Name: Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez l'enregistrement patch clamp whole-cell pour étudier les cellules ciliées externes chez le rat postnatal. Cette méthode électrophysiologique permet d'évaluer la fonction individuelle des cellules cochléaires pendant le développement auditif.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du programme 973 (2014CB943002) et la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (11534013, 31500841).

Tous les protocoles expérimentaux avec des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale du Sud.
1. préparer des Solutions pour des expériences
<ol><li>Préparer l’anesthésique (voir Table des matières) : 1,5 % pentobarbital sodique dissous dans ddH2O.</li>
	<li>Préparer la solution de dissection (voir Table des matières) : dissoudre un sachet de poudre de L-15 de Leiboviz dans 1 L de ddH2O. ajuster le pH à 7,3 avec 1 NaOH M. Ajuster l’osmolarité à 300-330 mOsm en utilisant un osmomètre et 10 mM HEPES avant utilisation.</li>
	<li>Dissoudre 2 mg/mL collagénase IV (voir Table des matières) dans une solution de dissection préparée à l’étape 1.2.</li>
	<li>Préparer les solutions d’immunomarquage (voir Table des matières) : dissoudre la paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée.</li>
	<li>Diluer l’agent de perméabilité de 0,3 % dans du PBS. Diluer le sérum de chèvre normal de 10 % dans du PBS comme le tampon de blocage. Diluer au 1 : 200 prestin anticorps dans un tampon bloquant. Diluer l’anticorps conjugué Alexa488 de 1:600 dans un tampon bloquant. Diluer la phalloïdine-tétraméthylrhodamine B isothiocyanate 1 : 200 en PBS.</li>
	<li>Préparer la solution extracellulaire (voir Table des matières) : préparer le milieu de L-15 de la Leiboviz comme décrit ci-dessus (étape 1.2).</li>
	<li>Préparer la solution intracellulaire (voir Table des matières).</li>
</ol>2. ABR enregistrement
NOTE : Enregistrement ABR a été précédemment décrit en détail dans notre précédente étude9.
<ol><li>Anesthésier des rats Sprague Dawley (SD) (1 à 14 jours de vieux petits et adultes 2 - mois vieux, les deux sexes) avec une seule injection de 1,5 % sodium pentobarbital (22 mg/kg pour les petits et 30 mg/kg pour les adultes, intrapéritonéales (i.p.)).</li>
	<li>Placez l’animal anesthésié dans un moule de mousse polyéthylène pour immobiliser le corps de l’animal. Placer l’animal dans une table anti-vibration dans une chambre forte atténuation sonore. Maintenir la température de corps de l’animal à 37,5 ° C, avec un coussin chauffant.</li>
	<li>Essuyer la zone tête d’éthanol à 70 % (vol/vol). En utilisant des ciseaux, faire une incision de 1 à 2 mm ventro à l’externe pinna pour placer l’électrode de référence ou le sol. Une électrode à aiguille hypodermique (électrode d’enregistrement) est située sur le sommet du crâne (Figure 1 a).</li>
	<li>En utilisant le générateur de fonctions, générer des rafales de ton calibré (montée/descente de 1 ms, 3 ms plateau) de diverses fréquences (2, 4, 8, 16, 24 et 32 kHz) et les intensités (a diminué de 85 à 10 dB SPL à l’étape 5 dB). Varier la fréquence et l’amplitude manuellement ou à l’aide d’un ordinateur. Livrer des stimuli sonores grâce à un haut-parleur électrostatique situé 10 cm loin vers la tête de l’animal.</li>
	<li>Filtre (100-1 000 Hz), amplifier et moyenne (256 fois) le potentiel sonore ont incité, en utilisant un processeur multi-function pour obtenir l’abr. Les traces de l’ABR est contrôlé en ligne et stockées pour l’analyse hors ligne. Il faut environ 40 min, pour compléter l’ABR enregistrement à partir d’un animal. Remarque : En général, trois à sept sommets (j’ai vague à vague VII) avec des latences inférieures à 15 ms peut être identifié (Figure 1 b). Le seuil ABR est défini comme le niveau sonore minimal à laquelle vague I et II pourrait être détecté.</li>
	<li>Euthanasier avant les animaux éveillés de l’anesthésie (avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium 0,3 mL 1,5 %).</li>
</ol>3. la Dissection de l’organe de Corti (OC)
<ol><li>Anesthésier les ratons. Chez les rats âgés de moins de 6 jours (< P6), garder l’animal dans une boîte de Petri de 100 mm et couvrir le plat avec de la glace pendant 10 min. Pour les rats > P6, anesthésier l’animal avec une seule injection de 1,5 % le pentobarbital de sodium (22 mg/kg, i.p.). Décapiter les ratons après l’anesthésie.</li>
	<li>Stérilisez la tête par pulvérisation d’éthanol à 70 % (vol/vol).</li>
	<li>Ouvrir le crâne, le long de la ligne sagittale médiane avec des ciseaux ; enlever le cerveau afin d’exposer l’oreille interne.</li>
	<li>Transférer l’oreille interne dans une boite de Petri 35 mm contenant 3 mL de L-15 glacée (Figure 2 a).</li>
	<li>Sous le microscope à dissection, utiliser une pince fine pour retirer la capsule osseuse de la cochlée (Figure 2 b).</li>
	<li>Déballer l’OC et associés strie vasculaire (SV) du modiolus.</li>
	<li>En tenant la partie basale de la SV avec une pince, séparer l’OC de la SV complètement en déroulant lentement de base à l’apex (Figure 2).</li>
	<li>Couper l’OC uniformément en trois morceaux à l’aide des ciseaux fins (Figure 2D).</li>
</ol>4. immunofluorescence souillant
<ol><li>À l’aide d’une pointe de pipette 200 µL, transférer les segments d’OC (étape 3,8) sur une lame de verre et fixer avec 100 µL de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 4 h à 4 ° C. ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée.</li>
	<li>Laver le tissu en déplaçant la paraformaldéhyde avec 100 µL de PBS frais. Laver le tissu trois fois pendant 10 min.</li>
	<li>Incuber le tissu avec agent de perméabilité de 0,3 % dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Jeter l’agent de perméabilité dans du PBS et laver le tissu trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Bloc avec 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Incubez avec anticorps anti-prestin-C-terminale (1 : 200) en bloquant la solution pendant 2 h à température ambiante ou à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Incuber les anticorps secondaire conjugué Alexa488 (1:600) dans la solution de saturation pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min dans le noir.</li>
	<li>Incubez avec rhodamine-phalloïdine (1 : 200) pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min dans le noir.</li>
	<li>Monter sur une lame de verre avec support de montage (contenant le DAPI). Image par microscopie confocale à l’aide de 405 nm, 488 nm et 594 nm lasers. La valeur de la puissance du laser à 0,1 à 0,5 mW et le scan vitesses à 0,5 frame/s.</li>
</ol>5. Patch clamp enregistrement des contaminants organohalogénés isolé
<ol><li>Utiliser l’extracteur de pipette et micro-faussaire faire patch pipettes avec un diamètre de pointe, 2 à 3 µm. remblayer les pipettes avec solution intracellulaire. Habituellement, la résistance initiale de pipette de patch a été MΩ de 2,5 à 3,5 dans une solution de bain.</li>
	<li>À l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL, transférer un morceau de l’OC (de l’étape 3,8) dans une boîte de Pétri de 35 mm. Digérer le tissu avec 100 µL de milieu de digestion enzymatique (collagénase IV, voir Table des matières) pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Déplacer le milieu de digestion enzymatique avec 100 µL de L-15. Couper le tissu en petits morceaux à l’aide d’un scalpel micro pour isoler les cellules ciliées.</li>
	<li>Après pipetage douce, transférer les cellules dans une petite chambre en plastique fait maison (diamètre ~ 1,5 cm) rempli de solution bain sans enzymes (~ 1,5 mL, voir Table des matières).</li>
	<li>Placez la chambre sur la scène d’un microscope inversé. Trouver les contaminants organohalogénés solitaires apparemment en bonne santé.</li>
	<li>Charger la pipette dans la scène en tête d’un amplificateur de 700 b. Déplacer la pipette avec soin par un micromanipulateur et positionnez-le autour du fond de la cellules ciliées externes (Figure 3 a).</li>
	<li>Cellule entière patch clamp de la CPO en scellant la paroi latérale du corps cellulaire. Applique lumière d’aspiration jusqu'à ce que la membrane cellulaire est rompue. Définir l’exploitation potentielle à -70 mV. Avec accès résistance varie entre 10 et 17 MΩ et la résistance de la membrane des cellules allant de 100 à 500 MΩ et sont considérés comme une configuration réussie de la cellule entière.</li>
	<li>À l’aide de la commande par ordinateur, appliquer hyperpolarisant et dépolarisantes tension (durée de 250 ms et allant de −140 à + 94 mV en 13 étapes mV) à la cellule pour susciter des courants de cellules entières.</li>
	<li>Amplifier les courants de la cellule entière, filtrer (fréquence de coupure de 5 kHz) par un amplificateur de 700 b. Convertir les données par un convertisseur de 1440A et le magasin pour l’analyse hors ligne.</li>
	<li>Mesurer la capacité de la membrane des contaminants organohalogénés en utilisant un protocole de stimulation de tension deux sinusoïdale contrôlé par un logiciel de patch clamp. Régler la gamme de tension de stimuler de -140 à 110 mV. Stocker les données pour l’analyse hors ligne.</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Chez les rats âgés de moins de jour 11, n’on observe aucun potentiel d’action en réponse à une stimulation sonore au cortex auditif6,7. C’est pourquoi, jour après la naissance 11 est décrit comme « début de l’audience »10. Le développement d’une fonction d’audition avant le début de l’audience n’était pas bien étudié encore. En utilisant la méthode semblable pour l’enregistrement de ABR adulte, nous démontrons que ABRs pouvaient être provo...

Deux fonctions distinctes de cellules de cheveux sensoriels cochléaires sont essentielles pour l’audience chez les mammifères : mechanoelectric transduction (MET) et electromotility1,2. Par MET les canaux situés dans le faisceau de cheveux, CSI (CSI) et contaminants organohalogénés convertir les vibrations sonores des changements potentiels de membrane, ainsi que les signaux électriques des neurones du ganglion spiral innervés. Contaminants organohalogénés changent leur longueur avec le potentiel de membrane des cellules et amplifient la vibration du son à basse altitude. Cette activité appelée electromotility est dérivée de la protéine motrice prestin situé dans la paroi latérale des contaminants organohalogénés3.
Chez de nombreuses espèces, y compris les rongeurs, la fonction auditive est immature à l’époque postnatale précoce4,5. Aucun potentiel d’action en réponse aux signaux sonores ne pourraient être détectée dans le cortex auditif avant l’audience début6,7. Développement de la morphologie et le fonctionnement de la cochlée a été largement étudiées en souris, gerbille et rat4,5,8. La mécanotransduction et electromotility des cellules ciliées sont également développées dans la première époque de vie5.
Afin d’évaluer la sensibilité auditive des rats à différents âges postnatals, nous avons développé une méthode de réaction auditif du tronc cérébral (PEATC) enregistrement chez les ratons. Cellule entière patch clamp d’est une technologie idéale pour enquêter sur les contaminants organohalogénés électrophysiologique. Toutefois, le faible taux de cellules entières d’étanchéité en comparaison avec le patch clamp de jouée dans les neurones et autres cellules épithéliales, limité l’enquête d’electromotility des contaminants organohalogénés isolés.
Ici, nous décrivons une procédure pour enquêter sur les contaminants organohalogénés morphologiquement et électrophysiologique dans la cochlée aiguë dissociée des rats postnatals. Cette méthode peut être modifiée afin d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent la fonction et le développement des cellules ciliées internes.

<table><tbody><tr><td>Anesthésique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>1,5 % dans l’eau</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Dissection solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz’s L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 paquet dans 1 L d’eau</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>2 mg/mL dans L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nom</td><td>><Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Immunostaining solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PH 7.3</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4 % dans PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0.3 % dans PBS</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10000C</td><td>10 % dans PBS</td></tr><tr><td>Anticorps anti-prestine</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-anticorps conjugué</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Phalloidin-Tétraméthylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>Name</td><td> Entreprise </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Solution extracellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz’s L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 paquet dans 1 L d’eau</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Intracellular solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>7647-17-8</td><td>140 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>67-42-5</td><td>10 millions d’euros</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM<</td></tr><tr><td>strong>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 basic</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Forcep WPI</td><td>14095</td><td>Pince à épiler dumont</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instrument</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mini Operating System</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données à faible bruit</td><td>Axon</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 haut-parleur</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT system 3</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP software</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel BioSigRP</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD rat</td><td>Experimental Animal Center de l’Université</td><td></td><td></td> de médecine du Sud</tr></tbody></table>

réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes whole-cell patch clamp enregistrement chez le rat postnatal

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Les cellules ciliées externes est l’un des deux types de sensorielle des cellules ciliées de la cochlée mammifères. Ils modifient leur longueur des cellules avec le récepteur potentiel pour amplifier la vibration faible du signal sonore à basse altitude. La morphologie et la propriété électrophysiologique des cellules ciliées externes (contaminants organohalogénés) se développent dans l’âge postnatal précoce. La maturation des cellules ciliées externes peut-être contribuer au développement du système auditif. Toutefois, le processus de développement de contaminants organohalogénés n’est pas bien étudié. C’est en partie à cause de la difficulté à mesurer leur fonction par une approche électrophysiologique. Dans le but de développer une méthode simple pour résoudre le problème ci-dessus, nous décrivons ici un protocole étape par étape pour étudier la fonction des contaminants organohalogénés cochlée aiguë dissociés des rats postnatals. Avec cette méthode, nous pouvons évaluer la cochléaire réponse à des stimuli de sons purs et examiner le niveau d’expression et la fonction de la protéine motrice de prestin en contaminants organohalogénés. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier les cellules ciliées internes (CSI).

ABR peut être déclenché de rat anesthésié petits plus vieux que le jour après la naissance 7 (P7) à l’aide de salves de sons purs (Figure 1 a). Comme le montre la Figure 1 b, les formes d’onde ABR provenant de ratons ont montré seulement trois ou quatre de vagues distinctes avec petite amplitude. Habituellement, jusqu'à sept sommets ont été observées dans les formes d’onde ABR des animaux adultes (Figure 1 b<...

Ce protocole décrit les méthodes pour enregistrer la réponse auditif du tronc cérébral de ratons postnatal. Pour examiner le développement fonctionnel des cellules ciliées externes, la procédure expérimentale de cellules entières patch clamp d’enregistrement en isolé les cellules ciliées externes est décrit étape par étape.

Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

L’objectif général de ce test électrophysiologique est d’étudier les changements morphologiques et fonctionnels des cellules ciliées cochléaires au cours du développement postnatal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du département d’assistant audical, telles que : quand nos cellules ciliées acquièrent-elles leurs fonctions lors du début de l’audition ? Le principal avantage de cette technique est que nous sommes en mesure d’évaluer la fonction de cellules ciliées individuelles, isolées à partir de petits rats postnatals.Wenlu Pan, Shasha Guo et Nana Xu, des étudiants de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, placez l’animal anesthésié dans un moule en mousse de polyéthylène pour immobiliser le corps de l’animal. Ensuite, placez l’animal sur une table anti-vibration dans une pièce insonorisante.Maintenez la température corporelle de l’animal à 37,5 degrés Celsius à l’aide d’un coussin chauffant. Ensuite, essuyez la zone de la tête avec de l’éthanol à 70 %. Faites une incision d’un à deux millimètres ventralement-latéralement au pavillon externe pour placer l’électrode de référence ou l’électr

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Whole-cell patch-clamp enregistrements de dendrites auditives fibres nerveuses au niveau des synapses du ruban des cellules ciliées internes de la cochlée de mammifère.

Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

Une méthode fiable pour enquêter sur des cellules ciliées externes (CCE) des réponses mobiles, y compris électromotilité, la motilité lente et à la flexion, est décrite. Motilité OHC est provoqué par la stimulation par un champ électrique externe en alternance, et la méthode tire parti de l'enregistrement d'images à haute vitesse, un éclairage à base de LED, et la dernière génération de logiciels d'analyse d'image.

Enquêter Outer motilité cellulaire cheveux avec une combinaison de stimulation externe champ électrique alternatif et analyse d&#39;images à haute vitesse

Le but de cette vidéo est de montrer les procédures d'obtention de cellules saines intactes cheveux des organes de l'oreille interne du poisson zèbre adulte, puis de les utiliser pour les études de patch-clamp visant à caractériser les propriétés biophysiques de leurs canaux voltage-dépendants.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Cette vidéo présente une méthode d’enregistrement des réponses auditives du tronc cérébral (ABR) des ratons. Il décrit les étapes de placement des électrodes, d’application de stimulus sonores et d’analyse du traitement du signal dans le tronc cérébral pour évaluer les réponses neuronales.

Enregistrement des réponses auditives du tronc cérébral chez un petit rat

Cette vidéo montre la procédure d’implantation d’un dispositif cochléaire dans une souris sourde et d’application de stimuli électriques pour enregistrer les réponses auditives du tronc cérébral. Cette procédure permet de comprendre les mécanismes de base de l’audition électrique et peut contribuer aux progrès de la technologie des implants cochléaires et des neurosciences auditives.

Enregistrement des réponses auditives du tronc cérébral évoquées électriquement chez une souris sourde

Cette vidéo présente la technique du patch-clamp pour mesurer les courants ioniques dans les corps cellulaires sensoriels des neurones de l’oreille interne. Il détaille la préparation et l’utilisation d’une pipette polie remplie d’une solution interne contenant de l’amphotéricine B, qui perfore la membrane pour permettre le mouvement des ions tout en préservant les conditions intracellulaires. Des impulsions de tension sont appliquées pour déclencher et enregistrer l’activité des canaux...

Enregistrements perforés de corps cellulaires sensoriels de neurones sensoriels de l’oreille interne

Cette vidéo démontre l'examen de l'excitabilité sensorielle des neurones dans les ganglions de la racine dorsale à l'aide de la technique du patch clamp pour mesurer la rhéobase et le potentiel membranaire, en analysant les réponses des neurones aux injections de courant incrémentielles.

Enregistrements de patch-clamp de cellules entières sur des ganglions radiculaires dorsaux de rat intacts

Ce manuscrit décrit comment préparer des ganglions de la racine dorsale intacts pour les enregistrements par patch clamp. Cette préparation maintient le microenvironnement des neurones et des cellules gliales satellites, évitant ainsi les changements phénotypiques et fonctionnels observés à l’aide de neurones DRG dissociés.

Patch Clamp Recordings sur Intact ganglions rachidiens de rats adultes

Nous présentons une technique pour l’administration déconcentrée de drogues par voie trans-tympanique dans la cochlée. Administration de médicaments par le biais de cette route ne serait pas interférer avec l’efficacité de la lutte contre le cancer des médicaments chimiothérapeutiques comme le cisplatine.

TRANS-tympanique de médicaments pour le traitement de l’ototoxicité

L'audiométrie de réponse évoquée de tronc cérébral est un outil important dans la neurophysiologie clinique. De nos jours, l'audiométrie de réponse évoquée par le tronc cérébral est également appliquée dans la science fondamentale et les études précliniques impliquant des modèles d'animaux pharmacologiques et génétiques. Ici, nous fournissons une description détaillée de la façon dont les réponses auditives du tronc cérébral peuvent être enregistrées et analysées avec succès chez les souris.

Acquisition de données et analyse dans brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Les méthodes présentées ici fournissent des instructions détaillées pour la dissection, la dissociation, la culture et l’enregistrement patch-clamp à partir de neurones ganglionnaires vestibulaires et ganglionnaires spiralés de l’oreille interne.

Isolement et culture de somates ganglionnaires vestibulaires et spiralés de rongeurs nouveau-nés pour les enregistrements Patch-Clamp

Découvrez l'enregistrement patch clamp whole-cell pour étudier les cellules ciliées externes chez le rat postnatal. Cette méthode électrophysiologique permet d'évaluer la fonction individuelle des cellules cochléaires pendant le développement auditif.

Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

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