Name: ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Découvrez l'analyse de liaison ADN-particules magnétiques par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse. Cette méthode permet de caractériser la taille, la polydispersité et le potentiel zêta pour optimiser les interactions biomoléculaires.

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Le soutien financier de la Fondation tchèque pour la Science (projet GA CR 17-12816S) et CEITEC 2020 (LQ1601) est largement reconnu.

1. synthèse de nanoparticules magnétiques <ol><li>synthèse de nanoparticules magnétiques stabilisé avec du citrate (MNPs) <ol><li>Ajouter 20 mmol de FeCl 3 &#8729; 6 H 2 O (5,406 g) et 10 mmol de FeCl 2 &#8729; 4 H 2 O (1,988 g) dans 20 mL d’eau bidistillée désoxygéné (ddd eau). Remuez obtenu solution vigoureusement dans le bécher sous atmosphère de 2 N à l’aide d’un agitateur mécanique jusqu'à l’obtention d’une solution transparente.</li>
		<li>Sous agitation mécanique rapide, ajouter 150 mL de 1 M NH 4 OH, goutte à goutte à l’aide d’entonnoir (prendre 1 h ou plus si nécessaire). Transvaser la solution dans un récipient visser après avoir ajouté tous les NH 4 OH. Vissez la solution de navire et de la chaleur à 75 ° C pendant 30 min. 
		ATTENTION : NH 4 OH est classé comme corrosifs et dangereux pour l’environnement. 
		NOTE : Préparer la solution 4 OH NH de haut grade 28 % NH 4 OH dans l’eau à l’aide d’eau désoxygénée.</li>
		<li>Recueillir le précipité noir avec aimant et lavage à l’aide de 100 mL d’eau de ddd. Répéter 3 fois. Ajouter 50 mL de dihydrate de citrate trisodique 0,5 M à précipiter. Vissez le navire. 
		Remarque : Utiliser une solution désoxygénée de dihydrate de citrate trisodique.</li>
		<li>Re-disperser le précipité par sonication (35 kHz, amplitude de 100 %) et le bateau thermique à 80 ° C pendant 1 h. 
		Remarque : Un sonicateur d’une puissance suffisante est nécessaire.</li>
		<li>Laissez le refroidir de solution à température ambiante. Recueillir le précipité à l’aide d’un aimant et éliminer le surnageant. Re-disperser une boue noire dans 50 mL d’eau de ddd utilisant sonicateur (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
		<li>Transfert des aliquotes (~ 25 mL) dans des tubes à centrifuger 50 mL et ajouter 20 mL d’acétone. Centrifuger à 2400 x g pendant 10 min et enlever les surnageants.</li>
		<li>Re-disperser précipité et dialyser solution contre l’eau à l’aide de dispositif dialyse à coupure de volume approprié de faible poids moléculaire (500-1 000 Da) pendant 24 h. 
		NOTE : Préparez l’appareil de dialyse selon fabricant &#39; exigences de s.</li>
	</ol></li> <li>Synthèse de nanoparticules magnétiques modifiés avec ramifiés polyéthylènimine (MNPs_PEI) <ol><li>Ajouter 2 mL de solution de MNPs obtenue (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 38 mL d’eau de ddd et soniquer (35 kHz, amplitude de 100 %) de la suspension (10 min).</li>
		<li>Sous agitation mécanique rapide, ajouter 10 mL de 10 % ramifiée polyéthylènimine (moyenne 25 kDa). Remuer la solution pendant les 3 h</li>
		<li>Collect précipite utilisant des aimants et éliminer le surnageant. Re-disperser précipité dans 20 mL d’eau ddd. Répétez 5 fois puis laisser agir la suspension définitive (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
	</ol></li> <li>Synthèse de nanoparticules magnétiques particules modifié avec de la silice (MNPs_TEOS) <ol><li>Ajouter 10 mL de la solution obtenue de MNPs (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 60 mL d’eau et 130 mL d’éthanol. Laisser agir la solution et ajouter 6 mL de 28 % NH 4 OH.</li>
		<li>Sous agitation mécanique rapide, ajouter 1 mL d’orthosilicate de tétraéthyle. Remuer la solution pour les 12 h.</li>
		<li>Recueillir le précipité noir utilisant des aimants et lavez-le à l’aide de 50 mL d’éthanol (3 fois) et 50 mL d’eau (3 fois). Les particules re-disperse dans 10 mL de ddd d’eau et laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
	</ol></li> <li>Synthèse de nanoparticules magnétiques modifiés avec des groupes amino (MNPs_APTES) <ol><li>Ajouter 5 mL de la solution obtenue de MNPs_TEOS (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 45 mL d’eau et 50 mL d’éthanol. Laisser agir la solution (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
		<li>Sous agitation mécanique rapide, ajouter 0,5 mL de triéthoxysilane (3-aminopropyl). Remuer la solution pendant les 3 h</li>
		<li>Recueillir le précipité noir utilisant des aimants et lavez-le à l’aide de 50 mL d’éthanol (3 fois) et 50 mL d’eau (3 fois). Les particules re-disperse dans 5 mL de ddd d’eau et laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
	</ol></li></ol> 2. Synthèse de microparticules magnétiques <ol><li>synthèse de microparticules magnétiques stabilisé avec du citrate (MMP) <ol><li>Ajouter 25 mL de 2 M 3 KNO, 12,5 mL 1 m KOH et 205,875 mL d’eau de ddd dans un récipient de visser. Ajouter 6,675 mL de 1 M FeSO 4 pendant l’agitation magnétique. Navire de transfert immédiatement à un bain-marie préchauffé (90 ° C) pendant 2 h. 
		NOTE : Préparez KNO 3 et solutions KOH dans ddd eau.</li>
		<li>Laissez le refroidir de solution à température ambiante. Recueillir le précipité noir avec aimant et lavage à l’aide de 50 mL d’eau de ddd (5 fois). Ajouter 50 mL de dihydrate de citrate trisodique 0,5 M à précipiter. Vissez le navire.</li>
		<li>Redisperse le précipité par sonication (35 kHz, amplitude de 100 %) et le bateau thermique à 80 ° C pour précipité noir frais virés de 1 h. à l’aide de magnet et le lavage à l’aide de 50 mL d’eau de ddd (10 fois).</li>
		<li>Modifier la MPM avec ramifiés polyéthylènimine (MMPs_PEI), silice (MMPs_TEOS) et les groupes amino (MMPs_APTES) qui est similaires au protocole MNPs. Reportez-vous aux sections 2.2, 2.3 et 2.4, respectivement pour plus de détails.</li>
	</ol></li> <li>Synthèse de microparticules magnétiques modifiés avec ramifiés polyéthylènimine (MMPs_PEI) <ol><li>Ajouter 5 mL de solution de MMP (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 38 mL d’eau de ddd et laisser agir la solution (35 kHz, amplitude de 100 %, 10 min). Sous agitation mécanique rapide, ajouter 10 mL de 10 % ramifiée polyéthylènimine (moyenne 25 kDa). Remuer la solution pendant les 3 h</li>
		<li>Recueillir le précipité à l’aide d’un aimant et éliminer le surnageant. Redisperse précipité dans 20 mL d’eau bidistillée. Répétez 5 fois puis laisser agir la solution finale (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
	</ol></li> <li>Synthèse de microparticules magnétiques modifiés à de la silice (MMPs_TEOS) <ol><li>Ajouter 5 mL de solution de MMP (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 60 mL d’eau et 130 mL d’éthanol. Soniquer suspension (35 kHz, amplitude de 100 %) et ajouter 6 mL de 28 % NH 4 OH.</li>
		<li>Sous agitation mécanique rapide, ajouter 1 mL d’orthosilicate de tétraéthyle. Remuer la solution pour les 12 h.</li>
		<li>Recueillir le précipité noir à l’aide d’un aimant et lavez-le à l’aide de 50 mL d’éthanol (3 fois) et 50 mL d’eau (3 fois). Redisperse particules dans 5 mL d’eau de ddd et laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
	</ol></li> <li>Synthèse de microparticules magnétiques modifiés avec des groupes amino (MMPs_APTES) <ol><li>Ajouter 3 mL de solution de MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) dans un bécher de verre. Ajouter 45 mL d’eau et 50 mL d’éthanol. Laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
		<li>Sous agitation mécanique rapide, ajouter 0,5 mL de triéthoxysilane (3-Aminopropyl). Remuer la solution pendant les 3 h</li>
		<li>Recueillir le précipité noir utilisant des aimants et lavez-le à l’aide de 50 mL d’éthanol (3 fois) et 50 mL d’eau (3 fois). Redisperse particules dans 3 mL d’eau de ddd et laisser agir la suspension (35 kHz, amplitude de 100 %).</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnétique particule taille analyse à l’aide de listes de distribution <ol><li>la taille des particules dans l’eau <ol><li>utiliser un DLS instrument qui s’applique à un angle de détecteur de diffusion arrière (173 °) et une longueur d’onde du faisceau de 633 nm. 
		NOTE : Dos diffusion DLS est adaptée aux échantillons concentrés où diffusion multiple peut être évitée. Côté diffusion (angle 90° de détecteur) et la diffusion vers l’avant (angle 15° de détecteur) DLS sont adaptés pour les plus petites particules et mélangé les particules, respectivement.</li>
		<li>Préalable à la mesure dans l’eau, laisser agir particules pendant 3 min. 
		Remarque : Utiliser une solution diluée de particules. Pour ce faire, mélanger 9,6 µL de particules avec 96 µL d’eau.</li>
		<li>Soigneusement distribuer 50 µL de solution de particules en polystyrène latex cuvettes en évitant toute formation de bulles. 
		Remarque : Pour chaque échantillon, utilisez godet jetable (voir table des matières).</li>
		<li>Noter la clarté de la cuvette et la direction du faisceau lumineux. Insérer la cellule dans le porte-échantillon et fermer la chambre de.</li>
		<li>Utiliser les paramètres suivants pour la mesure : température : 25 ° C, indice de réfraction de la phase de dispersion (fer) : 2,344 ; indice de réfraction du milieu dispersif (eau) : 1.333 
		Remarque : Effectuer le mesurage de l’indice de réfraction à l’aide d’un réfractomètre pour des résultats plus précis, particulièrement lors de l’élaboration de matériaux nouveaux ou hybride.</li>
	</ol></li></ol> 4. Préparation d’ADN Stock, particules magnétiques et tampon de liaison <ol><li><ol><li>utilisation du stock de l’ADN un tampon 10 mM Tris-HCL (pH = 8) pour la dilution et le stockage de l’ADN. Utiliser un échantillon d’ADN standard qui peut être amplifié spécifiquement avec un protocole PCR direct en laboratoire (voir la section 5.2 pour conditions et paramètres de réaction). Pour amplifier les 498 paires de bases (bp) du gène xis de control de bactériophage λ, utiliser les amorces suivants. Apprêt en avant : 5 &#39; - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ Inverser l’apprêt : 5 &#39; - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 &#39;</li> <li>produit de PCR purifier à l’aide de la trousse de purification de l’ADN commerciale. 
		Remarque : Les kits commerciaux à l’aide de la procédure basée sur les colonnes de silice donnent &#62; ADN purifiée à 100 ng/µL.</li>
		<li>Mesure de concentration de l’ADN à l’aide de la méthode spectrophotométrique (absorbance à 260 nm). Diluer le stock d’ADN de 10 11 copies/µL en suivant les instructions ci-dessus pour les solutions de travail de 10 10, 10 9, 10, 8 et 10 7 copies/µL. 
		Remarque : Le nombre d’exemplaires du produit PCR peut être calculé selon l’équation suivante, en supposant que la masse moléculaire moyenne est de 650 Da pour chaque bp : ADN copies/µL = (quantité en ng/µL * 6.022x10 23 copies/mol) / (498 bp * 650 g/mol de bp * 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>les particules magnétiques <ol><li>laisser les particules de sédiments sans l’aimant et éliminer le surnageant. Mélanger à 01:20 rapport v/v de particules magnétiques avec ddd eau (particules : eau). 
		NOTE : Approche axée sur le Volume est utilisé pour décrire des quantités de particules magnétiques des masses égales de MNPs et MMP étant facilement difficiles à comparer.</li>
	</ol></li> <li>Lie tampon <ol><li>pour une préparation rapide de 0,75 M solution de sodium acétate-HCL (pH = 6), mélanger 1 mL d’acétate de sodium 3M avec 3 mL de HCL à 1 mM. 
		Remarque : Toutes les solutions utilisées dans la liaison peuvent être conservées à 4 ° C. Note que basse température augmente de manière significative contraignant notamment dans le cas de la solution d’éthanol. Contrôler soigneusement la température des solutions pour une meilleure reproductibilité et précision du dépistage.</li>
	</ol></li></ol> 5. Essais d’efficacité d’Isolation utilisant Quantitative PCR de l’ADN <ol><li>isolement d’ADN par mis à jour le MMP ou MNPs <ol><li>utiliser une plaque à 96 puits et un magnet personnalisé pour plaque à 96 puits pour des expériences de petit volume.</li>
		<li>Utiliser le mélange de solution de liaison suivants : 8 µL modifiés MMP ou MNPs, 10 µL sodium acétate-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 µL d’éthanol de 85 %, 10 µL ADN (solution de copies 10 10).</li>
		<li>Mix bien en pipettant également et place la plaque sur l’aimant pendant 3 min. Alors que la plaque est sur l’aimant, enlever la solution et ajouter 100 µL d’éthanol de 85 % pour le lavage.</li>
		<li>Supprimer éthanol. 
		Remarque : Laissez l’éthanol sécher pendant quelques secondes, mais ne laissez pas les particules trop sec ou montrer des fissures. Si les particules trop sec, ils seront difficiles à dissoudre avec solution d’élution.</li>
		<li>Enlever la plaque de l’aimant et ajouter 40 µL de solution d’élution. Mélangez bien en pipettant également. Replacez la plaque sur l’aimant et de recueillir les ADN éluée (~ 37 µL). Stocker l’éluant à-20 ° C jusqu'à ce qu’une analyse plus approfondie.</li>
	</ol></li> <li>PCR Quantitative <ol><li>utiliser les amorces qui ont servi à préparer le stock ADN à l’étape 4.1.1 pour quantifier les copies du gène xis, conformément au protocole de Haddad et coll.. 10</li> <li>préparer la solution de mélange maître selon la quantité d’échantillons à tester, puis répartir le mélange dans les tubes PCR ou une plaque à 96 puits fond blanc.</li>
		<li>Utiliser les quantités suivantes pour un volume complet de 20 µL PCR mélange : 10 polymérase µL / intercalant mélange colorant (voir table des matières), l’échantillon d’ADN 2 µL, 2 µL avant l’apprêt (10 µM), 2 amorce inverse µL (10 µM)</li>
		<li>Mis en place le thermocycleur selon le programme suivant : 95 ° C pendant 120 s, 40 cycles (95 ° C pendant 15 s, 64 ° C pendant 15 s, 68 ° C pendant 45 s), 68 ° C pendant 5 min.</li>
		<li>Using réanalysés pour des normes et des exemples, calculer le seuil du cycle et de construire une courbe d’étalonnage pour estimer le nombre de copies d’ADN récupérée dans chaque échantillon. L’instrument utilisé ici effectue cela automatiquement.</li>
		<li>Ici, on estime le nombre de copies d’ADN pour le volume total d’élution (~ 40 µL). Pourcentage des ADN récupérée correspondant au montant initial ajouté à liaison solution (totalement 10 11 copies) peut varier au-delà de l’intervalle de 0 à 100.</li>
	</ol></li></ol> 6. ADN-magnétique des particules liaison analyse à l’aide de DLS expériences <ol><li>De l’ADN de liaison <ol><li>pour grand volume (en tube de 1,5 mL), utiliser le mélange de solution de liaison suivants : µL 96 modifié MMP ou MNPs, 120 µL sodium acétate-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 µL d’éthanol de 85 %, 120 µL ADN (10 10 copies solution) ou 120 µL de tampon Tris-HCL (10 mM, pH = 8) pour la commande.</li>
	</ol></li> <li>Analyse du potentiel zeta <ol><li>Prepare deux solutions de liaison, une avec l’ADN et l’autre avec un tampon Tris-HCL pour commande en suivant les instructions à l’étape 6.1.1. Pour éviter la formation de bulles, soigneusement Pipetter 800 µL du mélange liant dans une cellule jetable. 
		Remarque : Utiliser un godet jetable pour la mesure du potentiel de surface zêta (voir table des matières).</li>
	</ol></li> <li>Utilisez les paramètres suivants pour la mesure sur l’instrument DLS : modèle de Smoluchowski avec un F(ka) de 1,5, température : 25 ° C, indice de réfraction de la phase de dispersion (fer) : 2.344, indice de réfraction du milieu dispersif (eau) : 1.333. 
	Remarque : Le taux d’interaction ADN-magnétique de particules affecte directement la mesure des répétitions. Une mesure simple de l’instrument prend 60-70 s. Ici, l’instrument a été chargé de prendre des intervalles de délai 10 mesures avec 1 min. Pour plus de simplicité, les résultats seront afficheront en temps = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 et 18 min de la première lecture.</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans le présent protocole, les principes théoriques qui expliquent la liaison de l’ADN aux particules magnétiques par l’intermédiaire de potentiel zêta étaient sous la question. Le protocole décrit la synthèse et la modification de nanoparticules magnétiques et de microparticules. Procédé de préparation de la solution de contrôle et de la liaison ADN sont également décrites. Deux stratégies sont indiqués ici pour le dépistage des interactions ADN-particules : approches PCR quantitative et listes de distribution. DLS four...

Isolement d’ADN est une des étapes plus essentiels en biologie moléculaire. Le développement de méthodes d’extraction des acides nucléiques a grand impact sur les domaines émergents de la génomique métagénomique, épigénétique et transcriptomique. Il y a un large éventail d’applications biotechnologiques pour l’isolement de l’ADN y compris médicale (médecine légale/diagnostic tools et biomarqueurs pronostiques) et applications pour l’environnement (biodiversité métagénomique, prévalence de l’agent pathogène et surveillance). Il y a eu une demande croissante de purifier et d’isoler l’ADN de différents matériaux et à des échelles différentes telles que sang, urine, sol, bois et autres types d’échantillons. 1 , 2 , 3 , 4
Nano et micro-particules sont aptes au sectionnement de l’ADN en raison de leur grande surface et en particulier lorsqu’ils peuvent être immobilisés par un champ magnétique. Propriétés physico-chimiques des particules, comme la taille ou la charge, peuvent grandement influencer leur capacité à fixer des cibles de biomolécules. 5 afin de renforcer la liaison des biomolécules et de stabiliser les particules, différentes modifications chimiques (revêtements de surface) peuvent être utilisées. Les nombreuses stratégies différentes pour la liaison sont classés selon les interactions covalentes et non covalents. 6 la taille des particules affecte directement leurs propriétés d’aimantation, considérant que la composition des particules peut être adaptée par l’incorporation de matériaux métalliques, alliage ou autres susceptibles d’influencer sa densité, la porosité et la surface. 7 il n’y aucun moyen fiable pour mesurer la charge de surface des petites particules. Au lieu de cela, le potentiel électrique sur le plan de glissement (certaine distance de la surface des nanoparticules) peut être mesuré. 8 cette valeur s’appelle zeta potentiels et c’est un outil puissant qui est habituellement utilisé pour l’évaluation de la stabilité au moyen de microparticules et de nano - par l’intermédiaire de listes de distribution. 9 étant donné que sa valeur dépend non seulement du pH et de la force ionique du milieu dispersif, mais également sur les caractéristiques de surface des particules, il peut s’avérer les changements dans cette surface causée par l’interaction entre les les particules et la molécule d’intérêt. 10
En revanche, structure de l’ADN sous conditions déshydratés (ADN-ADN A formule) expositions conformations compactée qui facilitent sa précipitation (agrégation) comparativement à couramment survenant forme B-ADN. Électrostatique (ionique et liaison hydrogène) sont les principales forces qui contrôle la liaison d’ADN à d’autres matériaux en raison de leur encombrement stérique accessible phosphate et azote bases (surtout guanine). 7 , 10
Dans cet ouvrage, trois modifications chimiques représentante des nanoparticules magnétiques et les microparticules sont analysées (Figure 1 a). La méthode de synthèse et de la modification chimique des nanoparticules et de microparticules sont décrite. Une solution de liaison, qui accorde aux principes théoriques de la précipitation de l’ADN (pH, force ionique et la déshydratation), sert à évaluer l’élution et la fixation à l’ADN. PCR quantitative est utilisée pour évaluer l’efficacité d’élution de l’ADN des nanoparticules représentatifs et microparticules (Figure 1 b). La taille des particules, l’indice de polydispersité et potentiel zêta sont des paramètres importants qui sont utilisées pour visualiser les modifications physico-chimiques qui se produisent sur la surface des particules (Figure 1). Il est important de mettre l’accent sur la caractérisation chimique de la surface de particules magnétiques. Alors que cette étape était au-delà de la portée du présent protocole, plusieurs techniques modernes peuvent être appliquées pour étudier l’efficacité de modifications chimiques. 11 , 12 , 13 , 14 spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) peut être utilisée pour évaluer le spectre infrarouge de la surface de la particule et la comparer au spectre de modificateurs chimiques libres. Spectrométrie de photoélectrons (XPS) est une autre technique qui peut être utilisée pour identifier la composition élémentaire de la surface du matériau. Autres méthodes spectroscopiques et microscopiques et électrochimiques peuvent servir à faire la lumière sur la qualité de la synthèse de la particule. Ce travail met en évidence une nouvelle perspective à l’analyse des interactions ADN-magnétiques de particules par l’intermédiaire de listes de distribution.

<table><tbody><tr><td>Chlorure de fer(III) hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207926</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Chlorure de fer(II) tétrahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td>Synthèse de particules magnétiques Sulfate</td></tr> de <tr><td>fer(II) heptahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Penta</td><td>10060-11000</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Citrate de sodium dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Tétraéthyl orthosilicate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131903</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr> <tr><td>(3-aminopropyl)triéthoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Polyéthylénimine, ramifiée, moyenne Mw ~25 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Synthèse magnétique de particules</td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&nbsp ;</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Penta</td><td>71250-11000</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Nitrate</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Membrane de coupure de poids moléculaire (Mw=1 kDa)</td><td>Laboratoires de spectre</td><td>G235063</td><td>Synthèse</td></tr> <tr><td>de particules magnétiquesOverhead Stirrer</td><td>witeg Labortechnik GmbH</td><td>DH. WOS01035</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>Synthèse magnétique de particules</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>795</td><td>Synthèse de particules magnétiques</td></tr><tr><td>MARQUE Cuvette UV micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>Cuvette pour la mesure de la taille</td></tr><tr><td>Capuchon de marque pour cuvette UV micro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>Bouchons de cuvette pour la mesure de la taille</td></tr><tr><td>Capillaire plié Zeta Cell</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td>Cuvette pour la mesure du potentiel zêta</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>Appareil pour la mesure de la taille et du potentiel zêta</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO Instrument NanoQuant</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>Appareil pour la mesure de la concentration d’ADN</td></tr><tr><td>SYBR Green Kit RT-PCR quantitatif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>Kit PCR</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S instrument</td><td>Eppendorf</td><td>6325 000.013</td><td>Thermocycleur</td></tr><tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Kit de purification de l’ADN</td></tr><tr><td>Acétate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td>Liaison à l’ADN</td></tr></tbody></table>

adn-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolement de l’ADN à l’aide de particules magnétiques est un domaine de grande importance dans la recherche de biotechnologie et biologie moléculaire. Ce protocole décrit l’évaluation de particules magnétiques ADN liaison via la diffusion de la lumière dynamique (DLS) et diffusion de la lumière électrophorétique (ELS). Analyse par DLS fournit des renseignements précieux sur les propriétés physico-chimiques des particules dont la taille des particules et polydispersité potentiel zêta. Ce dernier décrit la charge de surface de la particule qui joue le rôle majeur dans la liaison électrostatique de matériaux tels que de l’ADN. Ici, une analyse comparative exploite trois modifications chimiques des nanoparticules et de microparticules et de leurs effets sur l’attache d’ADN et d’élution. Modifications chimiques de ramifié polyéthylènimine, triéthoxysilane (3-aminopropyl) et de l’orthosilicate de tétraéthyle sont l’objet d’une enquête. Puisque l’ADN montre une charge négative, il est prévu que potentiel zêta de surface de la particule diminue lors de la liaison de l’ADN. Formant des grappes devrait également affecter la taille des particules. Afin d’étudier l’efficacité de ces particules dans l’isolement et l’élution de l’ADN, les particules sont mélangés avec de l’ADN dans pH faible (~ 6), force ionique élevée et environnement de la déshydratation. Les particules sont lavés sur aimant et ensuite l’ADN est éluée par tampon Tris-HCl (pH = 8). Nombre de copies d’ADN est estimée à l’aide de la PCR quantitative (PCR). Potentiel zêta, granulométrie, polydispersité et données quantitatives de PCR sont évaluées et comparées. DLS est un perspicace et méthode d’analyse qui ajoute une nouvelle perspective au processus de projection de particules pour l’isolement de l’ADN.

En utilisant le protocole décrit ici pour synthèse chimique et la modification des particules magnétiques, six des particules magnétiques ont été synthétisés et analysés pour fixation à l’ADN. Un résumé de l’analyse est indiqué dans le tableau 1. En comparant la taille des particules dans l’eau et en solution de liaison, il est clair que toutes les particules agrégées dans solution de liaison par des plis de 2-22. Certaines particules plus regroupées en plusieurs plis en ...

Ce protocole décrit la synthèse de particules magnétiques et évaluation de leurs propriétés de liaison à l’ADN par l’intermédiaire de diffusion de la lumière dynamique et électrophorétique. Cette méthode met l’accent sur la surveillance des changements dans la taille des particules, leur polydispersité et major de potentiel zêta de surface de particules qui jouent rôle dans la fixation des matières telles que l’ADN.

ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

L’objectif global de cette expérience est d’analyser la liaison de l’ADN et des particules magnétiques via la diffusion dynamique et électrophorétique de la lumière.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biotechnologie telles que la vitesse et la force de la liaison entre les acides nucléiques et les particules magnétiques. Le principal avantage de cette technique est la visualisation des changements physico-chimiques sur les particules tels que la taille, la polydispersité ou le potentiel zêta. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic moléculaire en raison de la demande croissante d’isolement rapide et sensible de l’ADN. Dans cette procédure, ajoutez 20 millimoles de chlorure ferrique et dix millimoles de chlorure ferreux dans 20 millilitres d’eau double distillée désoxygénée.Ensuite, remuez vigoureusement la solution obtenue dans un bécher sous atmosphère gazeuse d’azote à l’aide d’un agitateur mécanique jusqu’à ce qu’une solution transparente soit obtenue. Ensuite, sous agitation mécanique rapide, ajoutez 150 millilitres d’une molaire d’ammoniac aqueux goutte à goutte à l’aide d’un entonnoir compte-gouttes pendant une h

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