Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

Ce protocole décrit les méthodes pour enregistrer la réponse auditif du tronc cérébral de ratons postnatal. Pour examiner le développement fonctionnel des cellules ciliées externes, la procédure expérimentale de cellules entières patch clamp d’enregistrement en isolé les cellules ciliées externes est décrit étape par étape.

L’objectif général de ce test électrophysiologique est d’étudier les changements morphologiques et fonctionnels des cellules ciliées cochléaires au cours du développement postnatal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du département d’assistant audical, telles que : quand nos cellules ciliées acquièrent-elles leurs fonctions lors du début de l’audition ? Le principal avantage de cette technique est que nous sommes en mesure d’évaluer la fonction de cellules ciliées individuelles, isolées à partir de petits rats postnatals.

Wenlu Pan, Shasha Guo et Nana Xu, des étudiants de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, placez l’animal anesthésié dans un moule en mousse de polyéthylène pour immobiliser le corps de l’animal. Ensuite, placez l’animal sur une table anti-vibration dans une pièce insonorisante.

Maintenez la température corporelle de l’animal à 37,5 degrés Celsius à l’aide d’un coussin chauffant. Ensuite, essuyez la zone de la tête avec de l’éthanol à 70 %. Faites une incision d’un à deux millimètres ventralement-latéralement au pavillon externe pour placer l’électrode de référence ou l’électrode de terre.

Ensuite, placez une électrode d’enregistrement sous-cutanée sur le sommet du crâne. À l’aide du générateur de fonctions, générez des rafales de tonalités calibrées de différentes fréquences et intensités. Diffusez les stimuli sonores à travers un haut-parleur électrostatique situé à 10 centimètres de la tête de l’animal.

Pour obtenir les réponses auditives du tronc cérébral, les potentiels induits par le son sont filtrés, amplifiés et moyennés à l’aide d’un processeur multifonction. L’enregistrement ABR de 40 minutes est surveillé en ligne et stocké pour une analyse hors ligne. Dans cette section, stérilisez la tête de l’animal en pulvérisant de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, ouvrez le crâne le long de la ligne médiane sagittale avec des ciseaux et retirez le cerveau pour exposer l’oreille interne. Ensuite, transférez l’oreille interne dans une boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de trois millilitres de L-15 Medium de Leibovitz glacé. Sous le microscope de dissection, utilisez des pinces fines pour retirer la capsule osseuse de la cochlée.

Après cela, dépliez OC et SV associés à modiolus. En tenant la partie basale de SV à l’aide d’une pince, séparez complètement l’OC de SV en déroulant lentement de la base à l’apex. Par la suite, coupez uniformément l’OC en trois morceaux à l’aide de ciseaux fins.

Toutes les étapes doivent être effectuées dans du L-15 glacé aussi rapidement que possible afin de minimiser la dégradation et la détérioration des tissus. Dans cette étape, à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, transférez les segments de CO sur une lame de verre. Fixez-les avec 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins quatre heures à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez le tissu en déplaçant le paraformaldéhyde avec 100 microlitres de PBS frais. Ensuite, lavez le mouchoir trois fois pendant 10 minutes à chaque fois. Ensuite, incubez le tissu avec un agent de perméabilité à 0,3 % dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante.

Après 30 minutes, jetez l’agent de perméabilité et lavez le mouchoir trois fois avec du PBS. Par la suite, bloquez le tissu avec 10 % de sérum de chèvre normal et PBS pendant une heure à température ambiante. Incuber le tissu avec l’anticorps anti-prestine C et la solution bloquante pendant deux heures à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Ensuite, lavez le mouchoir trois fois avec du PBS pendant cinq minutes à chaque fois. Ensuite, incubez le tissu avec l’anticorps secondaire conjugué à Alexa 488 dans une solution bloquante pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Lavez le mouchoir trois fois avec du PBS pendant cinq minutes, à chaque fois dans l’obscurité.

Ensuite, incubez le tissu avec de la rhodamine phalloïdine pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Lavez le mouchoir trois fois avec du PBS pendant cinq minutes dans l’obscurité. Ensuite, montez l’échantillon sur une lame de verre avec un support de montage.

Imagez-le avec la microscopie confocale à l’aide de lasers de 405 nanomètres, 488 nanomètres et 594 nanomètres. Dans cette procédure, utilisez l’extracteur de pipette et le microforgeur. Fabriquez des pipettes patch avec un diamètre de pointe de deux à trois microns.

Ensuite, remplissez les pipettes avec une solution intracellulaire. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, transférez un morceau de CO dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Digérez le tissu avec 100 microlitres de milieu de digestion enzymatique pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, remplacez le milieu de digestion enzymatique par 100 microlitres de L-15. Coupez le tissu en petits morceaux à l’aide d’un microscalpel pour isoler les cellules ciliées. Après un pipetage doux, transférez les cellules dans une petite chambre en plastique faite maison remplie d’une solution de bain sans enzyme.

Ensuite, placez la chambre sur la platine d’un microscope inversé et trouvez les OHC solitaires d’apparence saine. Ensuite, chargez la pipette patch dans l’étage de tête d’un amplificateur 700B. Positionnez la pipette patch autour du bas de la cellule ciliée externe.

Ensuite, le patch de cellule entière clampe l’OHC en scellant la paroi latérale du corps cellulaire. Appliquez une légère aspiration jusqu’à ce que la membrane cellulaire se rompe. Ensuite, réglez le potentiel de maintien à 70 millivolts.

Les cellules avec une résistance d’accès allant de 10 à 17 mégaohms et une résistance membranaire allant de 100 à 500 mégaohms sont considérées comme une configuration de cellule entière réussie. Appliquez une tension hyperpolarisante et dépolarisante à la cellule pour provoquer des courants de cellule entière. Mesurez la capacité membranaire des OHC à l’aide d’un protocole de stimulus de tension à deux ondes sinusoïdales contrôlé par le logiciel de patch clamp.

Réglez la plage de tension de stimulation de 140 à 110 millivolts et stockez les données pour une analyse hors ligne. Après une digestion douce, les OHC ont été isolés du CO. Des enregistrements de pinces de tension de cellules entières ont été réalisés à partir de CCO isolés de manière aiguë de la cochlée du rat. Un exemple représentatif du courant de la cellule entière enregistré à partir d’un OHC P9 isolé en réponse à un potentiel de membrane modifié de 140 à 107 millivolts est présenté ici.

Cette figure montre la capacité membranaire non linéaire obtenue à partir de deux OHC à des âges différents. Les réponses de tension de capacité ont été ajustées à la fonction de Boltzmann. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures, si elle est exécutée de manière appropriée.

À la suite de cette procédure, d’autres mesures telles que le Western blot et la PCR peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’évaluation du niveau d’expression de certaines protéines, telles que la prestine dans nos cellules ciliées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des cellules ciliées pour explorer les propriétés électrophysiologiques de la cochlée et du système vestibulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier les changements morphologiques et fonctionnels des cellules ciliées cochléaires au cours du développement postnatal.