Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l'ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

L’objectif global de cette stratégie expérimentale est d’étudier la fonctionnalité des variants non codants associés à la maladie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en génomique, telles que la façon dont les variantes génétiques qui ne modifient pas réellement la séquence d’acides aminés contribuent toujours au phénotype de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un processus simplifié d’évaluation de la variance génétique pour l’activité de la fonction et donne un aperçu des protéines régulatrices et des voies affectées.

Cette technique peut être bénéfique pour l’investigation de toute maladie avec une variante causale candidate. Parce que la procédure d’analyse de ces variants est universelle quel que soit le phénotype étudié. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des maladies humaines, elle peut également être appliquée aux mutations dans n’importe quel organisme.

Des lysats nucléaires seront préparés à partir de cellules lymphoblastoïdes B dans cette expérience, mais cette procédure peut être appliquée à la plupart des lignées cellulaires. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, diminuez le nombre de cellules souhaité pour la lyse. Aspirez le support, ajoutez 10 millilitres de PBS glacé et faites tourner à nouveau les cellules.

Lavez les cellules une deuxième fois avec du PBS et retirez le PBS après l’essorage. Remettez en suspension le palais cellulaire dans du PBS glacé en utilisant un millilitre de PBS pour 10 à la septième cellule. Aliquote d’un millilitre de suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, de sorte que chaque tube contienne 10 à sept cellules dans du PBS.

Centrifugez pendant deux minutes et aspirez le PBS. Ajouter à un stock de travail de tampon CE, un millimolaire de dithiothréitol (DTT), un inhibiteur de la phosphatase 1X et 0,5 millimolaire de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF). Remettez en suspension chaque palette cellulaire avec 400 microlitres de ce tampon et incubez sur de la glace pendant 15 minutes.

Ajouter 25 microlitres de Nonidet P-40 à 10 % dans chaque tube de microcentrifugation et mélanger par pipetage. Centrifugeuse à quatre degrés Celsius et vitesse maximale pendant trois minutes. Carafer et jeter le surnageant.

Ensuite, ajoutez à un stock de travail de tampon NE, un DTT millimolaire, un inhibiteur de phosphoaase 1X et un PMSF millimolaire. Remettez en suspension chaque palais cellulaire avec 30 microlitres de ce tampon et mélangez par vortex. Incuber à 4 degrés Celsius, dans un rotateur de tube, pendant 10 minutes.

Centrifugez pendant deux minutes. Prélevez le surnageant clair, qui est le lysat nucléaire. Aliquote le lysat nucléaire avant de le stocker à moins 80 degrés Celsius pour éviter plusieurs cycles de congélation et de dégel qui peuvent dégrader la protéine.

Commencez cette procédure en préparant une matrice de travail de 50 nanomolaires de l’oligonucléotide, comme décrit dans le texte du protocole. Placez les oligos dans un bloc de chaleur à 90 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cinq minutes, éteignez le bloc de chaleur et laissez les oligos refroidir lentement à température ambiante pendant au moins une heure avant de les utiliser.

Préparez ensuite le test de déplacement de mobilité électrophorétique ou le gel EMSA. Retirez la lame d’un gel préfabriqué, à six pour cent de tris-borate-EDTA, ou TBE, et rincez-la plusieurs fois à l’eau désionisée pour éliminer tout tampon des puits. Assemblez l’appareil d’électrophorèse sur gel et vérifiez s’il y a des fuites en remplissant la chambre intérieure avec un tampon TBE 0,5X.

Si aucun tampon ne fuit dans la chambre extérieure, remplissez la chambre extérieure, à peu près, aux deux tiers du chemin. Pré-exécutez le gel à 100 volts pendant 60 minutes. Une fois le pré-traitement terminé, rincez chaque puits avec 200 microlitres de tampon TBE 0,5X.

Préparez un mélange maître de tampon de liaison. Dans un tube de microcentrifugation, mélangez ces réactifs communs à toutes les réactions. Tampon de liaison 10X, polysorbate DTT, Poly(dI-dC) et ADN de spermatozoïde de saumon.

Pour mettre en place les réactions EMSA, ajoutez de l’eau exempte de nucléases dans chaque tube de microcentrifugation, de sorte que le volume final, après l’ajout de tous les réactifs, soit de 20 microlitres. Ajoutez la quantité appropriée de mélange principal dans chaque tube de microcentrifugation. Ajoutez huit microgrammes de lysat nucléaire dans les tubes de microcentrifugation appropriés.

Inclure des tubes contenant l’oligo, sans extrait nucléaire, comme témoins négatifs. Ajoutez 50 femtomoles d’oligo dans les tubes de microcentrifugation appropriés et agissez pour mélanger. Faites tourner brièvement le contenu vers le fond du tube.

Incuber tous les tubes, pendant 20 minutes, à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux microlitres de colorant de chargement orange 10X dans chaque tube de microcentrifugation. Pipeter de haut en bas pour mélanger.

Chargez les échantillons dans le gel TBE à six pour cent en pipetant de haut en bas pour mélanger, puis en expulsant chaque échantillon dans un puits séparé. Faites fonctionner le gel à 80 volts pendant environ 60 à 75 minutes, jusqu’à ce que le colorant orange ait migré des deux tiers aux trois quarts du gel. Une fois la course terminée, utilisez un couteau à gel pour ouvrir la cassette en plastique.

Retirez le gel de la cassette et placez-le dans un récipient avec 0,5 % de tampon TBE pour l’empêcher de se dessécher. Placez le gel à la surface d’un système d’imagerie infrarouge et de chimiluminescence. Éliminez toutes les bulles ou contaminants qui perturberaient l’image.

Scannez le gel à l’aide du logiciel du système de balayage comme décrit dans le texte du protocole. Pour commencer cette procédure, préparez un stock de travail de cinq oligomoles micromolaires comme décrit dans le texte du protocole. Placez les oligos dans un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après cinq minutes, éteignez le bloc de chaleur et laissez les oligos refroidir lentement à température ambiante avant de les utiliser. Réchauffez les tampons suivants à température ambiante : tampon de liaison, tampon de lavage à faible rigueur, tampon de lavage à haute résistance et tampon d’élution. Préparez les mélanges de reliure pour chaque variante.

Mélangez un volume de lysat nucléaire avec deux volumes de tampon de liaison. Ajoutez 1X inhibiteur de phosphatase, 0,5 millimolaire PMSF et 1X activateur de liaison. Ajoutez 10 microlitres de cinq micromolaires d’ADN de capture biotinylé à chaque mélange de liaison.

Mélangez en retournant le tube plusieurs fois. Incuber les mélanges de liant pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de microbilles de streptavidine à chaque mélange de liant.

Incuber 10 minutes à température ambiante. Pour chaque sonde oligo testée, placez une colonne de liaison dans le séparateur magnétique. Assurez-vous que les colonnes sont étiquetées avec la variante d’oligo qui a été utilisée dans le mélange de liaison.

Placez un tube de microcentrifugation directement sous chaque colonne de liaison et appliquez 100 microlitres de tampon de liaison pour rincer la colonne. Pipetez le contenu de chaque mélange de liaison dans des colonnes séparées. Laissez le liquide s’écouler complètement à travers la colonne dans le tube de microcentrifugation.

Appliquez 100 microlitres de tampon de lavage à faible résistance sur la colonne et attendez que le réservoir de la colonne soit vide. Appliquez à nouveau 100 microlitres de tampon de lavage à faible résistance sur la colonne. Appliquez 100 microlitres de tampon de lavage à haute résistance sur la colonne et attendez que le réservoir de la colonne soit vide.

Appliquez à nouveau 100 microlitres de tampon de lavage à haute résistance sur la colonne. Ajoutez 30 microlitres de tampon d’élution natif dans la colonne et laissez reposer pendant cinq minutes. Enfin, ajoutez 50 microlitres supplémentaires de tampon d’élution natif pour éluer les facteurs de transcription liés.

Afin d’explorer la reproductibilité des résultats de l’EMSA et les conséquences des cycles de congélation-décongélation, des oligonucléotides contenant l’allèle de référence ou non de référence d’une variante génétique ont été utilisés pour sonder la même préparation d’extrait nucléaire de lymphocytes B après plusieurs cycles de congélation et de décongélation. La flèche bleue indique la sonde libre. La liaison des facteurs de transcription à l’oligo est vue comme une bande dans la moitié supérieure du gel, indiquée par la flèche rouge.

Ces résultats indiquent que la congélation et la décongélation de cet extrait nucléaire particulier jusqu’à cinq fois n’ont, semble-t-il, aucun effet sur l’intégrité des protéines. Il est également important d’optimiser le rapport signal/bruit pour l’EMSA. Diverses concentrations d’oligos ont été utilisées pour sonder une seule préparation de lysat nucléaire.

Une augmentation de l’intensité de la bande, jusqu’à 100 femtomoles d’oligo a été observée. Les résultats représentatifs d’une étude portant sur un allèle de risque associé au lupus sont présentés ici. Le facteur de transcription, STAT 1, a d’abord été identifié par DAPA, suivi d’une analyse protéomique.

Un western blot DAPA a ensuite confirmé l’identité de STAT 1 et la liaison plus élevée de la forme phosphorylée de STAT 1 à l’oligo à risque de lupus. À la suite de cette procédure, d’autres techniques, telles que la spectrométrie de masse et le western blot, peuvent être effectuées. Cela nous aidera à identifier la protéine régulatrice montrant une liaison allèle-dépendante.

Les tests rapporteurs comme la luciférase peuvent également être utilisés pour étudier les changements dans l’expression des gènes en fonction de l’allèle.