Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser les plans de glace liés par des protéines antigel marquées par fluorescence. Ceci est réalisé en cultivant des cristaux de glace uniques auxquels les protéines de l’antigel peuvent se lier dans un deuxième temps. Chaque cristal est observé à travers des polariseurs croisés pour établir sa singularité et son orientation.

Ensuite, un cristal de glace est monté sur un doigt froid à température contrôlée et formé en un hémisphère. Il est ensuite immergé dans une solution de protéines antigel marquées par fluorescence afin d’absorber la protéine antigel sur des plans de liaison spécifiques de l’hémisphère en croissance. Les résultats de la glace sont obtenus en visualisant et en imageant la glace liée à une protéine antigel marquée par fluorescence, en utilisant une lumière et des filtres spécifiques à la longueur d’onde dans une chambre froide sombre.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la gravure à la glace, est que les protéines antigel sont marquées par fluorescence Pour permettre une visualisation immédiate des plans de glace liés aux protéines. Commencez la croissance des cristaux en préparant un bain d’éthylène glycol à température contrôlée à moins 0,5 degré Celsius et en trouvant une casserole en métal propre qui s’y insère et peut flotter dessus. Les cristaux sont formés dans des moules. Utilisez des moules cylindriques de trois à quatre centimètres de haut coupés dans un tuyau en polychlorure de vinyle.

Chaque moule doit avoir une encoche d’un millimètre de large et de deux millimètres de haut d’un côté. Appliquez une légère pellicule de graisse sous vide sur le côté de l’anneau à partir duquel l’encoche a été coupée. Scellez cette surface crantée graissée sur la casserole en métal avec l’encoche orientée loin du centre de la casserole.

Assurez-vous de ne pas remplir ou obstruer les encoches avec de la graisse. Préparez autant de moules que possible dans la poêle. Ensuite, ajoutez du dégaz filtré et de l’eau déminéralisée au centre de la casserole à l’extérieur des moules.

Attention à ne pas introduire de bulles. Au fur et à mesure que la couche d’eau est élevée à cinq millimètres, l’eau doit pénétrer lentement dans les moules par les encoches. Une fois terminé, placez la casserole parfaitement à niveau dans le bain d’éthylène glycol.

Une fois que la casserole et l’eau ont atteint moins 0,5 degré Celsius, ajoutez un petit morceau de glace au milieu de la casserole à l’extérieur des moules. Incuber toute la nuit pour former une couche de glace au cours des trois prochains jours. Remettez dans le bain pour ajouter de l’eau dans les moules.

Déposez 13 millilitres de quatre degrés Celsius, du dégazage et de l’eau déminéralisée dans chaque moule. Une fois par jour après avoir ajouté l’eau, réduisez la température du bain d’éthylène glycol. Au quatrième jour, les moules devraient être complètement remplis de glace.

Récupérez les moules et préparez une surface propre pour la glace. Retirez chaque moule de la poêle et poussez le cristal de glace vers l’extérieur. Placez la surface propre avec les moules dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant une heure.

Avant la manipulation. Lorsque la glace est prête, apportez-la dans une chambre froide ou une chambre froide pour déterminer s’il s’agit d’un monocristal. Placez la glace entre deux polariseurs croisés.

Si la glace est un monocristal, aucune fissure ou discontinuité ne doit être visible et la direction de la lumière ne doit pas changer à l’intérieur du cristal. Avec le polariseur toujours en place, déterminez l’orientation de l’axe C en observant la lumière transmise lorsque la glace est en rotation. Pour déterminer l’orientation des AE A, enveloppez la glace hermétiquement dans du papier d’aluminium.

Orientez une aiguille perpendiculairement à l’axe de la mer et percez un petit trou à travers la feuille et dans la glace. Ensuite, placez la glace dans un aspirateur de 0,5 millibar pendant 20 minutes. Une fois le cristal récupéré, découvrez-le dans la chambre froide.

Observez la gravure hexagonale sur le plan basal. Les A AE traversent les sommets de l’étoile à six branches. Ce cristal sera coupé en deux le long d’une ligne parallèle aux points opposés sur l’étoile.

Pour exposer un plan de prisme primaire, tenez le cristal en toute sécurité sur un banc. Utilisez une scie à métaux pour couper le cristal en deux. Récupérez les pièces pour le montage sur un doigt froid.

Le cristal de glace doit être préparé pour le montage sur un doigt froid, trouvez deux tiges d’aluminium de diamètres légèrement différents, mais de taille comparable au doigt froid. Alternez à l’aide des tiges pour faire fondre une cavité dans le haut du cristal lorsqu’il y a une cavité dans laquelle le doigt froid peut s’insérer. Refroidissez le doigt froid à moins 0,5 degré Celsius et placez-le dans la cavité de glace.

Maintenez le cristal en place jusqu’à ce qu’il gèle sur le métal. Ensuite, remplissez une tasse hémisphérique d’environ deux fois le diamètre du cristal de glace avec de l’eau désionisée filtrée refroidie à quatre degrés Celsius. Immergez le cristal de glace froid lié au doigt dans la tasse, retirez l’excès d’eau de sorte que le haut du cristal de glace soit à peu près au niveau du liquide et que la glace ne se touche pas.

Les parois de la tasse recouvrent la tasse d’un isolant et abaissent la température à moins cinq degrés Celsius. Laissez la glace former un hémisphère pendant environ une heure. Préparez-vous à ajouter la protéine fluorescente.

Lorsque l’hémisphère est prêt. Retirez le cristal de glace de la tasse, retirez l’eau de la tasse. Ajoutez ensuite 25 à 30 millilitres de solution protéique prérefroidie marquée par fluorescence à la concentration souhaitée.

Tout en gardant le volume total de liquide inchangé, immergez le cristal de glace dans la tasse. Encore. Assurez-vous que le haut du cristal est au niveau du liquide et ne touche pas les parois de la tasse. Abaissez la température froide des doigts à moins huit degrés Celsius et laissez la solution protéique geler dans le cristal pendant deux à trois heures.

Arrêtez la croissance de la glace lorsqu’au moins cinq millimètres de glace se sont formés à partir de la solution protéique. Avec le doigt froid toujours attaché, retirez le cristal de glace de la tasse. Détachez le doigt froid en chauffant le liquide de refroidissement juste au-dessus de zéro degré Celsius.

Attendez que le cristal de glace fonde. Lorsque le cristal fond du doigt froid, placez-le à plat sur une surface propre. Veillez à ne pas toucher la glace nouvellement formée.

Stockez le cristal à moins 20 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes avant de procéder à la visualisation du travail de fluorescence dans une pièce froide qui peut être obscurcie. Préparez des lampes avec des filtres d’excitation spécifiques à la longueur d’onde pour exciter l’étiquette fluorescente et les filtres d’émission de caméra. Pour bloquer la lumière non spécifique, placez la glace côté plat vers le bas sous les lampes, assombrissez la pièce et observez les motifs dans la glace éclairée.

Pour estimer les plans de glace qui sont liés par les protéines de l’antigel, comparez une image de gravure de glace traditionnelle avec celle du plan de glace correspondant basé sur la fluorescence. L’analyse d’affinité à l’aide de trixy montre toutes deux des protéines antigel de type un produites par la plie rouge pseudo pectus americana. La technique peut être utilisée pour comparer simultanément les motifs de liaison à la glace de différentes protéines d’antigel. Dans ce cas, Pacific Blue a étiqueté de type trois NFEA FP huit et trixy a marqué de type 1.

C’est le résultat de la visualisation de seulement le type trois N-F-E-A-F-P huit, ici seule la protéine antigel de type un est visualisée dans cette image. Les deux sont visualisés ensemble. Notez que l’axe C est le même pour chaque image.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la croissance et de l’orientation des cristaux de glace simples et utiliser l’analyse d’affinité de la plaine de glace basée sur la fluorescence pour évaluer les modèles de liaison de la plaine de glace des protéines antigel marquées par fluorescence.