Conseguenze a lungo termine del comportamento e riproduttive di embrionale esposizione alle sostanze tossiche della basso-dose

L'obiettivo generale di queste procedure è quello di studiare gli effetti a lungo termine dell'esposizione a basse dosi di BPA nell'embriogenesi precoce. Gli embrioni di C. elegans sono esposti al BPA per un periodo limitato e testati al raggiungimento dell'età adulta per la fecondità e il comportamento di apprendimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti gli effetti a lungo termine sullo sviluppo dell'esposizione a sostanze tossiche come i bisfenoli e altri composti che alterano il sistema endocrino.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di testare gli effetti a lungo termine e sottili delle sostanze tossiche sullo sviluppo attraverso saggi comportamentali quantitativi su un modello di laboratorio di invertebrati facile da usare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla comprensione delle basi dello sviluppo e neurali degli effetti deleteri sulla salute dell'esposizione a sostanze tossiche anche a basse dosi. Abbiamo avuto l'idea di questi esperimenti quando ci siamo resi conto che un certo numero di disturbi complessi o multifattoriali sembravano avere una o l'altra componente dello sviluppo.

Il che può esercitare la sua influenza in parte attraverso l'espressione anomala di geni critici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di assuefazione al tocco interno possono essere difficili da apprendere esclusivamente attraverso istruzioni basate su testo. Il giorno prima della sincronizzazione, trasferire i vermi N2 su piastre da 100 millimetri contenenti terreni NGM, spalmati con E.coli OP50.

Mediante spezzettatura di una lastra di circa un centimetro quadrato. Lascia che i vermi crescano per tre giorni a 20 gradi Celsius. Dopo tre giorni, quando le piastre sono popolate da adulti maturi e ben nutriti contenenti embrioni visibili, iniziare la sincronizzazione lavando prima ogni piastra con cinque millimetri di tampone M9 e trasferendo il liquido in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 millilitri.

Centrifugare a 3.000 volte la gravità per quattro minuti a temperatura ambiente. Dopo la certrifugazione, utilizzare una pipetta da dieci millilitri per rimuovere con cura il surnatante da ogni pellet sciolto di vermi adulti. Quindi aggiungere 5 millilitri di soluzione di ipoclorito appena preparata a ciascun pellet di vermi e mescolare delicatamente.

Centrifugare a 3.000 volte la gravità a temperatura ambiente per quattro minuti. È fondamentale ottenere popolazioni sincronizzate. La preparazione di una nuova soluzione di ipoclorito aiuta a evitare la contaminazione e gli animali non sincronizzati.

Quindi, utilizzare una pipetta da dieci millilitri per rimuovere il surnatante e lavare i sette millilitri di tampone M9. Ripetere questo passaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere circa 100 microlitri di tampone M9 alle uova.

Quindi trasferire circa 50 microlitri di uova in provette da microfuge da due millilitri contenenti BPA diluito in tampone S. Regolare la quantità di tampone S per garantire la corretta concentrazione finale di BPA per provetta, come mostrato nella tabella. Posizionare i tubi su un oscillante o agitatore rotante, muovendosi a 25 inclinazioni al minuto, o 25 giri/min per quattro ore a 20 gradi Celsius.

Dopo quattro ore, posizionare le provette nei portaprovette e lasciare che i vermi si depositino. Scartare il surnatante e trasferire i vermi su piastre NGM seminate con OP50 E.coli. Lascia che i vermi crescano per 60 ore a 20 gradi Celsius.

Esaminare le piastre ogni giorno per verificare la presenza di contaminazioni. Le piastre NGM contaminate sono solitamente scolorite e accompagnate da singole colonie. Controlla i vermi al microscopio per il sovraffollamento.

Innanzitutto, utilizzare un plettro di platino calibro 30 sterilizzato al fuoco per trasferire circa dieci giovani vermi adulti sincronizzati su nuove piastre NGM non seminate. Lasciare i vermi indisturbati per cinque minuti per dare loro il tempo di acclimatarsi al nuovo piatto. Quindi sterilizzare un pelo del sopracciglio attaccato all'estremità di uno spiedino di legno o di uno stuzzicadenti immergendolo in etanolo al 70%.

Pulire con un fazzoletto pulito e privo di lanugine e attendere un minuto affinché l'etanolo evapori. Tocca delicatamente il verme sulla testa usando i peli delle sopracciglia. Ripeti i tocchi, lasciando dieci secondi tra i tocchi per consentire al verme di riprendersi.

Continuare a toccare, attendere intervalli di dieci secondi tra gli interstimoli fino a quando il verme non si muove più all'indietro. Registra il numero di tocchi necessari affinché si verifichi questa assuefazione. Consentire un intervallo di dieci secondi tra i tocchi è importante in quanto ciò consente all'animale di recuperare il tempo e aiuta a ottenere saggi coerenti sul comportamento di assuefazione.

Gli animali adulti che sono stati esposti embrionalmente a un micromolare o a una concentrazione superiore di BPA hanno deposto un numero significativamente inferiore di uova rispetto al controllo rappresentato dalla linea orizzontale. Gli animali adulti derivati da embrioni che sono stati esposti a concentrazioni di BPA fino a 0,1 micromolari mostrano deficit non associativi basati sull'aumento del numero di tocchi anteriori necessari per abituarsi. Durante la preparazione degli embrioni per l'esposizione al BPA, è importante scegliere una piastra con adulti di C. elegans ben nutriti con ovuli maturi visibili al microscopio di dissezione per avere una dimensione del campione sufficiente.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della tossicologia ambientale per valutare gli effetti delle tossine e di altri composti che alterano il sistema endocrino sul comportamento e progettare esperimenti meccanicistici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esporre gli embrioni di C.elegans in fase iniziale al BPA e come testare il comportamento di assuefazione negli adulti risultanti derivati dagli embrioni esposti al BPA.