Patch Clamp Recordings sur Intact ganglions rachidiens de rats adultes

L’objectif global de cette expérience est d’introduire des méthodes pour préparer les ganglions de la racine dorsale intacts et d’effectuer un enregistrement par patch clamp à l’aide de cette préparation. Cette méthode permet l’enregistrement d’une cellule unique à partir des ganglions intacts de la racine dorsale tout en stimulant le nerf rachidien entrant ou la racine dorsale sortante. Cette approche est particulièrement utile lorsqu’il s’agit d’étudier la contribution des neurones sensoriels primaires à la douleur.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle maintient à la fois les neurones et les cellules gliales satellites adjacentes. Par conséquent, cette préparation est plus proche de la situation in vivo. Dans cette procédure, après que le rat a été anesthésié, rasez sa région lombaire.

Ensuite, incisez la peau et le tissu sous-cutané le long de la ligne médiane. Ensuite, détachez les muscles périspinaux des apophyses épineuses au niveau L1 à S2 à l’aide d’un élévateur périosté fin. Ensuite, coupez les apophyses épineuses de L1 à S2. Par la suite, faites deux coupes transversales dans la colonne vertébrale exposée à environ L1 et S1 et retirez ce segment de la colonne vertébrale en bloc.

Ensuite, immergez-le rapidement dans de l’aCSF froid pendant deux à trois minutes. Après cela, rincez le sang de la colonne vertébrale retirée et transférez la colonne vertébrale dans une boîte de Pétri avec de l’aCSF froid, puis utilisez un rongeur fin pour retirer les lames. Coupez la dure-mère le long de la ligne médiane avec des microciseaux pour exposer la moelle épinière.

Ensuite, transférez la vertèbre restante avec DRG dans la deuxième boîte de Pétri remplie d’aCSF froid. Identifiez les DRG L4 et L5 en fonction de leur position relative par rapport aux apophyses transverses et au nerf sciatique. Ensuite, libérez le DRG des tissus conjonctifs environnants et gardez la racine nerveuse et le nerf spinal attachés au DRG.

Après cela, transférez le DRG dans la troisième boîte de Pétri pour une dissection plus approfondie. Découpez une ouverture où les racines dorsale et ventrale rejoignent le DRG et séparez la racine ventrale de celui-ci. Ensuite, utilisez des pinces à pointes émoussées pour tenir l’épineurium et utilisez une autre pince fine pour faire rouler le DRG de l’épineurium.

Continuez à retirer autant d’épineurium que possible qui est attaché au DRG. Maintenant, transférez le DRG dans la chambre d’enregistrement. Assurez-vous que le côté du DRG d’où proviennent les racines nerveuses est orienté vers le bas.

Ensuite, stabilisez le DRG avec une ancre. Ensuite, perfuser le DRG avec de l’aCSF oxygéné à travers les tubes en plastique reliés par une pompe péristaltique et laisser les cellules récupérer pendant 30 minutes. Après 30 minutes, évaluez la qualité DRG sous l’optique IR-DIC à un grossissement de 40x à l’aide d’une caméra CCD.

Deux seringues d’un millilitre ont été connectées individuellement aux porte-pipettes à l’aide de deux morceaux de tube en caoutchouc de petit diamètre. Ensuite, placez une pipette en verre remplie de collagénase dans l’un des porte-pipettes et une pipette en verre vide dans l’autre. Ensuite, à l’aide du micromanipulateur, positionnez les pipettes juste au-dessus du DRG.

Faites entrer en collision les pointes de deux pipettes l’une contre l’autre doucement pour agrandir les ouvertures des pointes de pipette. Après cela, déplacez la pipette remplie de collagénase près de la surface DRG. Appliquez brièvement une pression positive sur la pipette contenant de la collagénase à travers le tube reliant le support et la seringue en déplaçant le piston d’environ 0,5 millilitre.

Après 10 à 15 minutes, lorsque les débris de l’épineurium restant sont observés, appliquez une légère pression négative sur la pipette vide pour aspirer les débris. De cette façon, les neurones et les cellules gliales satellites environnantes seront clairement exposés et prêts pour l’enregistrement de patchs. Dans cette procédure, placez la solution d’électrode sur de la glace pour éviter la dégradation.

Ensuite, remplissez la pipette patch en verre avec une solution intracellulaire filtrée. Ensuite, placez la pipette dans le porte-pipette de la tête. Appliquez une légère pression positive sur la pipette à l’aide d’une seringue de cinq millilitres en déplaçant le piston d’environ un millilitre avant d’abaisser la pipette dans la solution du bain.

Ensuite, choisissez le mode V-Clamp sur l’amplificateur et ouvrez l’interface de test de membrane dans le logiciel. Sous le microscope, rapprochez la pipette du neurone cible. Ensuite, appliquez une pression positive à partir de la pipette pour traverser la couche de cellules gliales satellites jusqu’à ce qu’un élargissement soudain de l’espace entre le neurone et la couche environnante de cellules gliales satellites soit observé.

Ensuite, continuez à déplacer la pipette vers le neurone jusqu’à ce qu’une fossette soit observée sur le neurone. Dans notre préparation, les neurones sont entourés de cellules gliales satellites. Par conséquent, pour pénétrer dans les couches de cellules gliales et atteindre les neurones individuels, la pipette d’enregistrement est maintenue à une pression positive élevée.

Après cela, réduisez la pression positive. Obtenez une étanchéité giga-ohm avec une aspiration douce. Pour obtenir une configuration d’enregistrement cellulaire complète, pénétrez la membrane cellulaire du neurone via une aspiration courte mais forte.

Vous pouvez également utiliser la fonction zap de l’amplificateur pendant que l’aspiration est appliquée. Une fois qu’un mode de cellule entière est établi, compensez la capacité de la cellule entière et la résistance série en tournant les boutons de compensation de capacité et de résistance de l’amplificateur. Ensuite, fermez la fenêtre de test de membrane.

Choisissez le mode normal I-Clamp en tournant le bouton de mode de l’amplificateur. Ensuite, cliquez sur Ouvrir le protocole dans le logiciel. Sélectionnez et chargez le protocole de mesure de la rhéobase et cliquez sur enregistrer pour démarrer l’enregistrement.

Pour examiner l’excitabilité neuronale, mesurez la résistance d’entrée et la rhéobase en injectant une série graduée de courants dépolarisants par pas de 100 picoampères. Ensuite, cliquez à nouveau sur Ouvrir le protocole et sélectionnez le protocole de mesure du seuil de membrane. Par la suite, injectez un courant de rampe dépolarisant de 500 millisecondes dans le neurone.

Pour enregistrer les courants induits par les ligands, remplissez une pipette avec des agonistes spécifiques. Vérifiez la pipette pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur. Ensuite, placez la pipette dans le support de pipette qui est relié à un système de distribution de médicaments.

Utilisez le manipulateur pour déplacer la pipette à moins de 15 micromètres du neurone. Réglez la pression du système de distribution de médicament sur un PSI et la durée sur une seconde. Ensuite, basculez le mode d’enregistrement sur la pince de tension à 70 millivolts.

Appliquez brièvement une pression via le système de distribution du médicament pour enregistrer un courant induit par le médicament. Dans cette figure, la rhéobase a été mesurée en injectant une série de courants dans le neurone DRG. L’intensité de courant la plus faible qui peut induire un potentiel d’action est définie comme rhéobase, comme indiqué par la flèche.

La rhéobase de ce neurone est de 300 picoampères. Le seuil de la membrane a été mesuré en injectant un courant de rampe. Le potentiel est défini comme le seuil membranaire lorsqu’un potentiel d’action est évoqué.

Le seuil membranaire de ce neurone est de 11,9 millivolts. Dans cette figure, les courants ont été induits par l’application de glutamate ou d’AITC pendant une seconde. Les deux agonistes ont induit des courants internes, suggérant la présence de récepteurs du glutamate et des récepteurs TRPA-1 sur les petits neurones DRG.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être terminée en une heure si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de retirer l’épineurium et de maintenir la pression élevée de la pipette d’enregistrement. Suite à cette procédure, l’enregistrement par patch clamp sur les cellules gliales satellites peut être effectué afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les récepteurs et les canaux dans les cellules gliales satellites.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la douleur pour étudier la contribution des ganglions de la racine dorsale à la nociception. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer un ganglion de la racine dorsale entier, puis de réparer une pince à partir de cellules uniques sur ces ganglions de la racine dorsale entiers.