Mesurer les Interactions des protéines globulaires et filamenteuses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et thermophorèse a petite Echelle (MST)

Cette méthode peut aider à répondre directement aux questions clés dans le domaine de l’interaction protéique, par exemple si les protéines se lient directement à une petite molécule ou à une grosse molécule. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est un moyen simple et rapide de détecter les interactions directes au niveau atomique. Allumez le flux d’air avec la commande éjectable ej.

Cela permettra d’apporter l’échantillon de l’aimant. Maintenant, placez l’échantillon dans une filature sur le dessus de l’aimant dans l’ouverture. Insérez avec la commande ij.

Attendez que l’échantillon se dépose à l’intérieur de l’aimant avant de procéder. Créez un nouvel ensemble de données à l’aide des paramètres NMR standard de commande et de charge d’edc en sélectionnant l’expérience ZGPR. Remplissez le NOM, le numéro d’expérience et les champs de numéro de dossier de données traités.

Sélectionnez le solvant dans le champ de solvant set et cliquez sur Exécuter getprosol pour lire les paramètres standard sauge et dépendant du solvant. Verrouillez l’échantillon au solvant déréflé à l’aide de la commande de verrouillage et attendez qu’il soit fini de balayer et atteint la serrure. Corrigez la fréquence de résonance de l’aimant en accordant l’échantillon à l’aide de l’atma de commande de réglage automatique.

Surveillez la courbe vacillant jusqu’à ce que le réglage automatique soit terminé. Shim le champ magnétique en utilisant topshim. Shimming fait un ajustement au champ magnétique.

Atteindre l’uniformité autour de l’échantillon. Il est de bonne pratique de stocker cela en valeurs avec la commande wsh, et de les lire en utilisant rsh avant topshim, si vous utilisez les mêmes échantillons ou similaires. Maintenant, ajustez le gain du récepteur avec la commande rga pour atteindre le rapport signal/bruit maximum.

Placez le centre du spectre sur le décalage de résonance d’eau, et réglez l’impulsion de proton de 90 degrés à la puissance élevée utilisant calibo1p1. Collecter le spectre des protons à l’aide de la commande et du processus zg zéro go avec efp. Ceci inclut la multiplication exponentielle, la décomposition libre d’induction incorporant l’élargissement de ligne, la transformation fourier du FID, et le pk pour appliquer la correction de phase.

Appliquez l’apk de correction de phase automatique et l’absn automatique de correction de ligne de base utilisant l’option polynomiale sans intégration. Créez un nouvel ensemble de données pour l’expérience SOFAST HMBC en sélectionnant SFHMQC3GPPH dans l’expérience. Copiez les P1 et O1 optimisés à partir du spectre des protons et peuplez les impulsions dépendantes P1 en utilisant la commande getprosol 1H p1 plw1, où p1 est la valeur P1 optimisée, et plw1 est le niveau de puissance pour P1. Maintenant, optimisez la constante CNST54 pour définir la compensation pour le changement chimique amide.

Optimisez également CNST55 pour définir la bande passante afin d’englober les régions spectrales d’intérêt, permettant d’optimiser le gain du récepteur. Pour sélectionner ces paramètres, extraire le premier FID du spectre bidimensionnel et rechercher le signal observé pour les définir. En outre, variez le délai de relaxation, le nombre d’analyses et les scans factices pour obtenir une sensibilité acceptable au signal avec la commande gs, ce qui permet d’aller scanner pour surveiller la qualité des données en temps réel.

Enfin, enregistrez les spectres à l’aide de Zero Go zg. Définissez les paramètres de traitement en fonction de la taille des dimensions F2 directes et indirectes F1 du spectre, avec une prévision linéaire facultative dans la dimension indirecte. Sélectionnez QSINE comme fonction Fenêtre et entrez un décalage de cloche sinusoïde de deux pour traiter le spectre bidimensionnel.

Entrez la commande xfb pour traiter les données dans les deux directions avec la fonction fenêtre et la transformation Fourier. Utilisez l’apk2d de commande pour effectuer la correction automatique de phase dans les deux directions. Corrigez la ligne de base avec la fonction de correction de base automatique abs2 pour les données 2D.

Cela applique une fonction polynomiale entre les valeurs ppm définies dans les paramètres de traitement, et produira un spectre 2D pour une analyse plus approfondie. Si vous prévoyez d’effectuer un traitement en série pour la comparaison des données d’interaction avec une autre molécule, stockez les paramètres de traitement avec le wpar de commande et rappelez-les avec rpar. Entrez le pp de commande pour commencer le processus de pic picking.

Définissez la plage de ppm, l’intensité minimale et le nombre maximal de pics en fonction des pics prévus. Ensuite, cliquez sur OK. Vérifiez les résultats par inspection visuelle. Si nécessaire, réédagez le processus jusqu’à ce que les résultats soient satisfaisants en fonction de la qualité des spectres.

Générer une liste de pointe avec la commande pp. Cette liste de pointe contient des informations sur la hauteur des données et l’intensité maximale par défaut. La liste de pointe peut être exportée vers des spectres ultérieurs et peut être lue par d’autres programmes.

Observez maintenant les spectres de la protéine HSQC pour décexer les changements dans les intensités de pointe ou le mouvement des changements chimiques qui indiquent une interaction avec une autre molécule. Si la molécule en interaction est importante, attendez-vous à une réduction des intensités maximales ainsi qu’à la disparition de certains pics. Importez la liste de pointe sur l’ensemble de données suivant en cliquant sur l’onglet pics et en sélectionnant l’importation avec un clic droit dans la fenêtre pics.

Visualisez les pics sur le spectre et, si nécessaire, déplacez-les vers de nouvelles positions. Cliquez sur les intensités de réinitialisation pour une table complète afin de générer une liste de pointe pour le spectre qui inclut les intensités. Cette liste de pointe reporte les informations de position de la liste de pointe stockée.

Exportez les listes de pointe de différents ensembles de données vers une feuille de calcul ou un autre programme mathématique pour analyse en sélectionnant la fonction Export. Calculez le changement des intensités maximales avec l’intensité maximale de la fonction dans le spectre complexe, l’intensité maximale du spectre protéique pour chaque pic. Les valeurs peuvent être converties en pourcentage de variation par multiplication par 100.

Notez que les volumes de pointe sont également utiles, bien que les intensités de pointe soient plus faciles à mesurer pour les pics qui sont placés près les uns des autres, comme c’est habituellement le cas pour les protéines avec une forte densité de pics relativement larges. Les N15HSQCs ont été acquis pour le type sauvage E-PRD, ainsi que le mutant R1914E, en présence ou en l’absence de VimRod. Le spectre de type sauvage E-PRD montre le nombre prévu de pics bien résolus, ce qui indique une protéine correctement pliée.

En présence de VimRod, le spectre montre l’élargissement des lignes étendues et la disparition maximale, correspondant à la liaison entre E-PRD et VimRod. Peu de changement est observé entre le spectre du mutant R1914E sur son propre et sur l’ajout de VimRod, indiquant un manque de liaison à ce mutant E-PRD. Ici, les intensités de pointe e-PRD en présence et en absence de VimRod ont été comparées et tracées comme les intensités de pointe relatives pour indiquer la gamme de pic s’élargissant dans le complexe E-PRD.

Pour valider et quantifier la liaison de VimRod et e-PRD, l’analyse MST utilisant His6-VimRod étiquetée avec le colorant fluorescent RED-tris-NTA comme cible, a été effectuée en utilisant des concentrations décroissantes du ligand E-PRD. Les données étaient adaptées à un modèle standard de liaison ligand d’un site et donnaient un KD de 25,7 plus ou moins 2,1 micromolaires. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des conditions d’acquisition et de traitement identiques.

aura du mal en raison de l’accès à des échantillons de protéines étiquetées isotopiques pour la collecte de spectres RMN. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie du cancer, de l’infection, ou de la maladie neurodegenerative parce qu’elles impliquent la formation des interactions protéiques qui sont compromises dans la maladie.