange dans chaque puits d’une plaque PCR 96.

Ajouter le lysat de chaque échantillon dans les puits contenant le mélange maître. Transférez 20 μL de chaque mélange réactionnel dans le puits du côté de l’échantillon d’une cartouche à température ambiante. Ensuite, versez 70 μL d’huile de générateur de gouttelettes dans chaque puits du côté huile d’une cartouche.

Fermez la cartouche avec un joint et placez l’ensemble du réglage dans un générateur de gouttelettes avant de commencer la génération de gouttelettes. Transférez ensuite 40 μL de solution de gouttelettes dans chaque puits d’une plaque de PCR à 96 puits. Scellez la plaque avec une feuille d’aluminium et placez la plaque dans un cycleur PCR.

Ensuite, réglez la température du couvercle à 105 degrés Celsius et le taux de rampe à 2 degrés Celsius par seconde. Lorsque vous avez terminé, transférez la plaque dans un lecteur de gouttelettes et commencez à lire. Vous pouvez également conserver la plaque à 4 degrés Celsius jusqu’à 24 heures.

Chargez maintenant les données PCR numériques et effectuez une analyse automatique. Inspectez les échantillons manuellement pour vous assurer que les gouttelettes positives et négatives sont bien séparées. Exclure les échantillons sans séparation claire des gouttelettes positives et négatives de l’analyse ultérieure.

Copiez le rapport NF1/RPP30 obtenu dans une feuille Excel. Ensuite, calculez la proportion de cellules tumorales. Pour chaque concentration de médicament, calculez la moyenne et l’écart-type des quatre répétitions, puis tracez les moyennes et les écarts-types par rapport aux concentrations de médicament.

La réduction dose-dépendante des cellules vitales visibles est illustrée. La proportion de cellules tumorales calculée à partir du rapport entre NF1 et RPP30 a diminué dans la plage de 0 à 10 uM. À la dose la plus élevée de 50 μM, il restait peu de cellules vitales, probablement en raison d’un effet toxique sur toutes les cellules.

La viabilité et la prolifération des cellules totales peuvent être mesurées à l’aide de tests conventionnels, mais la proportion de cellules tumorales peut être déterminée à l’aide de la procédure démontrée dans la présente étude. En utilisant les deux paramètres, la réponse cellulaire totale à un médicament dans une culture mixte peut être divisée en réponse des cellules tumorales et réponse des cellules non tumorales. L’ensemble de la procédure de test peut être effectuée en une semaine, y compris la période de traitement de cinq jours.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le rapport entre le gène cible et le gène d’inversion varie. Nous voyons une plage très étroite qui se situe entre 0 et 1 et donc la précision est essentielle. L’évaluation entre les échantillons et lors de la manipulation doit être réduite autant que possible.

À la suite de cette procédure, des cultures primaires contenant à la fois des cellules tumorales et des cellules non tumorales peuvent être utilisées pour tester l’effet et la spécificité des médicaments anticancéreux. De plus, l’effet d’un médicament sur une certaine sous-population de cellules présentant une altération génétique définie peut être évalué de manière spécifique. J’espère que cette vidéo vous aidera à comprendre comment utiliser les caractéristiques génétiques pour déterminer la proportion de cellules tumorales dans un échantillon ou dans une culture qui contient à la fois des cellules tumorales et des cellules non tumorales.