Optimisé coloration négative: un protocole à haut débit pour examen petites et asymétrique structure des protéines par microscopie électronique

Plus de la moitié des protéines sont de petites protéines (masse moléculaire <200 kDa) qui sont difficiles pour les deux électrons imagerie de microscope et des reconstructions tridimensionnelles. Coloration négative optimisé est un protocole robuste et à haut débit pour obtenir un contraste élevé et des images de petites protéines ou des complexes asymétriques dans différentes conditions physiologiques résolution relativement élevée (~ 1 nm).

L’objectif global de cette procédure est d’imager des protéines petites et asymétriques à l’aide d’un protocole optimisé à haut débit de microscopie électronique à coloration négative. Ceci est accompli en incubant d’abord la protéine dans une station d’incubation préparée tout en préparant un poste de coloration négatif. La deuxième étape de la procédure consiste à laver rapidement l’échantillon sur trois gouttelettes d’eau de manière séquentielle.

La troisième étape consiste à colorer soigneusement l’échantillon sur trois gouttelettes de coloration séquentiellement. La dernière étape consiste à éliminer l’excès de solution en épongeant à l’arrière de la grille EM, puis en séchant doucement sous l’azote gazeux. En fin de compte, les résultats peuvent montrer des images haute résolution de petites protéines grâce à l’imagerie TEM dans une condition de faible défocalisation.

Le principal avantage de cette technique par rapport à la cryo-électromicroscopique est le paramétrage. Il peut permettre un examen à haut débit et une imagerie à contraste élevé de structures protéiques petites et asymétriques tout en réduisant les artefacts de structure dus à la coloration négative conventionnelle. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la base structurelle des mécanismes de petites protéines comme la protéine de transfert d’ester de cholestérol.

Il peut également être appliqué à d’autres protéines telles que l’anticorps IgG, les lipoprotéines de haute densité et le protéasome, dont la taille varie considérablement. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de lavage et de coloration sont difficiles à apprendre en raison de la variation du temps et même le transfert d’échantillon peut provoquer des effets dramatiques dans la protéine colorée finie. Lors de la préparation de ce protocole, il est nécessaire de préparer une solution d’urinoir à 1 % en accordant la plus grande attention à minimiser son exposition à la lumière.

Cela inclut l’emballage des pièces du filtre N de 0,2 micron de la seringue dans du papier d’aluminium lorsqu’il est temps de filtrer la solution pour la première fois. Après le filtrage, conservez les aliquotes de flacons enveloppées d’une feuille d’aluminium de deux millilitres à moins 80 degrés Celsius le jour de l’expérience. Décongelez une aliquote dans un bain-marie à température ambiante une fois complètement décongelée.

Filtrez-le à nouveau à travers un filtre de 0,02 micron avec des pièces enveloppées dans du papier d’aluminium. Le flacon de collecte doit également être emballé dans du papier d’aluminium. Transférez la tache négative dans une glacière jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.

Faites une feuille de support de gouttelettes en appuyant sur une longueur de paramètre de huit pouces sur un support de pointe de pipette. Cela crée des indentations de route qui servent de puits de cinq millimètres de diamètre. Après avoir fait six rangées de puits, aplatissez la glace à la surface d’un plateau en polystyrène, puis positionnez la feuille sur la glace.

Ensuite, ajoutez 35 microlitres d’eau DI dans les trois premiers puits de la feuille sur le côté gauche. Chargez ensuite les trois puits droits dans la feuille avec 35 microlitres de la solution de coloration négative préparée. Couvrez le plateau pour minimiser l’exposition à la lumière de la solution.

Celui-ci servira de station de coloration. Préparez maintenant une station d’incubation à grille EM à partir d’une boîte de pointes de pipette vide avec un accessoire sur lequel une pince à épiler peut être montée. Remplissez la boîte à moitié avec de la glace de sorte que la surface de la glace soit proche de la pointe de la pince à épiler lorsqu’elle est montée.

Première lueur déchargez les fines grilles EM en cuivre de 300 mailles recouvertes de carbone pendant environ 10 secondes. Ensuite, prenez une grille avec une pince à épiler qui s’accroche à la station d’incubation de la grille EM. Accrochez la pince à épiler avec la grille, de sorte que la grille soit inclinée à 45 degrés à un demi-pouce au-dessus de la glace.

Diluez maintenant l’échantillon de protéines dans DPBS à 50 à 100 microgrammes de protéines par millilitre de solution. Appliquez immédiatement environ quatre microlitres de dilution sur la grille EM. Laissez l’échantillon incuber pendant environ une minute.

Au bout d’une minute, tamponnez rapidement le maillage avec du papier filtre pour éliminer l’excès de solution. Et puis à la station de coloration, touchez la maille à la première goutte d’eau sur le film para. Répétez rapidement le processus de séchage du filtre et de rouissage avec la gouttelette suivante.

Utilisez un total de trois gouttelettes d’eau et faites-le le plus rapidement possible. Le lavage de la grille à l’eau doit être effectué rapidement pour éviter les effets néfastes du changement de tampon sur la protéine. Après avoir tamponné le dernier lavage dans les trois secondes, commencez à faire flotter la grille sur la première goutte de solution de coloration négative.

Laissez-le flotter là pendant 10 secondes. Pendant ce temps, nettoyez la pince à épiler en enfonçant les pointes dans du papier filtre. Quelques fois après les dix secondes de flotteur, épongez la solution avec du papier filtre et commencez un autre flotteur dans la prochaine gouttelette de tache pendant deux secondes.

Nettoyez la pince à épiler pendant les deux secondes. Ensuite, épongez la grille et placez-la sur la troisième gouttelette. Pendant une minute complète, couvrez la station de coloration pendant cette étape.

L’élimination de la tache doit se faire en touchant l’arrière de la grille EM pendant une durée précise pour s’assurer que la grille est uniformément séchée. Si le papier filtre touche la tache trop longtemps, une trop grande quantité de tache pourrait être éliminée, ce qui entraînerait une mauvaise imagerie. Ensuite, procédez au séchage de la grille.

Tout d’abord, touchez tout le côté non carbone sur le papier filtre jusqu’à ce que la solution se transfère. Deuxièmement, appliquez un léger jet d’azote gazeux. Transférez maintenant la grille dans un plat recouvert de papier filtre et couvrez partiellement le plat.

Laissez la grille sécher dans le plat pendant 30 minutes à température ambiante. Alternativement, les échantillons contenant des lipides peuvent être cuits à 40 degrés Celsius pendant une heure. Une fois complètement séchée, transférez la grille EM dans une boîte de stockage de grille EM avant de commencer, alignez la TEM.

Vérifiez la résolution de l’anneau de dégel visible le plus élevé avec le spectre de puissance d’une zone de film de carbone de la grille colorée négativement, qui devrait être meilleure que la résolution ciblée. Ensuite, pour ajuster l’alignement, vérifiez soigneusement le spectre de puissance sur la surface du film de carbone de l’échantillon. Dans des conditions correctement alignées, plus de 20 anneaux T tho peuvent être visualisés, ce qui correspond à une visualisation meilleure que cinq angströms.

Les anneaux ont été réalisés par transfert plus poussé d’une image carbone amorphe sous une défocalisation de 1,6 micron et une dose de 20,4 électrons par carré. Angström. Ramenez maintenant la mise au point à une condition de mise au point proche de Scherzer d’environ 0,1 micromètre pour l’imagerie de petites protéines lors de l’examen de la grille EM. Idéalement, les zones tachées sont généralement près du bord des zones nuageuses tachées plus épaisses à faible grossissement.

La structure d’échantillons de lipoprotéines a été observée avec OPNS. Il s’agit par exemple du HDL recombinant, du plasma humain, du LDL, du LDI plasmatique humain et du VLDL plasmatique humain. Des structures plus petites comme 53 kilodalton, CETP ont également été observées.

Il s’agit de l’une des plus petites protéines imagées avec succès par eem. La super-imposition de la structure cristalline CETP correspond très bien à l’image, très dynamique. Des protéines hétérogènes ont également été observées dans des anticorps d’immunoglobuline G de 160 kilodaltons.

Trois sous-domaines étaient clairement visibles. Un examen plus approfondi de l’anticorps IgG a été utilisé pour faire une comparaison avec sa structure cristalline. La structure cristalline de l’anticorps IgG one correspond à la vue EM de ces anticorps de nombreuses façons, par exemple dans les positions des domaines et leurs formes.

Parmi les autres molécules observées, citons 28 kilodaltons, l’apolipoprotéine A sans lipides, une croissance EL et les protéasomes. Essentiellement, la méthode OPNS fait progresser considérablement les limites de l’imagerie EM pour les petites structures asymétriques ainsi que les études mécanistes associées lors de la tentative de la procédure. Il est important de réduire autant que possible l’exposition à la lumière du réactif de coloration pour laver rapidement l’échantillon et l’utiliser près du foyer du trésor pour l’imagerie Après cette procédure.

D’autres méthodes comme la tomographie électronique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les structures de résolution nanométrique des molécules uniques et les changements de confirmation entre elles. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale pour explorer les aimants d’un transfert d’esters de cluster parmi les lipoprotéines plasmatiques humaines.