Name: Mesurer les Interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et thermophorèse a petite Echelle (MST) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez la caractérisation des interactions protéiques par RMN et thermophorèse à microéchelle. Cette méthode permet d'analyser les affinités de liaison et la dynamique des protéines marquées aux isotopes stables.

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Ce projet a été soutenu par le CRSNG RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-002-12 C) et l’Alberta Prion Research Institute / Alberta Innovates Bio Solutions (201600018), attribué à tibus et Génome Canada, Fondation canadienne pour Subventions de l’innovation décernées à la métabolomique Innovation Centre (ICTM) et NANUC.

<ol><li>Vinogradova, O., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+unique+tool+in+assessment+and+complex+determination+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions.</a> Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).</li>
<li>McKercher, M. A., Wuttke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+Chemical+Shift+Mapping+of+SH2+Peptide+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).</li>
<li>Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Basis+of+Desmosome-Targeted+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).</li>
<li>Fogl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intermediate+filament+recognition+by+plakin+repeat+domains+revealed+by+envoplakin+targeting+of+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).</li>
<li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H%2C+13C+and+15N+chemical+shift+referencing+in+biomolecular+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR.</a> J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).</li>
<li>Casali, N. Escherichia coli Host Strains. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCasali%2C+N+%22E.+coli+Plasmid+Vectors%22">E. coli Plasmid Vectors</a>. , Humana Press. 27-48 (2003).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>Kozak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Nmr%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography%3A+Rules+of+thumb%2C+limitations%2C+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. , In Press (2018).</li>
<li>Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+molecular+mass+and+dimensions+of+membrane+proteins+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography.</a> Methods. 46 (2), 62-72 (2008).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
<li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation%3A+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li>
<li>Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915003936">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).</li>
<li>Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915002980">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022286014002750">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne divulguer aucun conflit d’intérêt.

Le 2D 15expérience N-résolu NMR est un du plus largement utilisé des méthodes pour montrer comment deux molécules interagissent. C’est la méthode de la plus riche en informations qui permet aux signaux des deux partenaires à être surveillée de façon continue tout au long d’une expérience de titrage en état de solution. Bien que généralement qualitatives dans le cas de grands complexes, la méthode peut aussi servir dans les cas favorables pour mesurer les affinités de liaison où les signaux RMN peuvent être suivis dans des spectres de haute résolution. Lorsque les attributions peuvent être effectuées facilement, comme dans le cas de beaucoup de protéines sous 20 kDa dans la taille, les sites de fixation peuvent aussi être mappés. Des tests complémentaires comme MST fournissent des informations quantitatives sur les interactions en solution et exigent moins de protéines dans les États sans étiquette. Comparaison de mutant de liaison de données est utile pour fournir des contrôles pour s’assurer que les interactions mis en évidence par l’élargissement des raies de NMR sont authentiques et pas d’artefacts de, par exemple, des changements de viscosité ou de l’agrégation.
Expression de la protéine
Rationalisation du processus d’expression réduit la quantité de production de protéines intensive de travail. Cadre de ce processus d’optimisation implique l’identification d’une souche appropriée d’Escherichia coli d’expression de la protéine recombinante. Préférence de souche dépend des éléments, y compris la nature du vecteur en cours d’utilisation et, plus précisément, la stabilité ultime de la protéine recombinante est exprimé7. Le risque de dégradation de la protéine hétérologue par endogène d’e. coli protéases peuvent être réduits par l’utilisation de protéase déficient e. coli comme la souche BL21. Gènes contenant des codons rares, une souche comme RIPL BL21-CodonPlus (DE3) peut être privilégiée. Cette souche allie la nature déficiente de protéase de la souche BL21 des exemplaires supplémentaires d’endogènes des ARNt codons rares pour l’arginine, isoleucine, proline et la leucine. Alternativement, les codons rares qui peuvent compromettre la surexpression peuvent être évités en ordonnant une construction optimisée codon provenant d’une source commerciale. De nombreuses souches d’Escherichia coli sont disponibles pour l’expression du gène recombinant, chacun optimisé pour le contournement d’un problème au cours de l’expression7. Dans le cas de cette étude, la souche déficiente en protéase standard BL21 (DE3) produit en quantité suffisante de protéine soluble pour purification ultérieure et l’analyse.
Purification de protéine
Le protocole de purification d’une protéine donnée est souvent unique en ce sens que chaque protéine reste stable et soluble dans des conditions différentes telles que température, concentration en sel ou pH. L’efficacité globale de purification par chromatographie d’affinité est également sensible à la concentration des espèces élution comme imidazole à différentes étapes au cours du processus de purification. Dans ce travail, les conditions de tampon critique pour IMAC étaient pH pour le E-PRD et concentration imidazole pour le VimRod. Un pH de 7.5 devait éviter la précipitation du PRD-E après élution initiale de la colonne de l’IMAC. Pour la purification de l’IMAC de VimRod, augmentation de la concentration de l’imidazole de 30 à 50 mM au cours de l’étape de lavage de colonne s’est avéré pour avoir une amélioration substantielle dans la pureté des fractions d’élution finale. Pour l’étape d’élution, augmentation de la concentration de l’imidazole de 250 à 350 mM s’est avéré pour améliorer le rendement de l’élution finale. Les premières tentatives pour éluer les protéines à l’aide d’imidazole de 250 mM a conduit à l’élution incomplète du VimRod telle que révélée par une bande d’imidazole 1 M final de la colonne (données non présentées). Augmentation de la concentration de l’imidazole à 350 mM pour l’élution suffisait récupérer l’ensemble de la protéine liée à la colonne. S pouvant servir un double objectif, car il agit comme une étape de polissage pour la purification de protéines tout en effectuant simultanément change de tampon. Change de tampon est une étape essentielle pour l’analyse ultérieure de liaison car il supprime l’imidazole utilisé pour Éluer la protéine His6-étiquetée. Il sert également une occasion de changer les conditions telles que la concentration en sel ou pH, ce qui peut affecter l’efficacité de certaines techniques en aval ou essais. Protéine décalage thermique (PTS) peut être utilisé pour identifier les tampons optimales pour les tests en aval, en particulier pour ceux qui ont besoin de protéines stable pour de longues périodes de temps à la température de la pièce8,9.
Analyse de liaison
Protéine qui est fraîchement préparé est critique pour essais de liaison exacte, bien que la protéine congelé peut également être utilisé tant que les résultats sont comparés. Les protéines filamenteuses Comme vimentine multimerize d’une manière dépendante de sel et pH, et par conséquent la solution il fallait être optimisé et l’État oligomère estimée par une méthode telle que SEC10,11, dynamique de diffusion de lumière 12 ou ultracentrifugation analytique13,14,15. Spectroscopie RMN est bien adaptée pour la mesure des interactions ligand de petites protéines à résolution atomique. Cependant, quand une protéine interagit avec une molécule plus grande, il s’ensuit un culbutage plus lent et cela se traduit par la perte des signaux qui peuvent confirmer liaison, bien qu’il ne le fait pas nécessairement permettre cartographie des sites, ce qui nécessitent également affectation d’au moins de fixation dorsale résonances. Dans ce scénario, des expériences RMN ne permettent pas d’identifier le site de l’interaction. Donc site réalisé mutagénèse est appliqué pour identifier les résidus importants nécessaires pour la liaison. C’est pourquoi ces mutants ne présentent pas de perte de signal. Dans ce protocole, une forme mutante avec une substitution en position 1914 conserve les intensités maximales en présence de VimRod et confirme donc la perturbation de l’interaction des E-PRD et VimRod. Affectation des résonances épine dorsale et sidechain ajouterais valeur à cette approche, en particulier comme la structure pour le PRD-E libre a été résolue par cristallographie aux rayons x4. Futures applications de la RMN comprennent la caractérisation des interactions complexes entre les molécules plus grosses et bénéficieront d’ultra hautes aimants de champ et l’utilisation des autres groupes observables telles que 13C-étiquetés et groupes méthyles trifluoro comme journalistes.
MST a un certain nombre d’avantages pour l’étude des interactions de liaison16. Les partenaires de liaison sont libres en solution et pas immobilisées. Analyse de la qualité des échantillons est intégré dans le logiciel avec contrôle de la qualité reporting d’agrégation, l’adsorption sur les capillaires ou marquage fluorescent insuffisante de la molécule cible. De petites quantités de la cible sont généralement utilisés, la concentration de la cible marquée est généralement entre 20 et 50 nM en 10-20 μL volume/réaction. Ce protocole utilise des volumes de réaction très faible (10 μL) afin d’optimiser la concentration de ligand qui peut être réalisé dans les titrages permettant des interactions de liaison faible à caractériser. Cela exige que l'on précise pipetage et prenant soin d’éviter d’introduire des bulles tout en mélangeant toujours soigneusement. Un mélange adéquat est essentiel pour les mesures de fluorescence précise et uniforme le long de la série de dilutions en série. Le montant de Tween-20 dans les expériences de MST a été réduit à une norme de 0,05 % à 0,015 % pour réduire la tendance à créer des bulles et d’améliorer le mélange.
Le colorant rouge-Tris-NTA offre un moyen rapide, facile et pratique d’étiqueter fluorescent toute protéine qui a un son tag. L’étiquetage est effectivement terminé en 30 minutes seulement et est très serré de sorte qu’aucune procédure de retrait de colorant n’est nécessaire. Aucune modifications ne sont apportées aux résidus d’acides aminés dans la protéine qui seraient susceptibles de modifier les propriétés de liaison du ligand. Une mise en garde est que seulement les protéines doivent être étiquetées doivent avoir une balise His6. Cela nécessitait le clivage de la balise de la protéine ligand, E-PRD et la suppression de la balise et clivé E-PRD avec une deuxième étape de colonne IMAC. Si possible, la protéine ligand doit être préparée sans l’utilisation d’une balise. Alternativement, protéines peuvent être étiquetés de façon covalente avec un fluorophore par amine coupler à des résidus de lysine ou thiol de couplage pour les résidus de cystéine. Cependant, il faut quand à l’aide de ces systèmes depuis la fixation covalente d’un fluorophore peut-être affecter les interactions de liaison électrostatique ou polaire en s’appuyant sur les résidus de lysine ou la cystéine. La quantification de l’affinité entre les VimRod et les E-PRD de MST a été particulièrement sensible à la concentration de sel. Ce problème a été atténué par dialyse initialement la cible et le ligand dans le même lot de tampon. Néanmoins, saturation de la courbe de liaison MST ne pourrait être atteint que lorsque vous effectuez les tests de MST en présence de NaCl 150 mM en raison du comportement complex de VimRod. Données fiables et complètes a été obtenues une fois que la concentration de NaCl a été abaissée à 10 mM, ce qui permet un calcul précis de la KD. Donc, optimisation minutieuse des conditions de la solution et comparaison avec des analyses complémentaires sont recommandés afin d’atteindre des résultats robustes. En outre, les MST peut-être servir à quantifier la dépendance de sel pour une interaction donnée, de quantifier les propriétés stoechiométriques des interactions protéine, moniteur le repliement des protéines et de la sonde en enzyme cinétique17.

Interactions entre les protéines permettent la formation des machines moléculaires qui créent l’ordre à l’intérieur des cellules. Les interactions individuelles sont souvent faibles mais contribuent généralement à multivalents complexes qui peuvent être coopératif et dynamiquement réglementé. Les épreuves sensibles qui fournissent la résolution atomique et des informations quantitatives sur ces interactions complexes sont nécessaires pour déduire les mécanismes et concevoir des interventions comme la drogue-comme des molécules. Spectroscopie RMN est une méthode efficace pour obtenir les informations sur les interactions entre protéines et est aussi utilisée pour le dépistage rapide des ligands y compris ceux qui se lient faiblement1. Les méthodes de RMN utilisés peuvent être classés en ceux qui sont les protéines observer ou observer de ligand. Ce manuscrit utilise l’ancienne approche dans laquelle un spectre d’une protéine qui est relativement faible (généralement sous 20 kDa) marquée des isotopes stables est acquise et le ligand non étiqueté est titré. Ceci permet les résidus étiquetées impliqués dans l’interaction à mapper dans les cas favorables. Une fois les formes complexes, il y a des changements dans les environnements chimiques des résidus interdépendants qui se manifestent par des changements dans le déplacement chimique et la forme de leurs signaux de RMN. L’ampleur de ces changements est corrélée avec le degré d’implication de ces groupes dans l’interaction. Perturbations de déplacement chimique (EFPC) peuvent être mesurées en comparant une série de spectres RMN de la protéine recueillies en absence et en présence de quantités variables du ligand. Pour les plus gros ligands ou interactions complexes, le changement de forme de la pointe ou l’intensité peut être mesuré pour déduire des interactions.
L’expérience 2D couramment utilisé pour la détection des interactions ligand est le 15N-hétéronucléaire corrélation (HSQC) quantique unique expérience2. Cela exige qu’une protéine être uniformément étiquetés avec 15N, qui est généralement réalisé en les exprimant en tant que versions affinité-tag dans les cultures bactériennes Escherichia coli en 15médias enrichis en N. La liaison est apparente lorsque les spectres HSQC recueillis durant le titrage sont superposent, révélant les changements de pointe pour un sous-ensemble de résidus impliqués dans la formation du complexe. L’interaction peut se produire dans le régime d’échange rapide où les signaux de l’État libre et saturée en ligand sombrer dans une population moyenne de crête. Par ailleurs, dans le cas d’échanges lents entre les États, les deux signaux est observés avec intégrales qui représentent leurs quantités relatives. Analyse lineshape RMN peut être utilisés pour estimer les affinités de liaison dans certains cas, des méthodes telles que MST se sont également révélés commodes et fournissent une validation croisée de véritables interactions.
L’exemple fourni est de deux protéines retrouvées dans les desmosomes. Ils véhiculent des jonctions entre les surfaces de la cellule et le cytosquelette et médient MULTIVALENTES interactions entre les machines d’adhérence cellulaire et des filaments intermédiaires pour maintenir l’intégrité de la peau et les tissus cardiaques et résister à des forces de cisaillement. Maladies peuvent se produire lorsque desmosomes protéines comme desmoplakine ou vimentine sont compromises par les mutations ou les auto-anticorps, conduisant à la déstabilisation des jonctions cellule-cellule, et leurs interactions sont donc d’une importance cruciale,3. La base structurelle de liaison du ligand par des desmosomes protéines peut être caractérisée par la spectroscopie RMN, tandis que les interactions peuvent être quantifiées en MST. Méthodes ci-après ont été utilisées pour caractériser les interactions entre domaines de répéter plakin (PRDs) qui sont souvent présents sous forme d’ensembles de tandem qui offrent des rainures base et vimentine, un filament intermédiaire qui interagit à travers une surface acide offerte par son hélice forfait4. Ces complexes sont formées à la membrane cellulaire où ils l’ancre pour les filaments intermédiaires du cytosquelette cellulaire aux desmosomes qui se connectent à des cellules adjacentes, formant ainsi un réseau de liaisons adhésifs qui rayonne dans un tissu.

<table><tbody><tr><td>Monolith NT.115, comprend un logiciel de contrôle et d’analyse</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-G008</td><td>Instrument pour thermophorèse microscopique</td></tr><tr><td>Kit d’étiquetage His-Tag RED-Tris-NTA</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-L008</td><td>Colorant RED-tris-NTA pour</td></tr><tr><td>capillaires MST Capillaires standard</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-K022</td><td>pour MST</td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 mL</td> GE <td>Healthcare</td><td>17524801</td><td>Colonne IMAC</td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA résine, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td>Résine IMAC</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>Colonne</td></tr><tr><td>SEC TEV protéase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4455</td><td>clivage de son étiquette de E-PRD</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td>cellules pour l’expression protéique</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase cOmplete Comprimés cocktail Sans EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td>inhibiteurs de protéase pour la purification des protéines par IMAC</td></tr><tr><td>TCEP, chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td>pour la purification des protéines</td></tr><tr><td>Réactifs (HEPES, NaCl, etc)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>divers</td><td>Préparation de milieux et de tampons</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium (15N, 99 %)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467</td><td>marquage isotopique pour RMN</td></tr><tr><td>D2O, oxyde de deutérium (D, 99,8 %)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2259</td><td>Préparation d’échantillons RMN</td></tr><tr><td>DSS, sodium 2,2-diméthyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98 %)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-8206</td><td>reference pour RMN</td></tr><tr><td>Précision 5 mm Tubes RMN, 7" de long</td><td>SJM/Deutérotubes</td><td>BOROECO-5-7</td><td>Tubes RMN</td></tr><tr><td>Spectromètre RMN (14,1 Tesla)</td><td>Bruker</td><td></td><td>acquisition de données RMN</td></tr><tr><td>TCI 5mm z-PFG Sonde cryogénique</td><td>Bruker</td><td></td><td>acquisition de données</td></tr> <tr><td>RMNNom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker TopSpin 4.0.1</td><td>Traitement Bruker</td><td></td><td>des données RMN</td></tr><tr><td>MO. Technologies</td><td></td><td>de contrôle NanoTemper</td><td>incluses avec Monlith NT.115</td></tr><tr><td>MO. Analyse d’affinité</td><td>NanoTemper Technologies</td><td></td><td>incluses avec Monlith NT.115</td></tr></tbody></table>

mesurer les interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (rmn) et thermophorèse a petite echelle (mst)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Protéines filamenteuses Comme vimentine fournissent répète d’organisation au sein de cellules en fournissant un échafaudage structurels avec les sites permettant de lier des protéines contenant des plakin. Ici, un protocole pour la détection et la mesure de ces interactions est décrite en utilisant le domaine globulaire plakin d’envoplakin et la bobine hélicoïdale de vimentine. Cela fournit une base pour déterminer si une protéine lie vimentine (ou protéines filamenteuses similaires) et mesure de l’affinité de l’interaction. La protéine globulaire d’intérêt est étiquetée avec 15N et titrée avec la vimentine protéine en solution. Un spectre de RMN bidimensionnel est acquis pour détecter des interactions en observant les changements dans la forme de pic ou déplacements chimiques et élucider les effets des conditions de solution, y compris les niveaux de sel, qui influencent la structure quaternaire de vimentine. Si la protéine d’intérêt lie le ligand filamenteux, la réaction de liaison est quantifiée par MST en utilisant les protéines purifiées. L’approche est un moyen simple pour déterminer si une protéine d’intérêt lie à un filament et d’évaluer l’incidence des altérations, comme les mutations ou les conditions de la solution, sur l’interaction.

Le domaine de la E-PRD (résidus 1822-2014 clonés dans pProEX-HTC) du gène humain envoplakin et le domaine VimRod (résidus 99-249 clonés dans pET21a) de vimentine humaine4 ont été exprimées avec les balises His6 et purifiées. Figure 6 et Figure 7 montrent que les niveaux de pureté de VimRod (18,8 kDa) et E-PRD (21,8 kDa) obtenues par cette méthode de purification des protéines. La suppression de la His6 tag de la construction de l’E-PRD est indispensable pour les expériences de MST comme la protéine VimRod est étiquetée à l’aide d’un colorant de liaison His6 tag et tout E-PRD conservant son étiquette His6 peut-être concourir pour la fixation du colorant. La deuxième colonne IMAC après clivage de la balise avec la protéase TEV supprime la protéase TEV, la balise clivée et toute clivé His6-E-PRD qui restaient. La dernière étape de polissage de la purification est la chromatographie d’exclusion. Malgré les deux protéines étant d’une taille similaire, le VimRod élue de la colonne à un 51 mL alors que le pic d’élution E-PRD est centré à 72 mL où s’attendrait un monomère de protéine de cette taille. L’augmentation apparente de la taille de VimRod est probablement due à la ses caractéristiques comme une longue tige filamenteuse en forme de protéine comme analytiquement ultracentrifugeuse expériences ont démontré que le VimRod était monomère4. Baisse des rendements de protéine sont obtenus à partir des cultures faites en M9 que ceux d’un bouillon riche en raison d’un montant inférieur de cellules étant produites dans les médias un minimum. La croissance initiale de la plus grande et ferments lactiques pour les préparations de M9 TB permet l’amélioration des rendements cellulaires tout en conservant l’étendue de 15N étiquetage nécessaires pour les expériences de RMN.
Le 15N -1H HSQCs ont été acquis pour le type sauvage et le mutant R1914E E-PRD en présence ou en absence de VimRod (Figure 8 a-8D). Le spectre de E-PRD dans la Figure 8 montre le nombre attendu de pics bien résolues, indicatives d’une protéine correctement pliée. En présence de VimRod (Figure 8 b), le spectre montre élargissement de la gamme étendue et de la disparition de pointe, correspondant à la liaison entre le E-PRD et VimRod. Cette liaison est perdue par mutation de R1914E comme en témoigne en comparaison de la Figure 8 et 8d. Peu de changement est observée dans le spectre à l’addition de VimRod pour le mutant R1914E indiquant un manque de liaison entre ce mutant E-PRD et VimRod. Les intensités maximales de E-PRD dans la présence ou l’absence de VimRod ont été comparées et tracées comme les intensités relatives des pics en 8E de la Figure, qui indique la portée de l’élargissement de pic dans le complexe de E-PRD. Le mutant R1914E de E-PRD (non illustré) conservé environ 97 % des pics à 20 % ou des intensités maximales plus élevées en présence de VimRod, comparée à environ 20 % pour le type sauvage (Figure 8F). Cela représente une perte de mutant de point de fonction, avec les autres mutants ayant des effets intermédiaires aussi avoir été étudié4.
À valider et à quantifier la liaison de ces facteurs VimRod et E-PRD MST His6-VimRod marqué par fluorescence rouge-tris-NTA agent comme cible mélangé avec une diminution des concentrations du ligand E-PRD de 1,28 mM à 39,1 nM ont été effectuées. Trois titrages de liaison ont été réalisées et les résultats sont en moyenne et illustrés à la Figure 9. Les données ont été ajustées avec un modèle standard de liaison du ligand du site unique et a donné un KD de 25,7 ± 2.1 μM. Évaluation de la liaison entre VimRod et E-PRD par résonance plasmonique de surface a donné une valeur de KD similaire de 19,1 ± 1,3 μM4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> Figure 1 : Capture d’écran de la configuration de l’expérience de RMN. La fenêtre illustrée est utilisée pour mettre en place une expérience standard pour recueillir un dataset HSQC. Paramètres de l’expérience sont lus dans adjacente à l’expérience. L’expérience ZGPR montré est choisie comme une première expérience pour charger les paramètres standard et solvant protonique dépendants. La fenêtre titre est utilisée pour entrer les détails expérimentaux aux fins de conservation des données. Pour percevoir le spectre HSQC l’expérience ZGPR est remplacé par SFHMQC3GPPH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> Figure 2 : réglage des paramètres expérimentaux RMN. La fenêtre illustrée sert à entrer les paramètres fondamentaux pour la séquence d’impulsions NMR afin d’optimiser le signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> Figure 3 : traitement des données RMN. Paramètres utilisés pour le traitement de chacune des deux dimensions du spectre RMN du apparaissent, avec des flèches indiquant ceux qui sont en général réglés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> Figure 4 : paramètres pour le prélèvement de RMN pic. Les paramètres utilisés pour la cueillette des NMR pics dans le spectre RMN transformé sont affichés avec des valeurs typiques. Régler la gamme de ppm, l’intensité et la nombre de pics pour optimiser les spectres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> Figure 5 : représentant des Peaklist avec des intensités. Chaque pic qui est prélevée dans le spectre RMN reçoit un nombre et ses 1H et déplacements chimiques 15N et intensité du signal sont affichés. Cette peaklist permet ensuite de comparer les spectres obtenus dans la présence/absence d’un partenaire d’interaction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> Figure 6 : Purification de VimRod His6-tag IMAC et S. A. Le chromatogramme pour l’élution de la colonne IMAC montre un pic majeur de VimRod. B. le chromatogramme pour l’élution de la colonne S montre un pic majeur. C. SDS-PAGE des fractions collectées au cours de la purification : normes MW avec la MW figurant aux points kDa à gauche du gel (M), lysat cellulaire (1), IMAC intermédiaire (2), lavage (3), mise en commun d’élution (E1), mis en commun S d’élution (E2). Bandes visibles à un poids moléculaire plus élevé dans les couloirs E1 et E2 sont des oligomères de VimRod pur tel que confirmé par western blot (données non présentées). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> Figure 7 : Purification du E-PRD par IMAC et S. A. SDS-PAGE, de la purification de l’IMAC montrant des étalons de masse moléculaire avec la MW indiqué dans kDa à gauche du gel (M) et l’éluat de la première colonne IMAC (E1), le TEV clivage produits (+ TEV) et le flux par le biais de la deuxième colonne de l’IMAC (FT). B. le chromatographe de la colonne S montre un pic majeur. SDS-PAGE C. les normes de poids moléculaire (M) et les fractions de sommet S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> Figure 8 : HSQC spectres de type sauvage et R1914E Mutant de E-PRD en présence et en Absence de VimRod. Les spectres HSQC montrent sauvage E-PRD (100 µM) en 20 mM Tris-HCl, pH 7, en l’absence (A) ou en présence de 50 µM de 150 mM NaCl, 1 millimètre DTT, VimRod (B). Séries C et D sont les spectres HSQC du mutant R1914E (100µM) en l’absence ou la présence de 50 µM VimRod, respectivement. Dans le groupe E le pic de15N relative 1H - intensités du PRD-E avec ou sans liaison de VimRod sont indiqués en fonction du nombre maximum, qui est arbitrairement assigné et non basée sur la position de la séquence. Ces valeurs peuvent être utilisées pour définir un seuil de signification pour réduction d’intensité maximale lors de l’addition d’un ligand. Si les affectations sont disponibles, les valeurs importantes peuvent souvent être vus pour mapper vers une zone de liaison. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> Figure 9 : liaison de E-PRD à VimRod. E-PRD a été dilué dans une série de dilutions de double de 1,28 mM pour 39,1 nM et incubées avec VimRod marqué avant d’effectuer l’analyse de MST. Les données de trois essais indépendants ont été combinées. Les données ont été ajustées à un modèle KD donnant un KD de 25,7 μM avec une confiance KD de ± 2.1 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphate de sodium dibasique (anhydre)</td>
			<td>6,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphate de potassium monobasique (anhydre)</td>
			<td>3.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlorure de sodium</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Jusqu'à 950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. M9 médias pour marquage isotopique.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 NH4Cl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose (ou 13C-glucose)</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL Thiamine</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM FeCl3
</td>
			<td>400 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metal Mix (tableau 3)</td>
			<td>500 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Jusqu'à 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 2. Mélange nutritif pour les médias de la supplémentation de M9.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Quantité</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM MnSO4
</td>
			<td>75,5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. 7 mM H3BO3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,7 mM CuSO4
</td>
			<td>55,9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Jusqu'à 500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3. Supplément de metal Mix pour enrichir le mélange nutritif de MT.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Échantillon</td>
			<td>1 mM E-PRD de tampons A1 (µL)</td>
			<td>1mM VimRod de tampon A (µL)</td>
			<td>Tampon une (µL)</td>
			<td>200 µM DSS en D2O (µL)</td>
			<td>Tampon B2 (µL)</td>
			<td>Total Volume (µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD seul</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 Mémoire tampon A: 20 mM Tris-HCl, 1 millimètre DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 Mémoire tampon B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4. Préparation de l’échantillon de la RMN.

Nous présentons ici un protocole pour la production et la purification des protéines qui sont marqués avec des isotopes stables et ultérieure caractérisation des interactions protéine-protéine à l’aide de la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et micro-échelle Expériences de thermophorèse (MST).

Mesurer les Interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et thermophorèse a petite Echelle (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Cette méthode peut aider à répondre directement aux questions clés dans le domaine de l’interaction protéique, par exemple si les protéines se lient directement à une petite molécule ou à une grosse molécule. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est un moyen simple et rapide de détecter les interactions directes au niveau atomique. Allumez le flux d’air avec la commande éjectable ej.Cela permettra d’apporter l’échantillon de l’aimant. Maintenant, placez l’échantillon dans une filature sur le dessus de l’aimant dans l’ouverture. Insérez avec la commande ij.Attendez que l’échantillon se dépose à l’intérieur de l’aimant avant de procéder. Créez un nouvel ensemble de données à l’aide des paramètres NMR standard de commande et de charge d’edc en sélectionnant l’expérience ZGPR. Remplissez le NOM, le numéro d’expérience et les champs de numéro de dossier de données traités.Sélectionnez le solvant dans le champ de solvant set et cliquez sur Exécuter getprosol pour lire les paramètres standard sauge et dépendant du solvant. Verrouillez l’échantillon au solvant déréflé à l’aide de la commande de verrouillage et attendez qu’il soit fini de balayer et atteint la serrure. Corrigez la fréquence de résonance de l’aimant en accordant l’échantillon à l’aide de l’atma de commande de réglage automatique.Surveillez la courbe vacillant jusqu’à ce que le réglage automatique soit terminé. Shim le champ magnétique en utilisant topshim. Shimming fait un ajustement au champ magnétique.Atteindre l’uniformité autour de l’échantillon. Il est de bonne pratique de stocker cela en valeurs avec la commande wsh, et de les lire en utilisant rsh avant topshim, si vous utilisez les mêmes échantillons ou similaires. Maintenant, ajustez le gain du récepteur avec la commande rga pour atteindre le rapport signal/bruit maximum.Placez le centre du spectre sur le décalage de résonance d’eau, et réglez l’impulsion de proton de 90 degrés à la puissance élevée utilisant calibo1p1. Collecter le spectre des protons à l’aide de la commande et du processus zg zéro go avec efp. Ceci inclut la multiplication exponentielle, la décomposition libre d’induction incorporant l’élargissement de ligne, la transformation fourier du FID, et le pk pour appliquer la correction de phase.Appliquez l’apk de correction de phase automatique et l’absn automatique de correction de ligne de base utilisant l’option polynomiale sans intégration. Créez un nouvel ensemble de données pour l’expérience SOFAST HMBC en sélectionnant SFHMQC3GPPH dans l’expérience. Copiez les P1 et O1 optimisés à partir du spectre des protons et peuplez les impulsions dépendantes P1 en utilisant la commande getprosol 1H p1 plw1, où p1 est la valeur P1 optimisée, et plw1 est le niveau de puissance pour P1. Maintenant, optimisez la constante CNST54 pour définir la compensation pour le changement chimique amide.Optimisez également CNST55 pour définir la bande passante afin d’englober les régions spectrales d’intérêt, permettant d’optimiser le gain du récepteur. Pour sélectionner ces paramètres, extraire le premier FID du spectre bidimensionnel et rechercher le signal observé pour les définir. En outre, variez le délai de relaxation, le nombre d’analyses et les scans factices pour obtenir une sensibilité acceptable au signal avec la commande gs, ce qui permet d’aller scanner pour surveiller la qualité des données en temps réel.Enfin, enregistrez les spectres à l’aide de Zero Go zg. Définissez les paramètres de traitement en fonction de la taille des dimensions F2 directes et indirectes F1 du spectre, avec une prévision linéaire facultative dans la dimension indirecte. Sélectionnez QSINE comme fonction Fenêtre et entrez un décalage de cloche sinusoïde de deux pour traiter le spectre bidimensionnel.Entrez la commande xfb pour traiter les données dans les deux directions avec la fonction fenêtre et la transformation Fourier. Utilisez l’apk2d de commande pour effectuer la correction automatique de phase dans les deux directions. Corrigez la ligne de base avec la fonction de correction de base automatique abs2 pour les données 2D.Cela applique une fonction polynomiale entre les valeurs ppm définies dans les paramètres de traitement, et produira un spectre 2D pour une analyse plus approfondie. Si vous prévoyez d’effectuer un traitement en série pour la comparaison des données d’interaction avec une autre molécule, stockez les paramètres de traitement avec le wpar de commande et rappelez-les avec rpar. Entrez le pp de commande pour commencer le processus de pic picking.Définissez la plage de ppm, l’intensité minimale et le nombre maximal de pics en fonction des pics prévus. Ensuite, cliquez sur OK. Vérifiez les résultats par inspection visuelle. Si nécessaire, réédagez le processus jusqu’à ce que les résultats soient satisfaisants en fonction de la qualité des spectres.Générer une liste de pointe avec la commande pp. Cette liste de pointe contient des informations sur la hauteur des données et l’intensité maximale par défaut. La liste de pointe peut être exportée vers des spectres ultérieurs et peut être lue par d’autres programmes.Observez maintenant les spectres de la protéine HSQC pour décexer les changements dans les intensités de pointe ou le mouvement des changements chimiques qui indiquent une interaction avec une autre molécule. Si la molécule en interaction est importante, attendez-vous à une réduction des intensités maximales ainsi qu’à la disparition de certains pics. Importez la liste de pointe sur l’ensemble de données suivant en cliquant sur l’onglet pics et en sélectionnant l’importation avec un clic droit dans la fenêtre pics.Visualisez les pics sur le spectre et, si nécessaire, déplacez-les vers de nouvelles positions. Cliquez sur les intensités de réinitialisation pour une table complète afin de générer une liste de pointe pour le spectre qui inclut les intensités. Cette liste de pointe reporte les informations de position de la liste de pointe stockée.Exportez les listes de pointe de différents ensembles de données vers une feuille de calcul ou un autre programme mathématique pour analyse en sélectionnant la fonction Export. Calculez le changement des intensités maximales avec l’intensité maximale de la fonction dans le spectre complexe, l’intensité maximale du spectre protéique pour chaque pic. Les valeurs peuvent être converties en pourcentage de variation par multiplication par 100.Notez que les volumes de pointe sont également utiles, bien que les intensités de pointe soient plus faciles à mesurer pour les pics qui sont placés près les uns des autres, comme c’est habituellement le cas pour les protéines avec une forte densité de pics relativement larges. Les N15HSQCs ont été acquis pour le type sauvage E-PRD, ainsi que le mutant R1914E, en présence ou en l’absence de VimRod. Le spectre de type sauvage E-PRD montre le nombre prévu de pics bien résolus, ce qui indique une protéine correctement pliée.En présence de VimRod, le spectre montre l’élargissement des lignes étendues et la disparition maximale, correspondant à la liaison entre E-PRD et VimRod. Peu de changement est observé entre le spectre du mutant R1914E sur son propre et sur l’ajout de VimRod, indiquant un manque de liaison à ce mutant E-PRD. Ici, les intensités de pointe e-PRD en présence et en absence de VimRod ont été comparées et tracées comme les intensités de pointe relatives pour indiquer la gamme de pic s’élargissant dans le complexe E-PRD.Pour valider et quantifier la liaison de VimRod et e-PRD, l’analyse MST utilisant His6-VimRod étiquetée avec le colorant fluorescent RED-tris-NTA comme cible, a été effectuée en utilisant des concentrations décroissantes du ligand E-PRD. Les données étaient adaptées à un modèle standard de liaison ligand d’un site et donnaient un KD de 25,7 plus ou moins 2,1 micromolaires. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des conditions d’acquisition et de traitement identiques.aura du mal en raison de l’accès à des échantillons de protéines étiquetées isotopiques pour la collecte de spectres RMN. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie du cancer, de l’infection, ou de la maladie neurodegenerative parce qu’elles impliquent la formation des interactions protéiques qui sont compromises dans la maladie.

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