Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

L’objectif global de cette procédure est de replier un domaine de liaison de ligand chimiorécepteur à partir des corps d’inclusion et de le purifier pour l’utiliser dans des études structurales et fonctionnelles. Pour établir quels signaux un chimiorécepteur bactérien envoie et comment, on peut utiliser les domaines de liaison de ligands isolés pour cribler des banques de petites molécules ou pour déterminer la structure avec et sans ligand. L’inhibition du domaine de liaison du ligand extracellulaire chez E. coli entraîne souvent le dépôt dans les corps d’inclusion.

Ici, nous montrons comment des milligrammes de protéines fonctionnelles peuvent être récupérés à partir des corps d’inclusion. Pour commencer, inoculez 150 mL de bouillon LB stérile contenant 50 microgrammes par mL d’ampicilline avec des cellules RIPL BL21-CodonPlus transformées avec le vecteur D-TOPO pET151 pour l’expression de l’hexahistidine TIp3-LBD. Incuber la culture à 200 tr/min et 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Préparez six fioles Erlenmeyer de 2 L contenant 800 ml de bouillon LB stérile et 50 microgrammes par ml d’ampicilline. Inculquer chaque flacon avec 20 mL de culture pendant la nuit. Incuber les flacons à 37 degrés Celsius en secouant continuellement à 200 tr/min jusqu’à ce que l’OD600 atteigne 0,6.

À ce stade, induisez l’expression des protéines en ajoutant 1 IPTG millimolaire dans chaque flacon. Continuez à couver les flacons à 37 degrés Celsius dans un agitateur à 200 tr/min pendant quatre heures supplémentaires. Récoltez les cellules par centrifugation à 5000 xg et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, jetez le surnageant. Transférez toutes les pastilles de cellules dans un bécher de 250 ml et ajoutez 100 ml de tampon A.Si elles sont congelées, laissez les cellules décongeler complètement, puis remettez les granules en suspension. Conservez l’échantillon sur de la glace, sauf indication contraire.

Ensuite, passez trois fois les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur à haute pression pour lyser les cellules et assurer un cisaillement complet de l’ADN génomique. Ensuite, centrifugez le lysat à 10 000 xg et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Prélever un échantillon d’un mL du surnageant et le conserver à moins 20 degrés Celsius pour une analyse ultérieure de la FDS-PAGE.

Ensuite, jetez le reste du surnageant et placez la pastille sur de la glace. Ensuite, remettez complètement en suspension les corps d’inclusion dans 20 mL de tampon B glacé. Cela facilite la solubilisation de la membrane et des protéines membranaires. Agitez l’échantillon pendant une à deux minutes pour faciliter la remise en suspension.

Après avoir centrifugé l’échantillon, remettez complètement la pastille en suspension dans 20 mL de tampon B glacé en tournant d’abord le tube pendant une à deux minutes. Assurez-vous que le granulé est cassé en petits morceaux. Ensuite, pipetez l’échantillon de haut en bas pour le remettre en suspension.

Centrifuger l’échantillon comme précédemment et jeter le surnageant. Si le surnageant est trouble ou coloré, centrifugez à nouveau l’échantillon et utilisez du tampon B supplémentaire glacé pour le remettre en suspension. Répétez la centrifugation et la remise en suspension jusqu’à ce que le surnageant soit clair et incolore avant de granuler à nouveau.

Ajoutez 20 ml de tampon C glacé à la pastille et remettez-la en suspension en faisant tourbillonner le tube pendant une à deux minutes. Ensuite, après avoir fait tourner l’échantillon, ajoutez 25 mL de tampon dénaturant D. Remettez complètement en suspension les corps d’inclusion en faisant tourbillonner le tube pendant une à deux minutes ou jusqu’à ce que la pastille soit brisée en petits morceaux. Mélangez la suspension par rotation axiale à 30 tr/min et 4 degrés Celsius pendant 30 à 120 minutes.

Clarifier la solution protéique dénaturée par centrifugation à 30 000 xg et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, placez le surnageant sur de la glace et jetez la pastille. Tout en agitant 250 mL de tampon E à 500 tr/min, ajoutez 60 milligrammes de mélange de protéines dénaturées contenant de l’hexahistadine TIp3-LBD.

Incuber le mélange repliable à quatre degrés Celsius en agitant continuellement à 500 tr/min pendant 24 à 48 heures. La concentration finale en protéines est de 0,2 mg par ml. Après avoir préparé sept L de tampon A pré-refroidi et de tube de dialyse conformément au protocole de texte, utilisez la fermeture du tube de dialyse pour serrer une extrémité de la membrane de dialyse et transférez le mélange de dialyse dans le tube.

Ensuite, fixez l’extrémité ouverte et assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites. Placez le tube de dialyse dans un seau de dialyse avec le tampon A pré-refroidi. Ensuite, ajoutez une barre d’agitation magnétique, en vous assurant qu’elle ne touchera pas le tube de dialyse pendant l’agitation. Dialysez l’échantillon à quatre degrés Celsius en agitant continuellement à 500 tr/min et changez le tampon au moins quatre fois sur une période de 12 heures.

Après le dernier changement de tampon, laissez l’échantillon dialyser pendant la nuit. Le lendemain matin, retirez le tube de dialyse du seau et transférez son contenu dans un bécher de 500 ml. Conservez la solution protéique sur de la glace, sauf indication contraire.

Filtrez la solution protéique à travers une membrane de la taille d’un pore de 0,43 micron dans une bouteille en verre de 500 ml pour éliminer toute protéine précipitée. Après le lavage, le chargement et l’équilibrage d’une colonne chélatrice conformément au protocole de texte, ajuster l’échantillon de protéine replié obtenu à la composition du tampon F en ajoutant 25 mL de chlorure de sodium 5M, 2,5 mL de 1 M tris-HCl, pH 8,0 et 2,5 mL de solutions mères d’imidazole 2 M. Chargez l’échantillon sur la colonne à une vitesse de 5 mL par minute ou moins et jetez le flux qui contient les protéines non liées.

Ensuite, laver la colonne avec 50 à 100 mL de tampon F pour éliminer les protéines non spécifiquement liées et jeter le flux. Éluez l’hexahistadine TIp3-LBD avec 25 mL de tampon G.Ensuite, regroupez les fractions à circulation contenant la protéine. Après avoir préparé le tampon H et la tubulure de dialyse conformément au protocole de texte, ajoutez la protéase TEV marquée à l’hexahistadine à la protéine marquée à l’hexahistadine dans la tubulure.

Ajoutez un rapport molaire final d’un TEV pour huit de protéines. Placez le tube de dialyse clampé dans les quatre L pré-refroidis du tampon H et incubez-le à quatre degrés Celsius en remuant continuellement pendant deux heures. Ensuite, changez le tampon et poursuivez la dialyse pendant la nuit pour permettre à la réaction de clivage médiée par TEV de se terminer.

Après avoir remplacé le tampon I, filtré la solution protéique et ajusté à nouveau l’échantillon, chargez l’échantillon sur une colonne HP chélatrice HiTrap préparée de cinq ml. À un débit de cinq mL par minute, recueillir le flux qui contient le TIp3-LBD non étiqueté. Sur la protéine clivée, l’étiquette hexahistadine clivée et la TEV hexahistadine sont retenues par la colonne.

Utilisez cinq mL de tampon F pour laver la colonne afin de permettre à la protéine non marquée de s’écouler et de recueillir l’éluat. Ensuite, après avoir équilibré une colonne d’exclusion de taille et concentré et clarifié l’échantillon de protéines conformément au protocole de texte, chargez l’échantillon sur la colonne de filtration sur gel 26/60 pré-équilibrée. Appliquez le tampon A à un débit de quatre mL par minute et surveillez la trace UV pour l’élution des protéines.

TIp3-LBD élue à un volume de rétention de 210 à 220 mL. Enfin, après chromatographie, regrouper les fractions puis mesurer la concentration en protéines et réaliser SDS-PAGE. La procédure d’isolement des protéines démontrée dans cette vidéo a donné 10 à 20 mg de TIp3-LBD pur non marqué par litre de culture bactérienne.

Comme on le voit ici, la protéine éluée de la colonne de filtration du gel a un seul pic symétrique, correspondant à un volume de rétention de 220 mL avec un poids moléculaire calculé de 29 kDa. Comme le montre ici SDS-PAGE, les corps d’inclusion contenaient principalement de l’hexahistadine TIp3-LBD avec un poids moléculaire apparent de 28 kDa, ce qui est proche de la valeur calculée à partir de la séquence d’acides aminés de 31,8 kDa. Les étapes d’élimination des étiquettes hexahistadines, de chromatographie d’affinité et de filtration sur gel ont donné des protéines très pures.

La spectroscopie CD à l’aide de CDSSTR a révélé que la structure secondaire de l’hexahistidine TIp3-LBD était composée de 31 % d’hélice alpha et de 23 % de feuillets bêta. Celles-ci étaient également proches des valeurs prédites de 37 % et 26 % respectivement par l’analyse de séquence à l’aide du serveur JPred 3. Ce protocole nécessite un minimum de cinq jours du début à la fin, et peut être interrompu si nécessaire à trois étapes différentes.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler qu’une remise en suspension complète et complète des corps d’inclusion dans le tampon de dénaturation par vortex ou pipetage de haut en bas est essentielle pour toute cette réalisation. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de replier et de purifier le domaine de liaison du ligand du chimiorécepteur TIp3. La protéine purifiée peut être utilisée pour lier les acides afin d’étudier la spécificité du ligand pour ce récepteur.

De plus, nous avons déjà montré que la protéine obtenue par cette procédure pouvait être utilisée pour produire des cristaux hautement ordonnés, ce qui a ouvert la voie à l’étude de la base structurelle de sa spécificité de ligand. Cette procédure pourrait être généralement utile pour la production de quantités de mg de chimiorécepteurs à partir d’autres bactéries sous une forme cristallisable et soluble. Nous avons utilisé ce protocole dans sa forme originale ou légèrement modifiée pour replier et purifier le domaine de liaison du ligand d’autres chimiorécepteurs de ce type pour des études cristallographiques.

N’oubliez pas que dans chaque cas particulier, l’optimisation du protocole, par exemple, la composition des tampons de dénaturation et de repliement et les temps d’incubation seront probablement nécessaires.