Name: Modélisation de ligands dans des cartes dérivées de la cryomicroscopie électronique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez la modélisation de petites molécules ligands dans les cartes cryoEM de macromolécules. Cette méthode computationnelle améliore la compréhension des interactions médicamenteuses et accélère la découverte de médicaments.

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SJ est récipiendaire d’une bourse de doctorat de DAE-TIFR, et le financement est reconnu. KRV reconnaît la subvention DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 et le soutien du Département de l’énergie atomique du gouvernement de l’Inde, dans le cadre de l’identification du projet n°. RTI4006.

Modélisation de ligands de petites molécules dans des cartes CryoEM de macromolécules

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les améliorations apportées au matériel et aux logiciels des microscopes ont entraîné une augmentation du nombre de structures cryoEM au cours des dernières années. Bien que la résolution la plus élevée atteinte à l’heure actuelle dans la cryoEM à particule unique soit de 1,2 Å 57,58,59, la majorité des structures sont déterminées autour de la résolution de 3-4 Å. La modélisation de ligands dans des cartes à moyenne et basse résolution peut être délicate et souvent pleine d’ambiguïté. Compte tenu de l’utilisation généralisée de la cryoEM dans le monde universitaire et l’industrie pharmaceutique pour la recherche translationnelle et la découverte de médicaments, il est essentiel de s’assurer que les ligands sont modélisés correctement et sans ambiguïté. Ainsi, il est prudent de quantifier la résolvabilité des atomes de ligand en calculant les Q-scores60, qui sont maintenant disponibles dans l’EMDB en tant que métrique pour évaluer la qualité des cartes et l’ajustement du modèle ainsi que dans Chimera.
Dans le premier exemple, ChimeraX a été utilisé pour calculer la carte de différence dans l’espace réel entre l’apo et les cartes liées au ligand dans l’enzyme énolase de M. tuberculosis. La densité supplémentaire à un seuil élevé suggère la présence du ligand, le phosphoénolpyruvate, dans le site actif et du Mg2+ lié au ligand. Il est important de noter que, dans ce cas, la carte est de résolution moyenne (3,2 Å) et que les molécules d’eau ne peuvent pas être modélisées avec certitude (Figure 1). La limitation associée à cette méthode est qu’elle ne peut être appliquée que lorsque la liaison du ligand n’induit pas de changements conformationnels significatifs dans la protéine. La normalisation de la carte n’a pas été effectuée dans ce cas, car les ensembles de données apo et liés au ligand ont été acquis à la même taille de pixel et traités avec des paramètres identiques dans Relion. Cependant, il convient de noter que lorsque l’on compare des cartes générées par différents programmes de reconstruction, tels que Relion46,47 et CryoSparc61, ou avec une qualité différente, la normalisation des cartes devient essentielle avant que des comparaisons significatives puissent être effectuées.
L’exemple suivant est mGlu5, qui subit une grande réorganisation moléculaire lors de la liaison de l’agoniste, comme en témoignent les structures cryoEM51,62 (Figure 2). Dans ce scénario, il n’est pas possible de calculer une simple carte de différence entre les récepteurs non liés (apo) et liés au ligand en raison de différences substantielles entre les cartes. Ici, Servalcat, qui utilise des demi-cartes non nettes et non pondérées comme données d’entrée pour l’affinement dans l’espace réciproque et calcule ensuite une carte de différence entre l’application expérimentale et la carte dérivée du modèle, a été utilisé. À un seuil élevé, on peut visualiser les différences et servir de guide pour la correction et l’amélioration du modèle. Plusieurs taches non modélisées dans le domaine extracellulaire et près du domaine transmembranaire de mGlu5 ont été observées et utilisées comme guide pour modéliser les ligands (Figure 2).
Le troisième exemple montre comment la résolution (2,3 Å) joue un rôle crucial dans l’interprétation cartographique et la modélisation d’un inhibiteur de la taille d’un fragment dans la β-galactosidase. Ici, le défi était d’identifier un très petit ligand (<200 Da) dans la carte des différences de Servalcat au milieu du bruit inhérent aux données et de le modéliser avec précision. En plus de la haute résolution globale déterminée à l’aide de la corrélation de la coquille de Fourier (FSC), la résolution locale spécifique au ligand était également suffisamment élevée pour assurer un placement précis des centres chiraux des ligands (Figure 3). La densité des molécules de solvant a été observée dans la carte des différences tout au long de l’enzyme et en particulier autour du ligand. L’effet de la résolution sur la modélisation des ligands et des atomes de solvant a également été démontré (Figure 4). Il est important de faire preuve de prudence lors de la modélisation de molécules d’eau ou de solvant, car, à l’occasion, le bruit à un seuil bas peut ressembler à celui de l’eau ou des molécules de solvant, ce qui peut entraîner des erreurs d’interprétation.
Une autre considération importante est que les cartes cryoEM seules peuvent ne pas être suffisantes pour identifier avec précision un ion métallique à elles seules. Des méthodes biophysiques supplémentaires telles que la structure fine d’absorption étendue des rayons X (EXAFS) ou la spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX) sont souvent nécessaires pour confirmer la présence et l’identité de l’ion métallique. Dans les enzymes énolase et β-galactosidase, le Mg2+ a été modélisé en raison de la richesse des informations déjà disponibles sur ces protéines, confirmant l’identité de l’ion métallique. De plus, la coordination des ions métalliques dans ces cas, illustrée par la géométrie octaédrique classique et les distances de coordination presque idéales de Mg2+, a fourni une preuve substantielle de leur identité.
En général, quelques considérations importantes doivent être prises en compte lors de la modélisation des ligands dans les cartes cryoEM. Pour commencer, il est important de choisir la bonne carte pour l’identification et la modélisation des ligands. Dans tous les cas, il est conseillé d’utiliser une carte ou une demi-carte non accentuée et non pondérée sur une carte accentuée et pondérée pour visualiser la densité des ligands, car l’accentuation et la pondération pourraient entraîner des régions sous-accentuées ou sur-accentuées (bruit dû à la terminaison de série) dans la carte. Cela peut entraîner une densité de ligand sous-optimale, et l’utilisation de différents facteurs B peut être utilisée pour évaluer la densité lors de la construction du modèle en foulque. Bien qu’il y ait un risque à utiliser la carte affinée pour identifier les ligands dans une carte cryoEM, la carte non affinée peut ne pas montrer tous les détails de la densité des ligands, mais peut être utilisée à des fins de démonstration, comme le montrent les figures 1B et C.
La pose du ligand modélisé doit être validée, en particulier dans les cas où les données sont faibles. Comme le montre ici pour mGlu5, la résolution locale varie sur la carte cryoEM, et la modélisation impartiale du ligand peut être difficile. Servalcat peut être utilisé comme un outil précieux pour détecter les inexactitudes potentielles dans la modélisation des protéines et des ligands22.
L’hétérogénéité de composition peut être présente dans un complexe protéine-ligand où seule une population spécifique peut avoir le ligand présent (si le ligand est de faible poids moléculaire, l’étape de classification peut ne pas supprimer l’hétérogénéité). Néanmoins, il est important d’effectuer la classification 3D63 étapes de manière itérative pendant le traitement de l’image avant la modélisation du ligand et de vérifier si la densité du ligand s’améliore. Si plusieurs copies de la protéine sont présentes, il faut faire preuve de prudence lors de l’application de la symétrie sur la carte lors de la génération et de l’affinement initiaux du modèle, car cela peut permettre de calculer la densité des ligands dans toutes les molécules liées à la symétrie. La symétrie ne doit être imposée qu’après que la carte a été minutieusement inspectée pour confirmer la présence de densité de ligands dans toutes les chaînes protéiques.
Selon l’état (cristal ou solution) et l’emplacement (enterré ou surface), les atomes peuvent être dynamiques, et dans le raffinement du modèle, on parle de paramètre de déplacement atomique (ADP). En plus de la carte des différences, qui fournit des indices visuels sur d’éventuelles inexactitudes dans le modèle, les valeurs ADP peuvent être utilisées pour évaluer la précision des ligands après raffinement 64,65,66,67. En règle générale, le ligand doit avoir des valeurs ADP similaires à celles des résidus environnants, c’est-à-dire s’ils sont liés de manière stable et modélisés avec précision. Cependant, les ligands à la périphérie ou les atomes d’un ligand (comme les lipides) qui sont éloignés des macromolécules peuvent avoir des valeurs ADP plus élevées. En plus d’affiner les coordonnées, Refmac33,34 et Phenix permettent tous deux d’affiner les valeurs ADP 28,68. Dans Refmac, l’approximation de Mott-Bethe est utilisée pour calculer le facteur de diffusion des électrons des atomes individuels lors du calcul de la carte. Dans la version récente de Phenix, le raffinement individuel du facteur B, similaire à la cristallographie, a été introduit pour tenir compte du désordre atomique. Très souvent, dans les modèles affinés dérivés de cryoEM, une large gamme de valeurs ADP est observée (parfois des valeurs proches de zéro), et même le Q-score utilisé dans EMDB pour évaluer l’ajustement du modèle avec la carte dépend de la carte primaire déposée et de la nature de l’affûtage du facteur B60. Dans la construction de modèles cryoEM, plusieurs cartes sont souvent utilisées, et donc, les cartes utilisées dans la modélisation et le raffinement doivent clairement être mentionnées dans les méthodes, car en raison de la résolution anisotrope dans de nombreuses macromolécules, une seule carte peut ne pas être suffisante pour expliquer tous les détails. 
Dans la modélisation des ligands dans les macromolécules, l’une des principales limites des cartes cryoEM (comme en cristallographie) est que si le site de liaison du ligand est de faible résolution ou si le ligand lié est dynamique, il peut s’avérer difficile de déterminer la conformation correcte. De plus, la plupart des structures cryoEM ont des résolutions inférieures à 3 Å, et la représentation des molécules d’eau dans les cartes est limitée, ce qui rend difficile l’évaluation du rôle de l’hydratation dans la liaison d’un ligand ou d’un médicament (comme le montrent ici les exemples de l’énolase et du mGluR). Des méthodes de calcul peuvent être utilisées en combinaison avec des données cryoEM pour remédier à ces limites69. Contrairement à la cristallographie, seul le modèle est affiné, pas la carte. À l’heure actuelle, la seule méthode pour indiquer la présence d’un ligand ou assurer une modélisation précise consiste à générer des cartes omises (à l’aide d’outils comme Servalcat). Ainsi, il existe un certain nombre d’outils pour aider les chercheurs à construire et à évaluer le modèle, mais il existe plusieurs domaines dans l’affinement du modèle où l’on peut s’attendre à de nouvelles approches ou à des modifications des approches actuelles dans un avenir proche.
Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur les approches actuelles de modélisation des ligands, qui comprennent l’inspection manuelle de la densité du ligand, la génération du fichier de géométrie du ligand, suivie de la modélisation du ligand dans la carte cryoEM. Il s’agit d’une période passionnante en biologie structurale et dans la découverte de médicaments, car des détecteurs d’électrons directs avec des fréquences d’images plus rapides et l’utilisation d’une acquisition de données plus rapide70 ont permis d’obtenir des cartes à haute résolution (<2,8 Å) de plusieurs macromolécules souvent liées à des ligands de petites molécules dans un temps relativement court. L’introduction récente d’outils automatisés de modélisation de ligands tels que GEMspot69 dans la suite Schrödinger et EMERALD17 dans la suite Rosetta, qui tentent de trouver la position liée la plus probable du ligand tout en tenant compte des données expérimentales de cryoEM, promet de rationaliser et d’automatiser ce processus. À l’instar de la cristallographie aux rayons X, il est envisagé que l’identification des modes de liaison des ligands de petites molécules par cryoEM, peut-être deux ou plus en une seule journée, deviendra une possibilité réaliste.

Les cellules accomplissent leurs fonctions en effectuant d’innombrables réactions chimiques simultanément et indépendamment, chacune méticuleusement régulée pour assurer leur survie et leur adaptabilité en réponse aux signaux environnementaux. Ceci est réalisé par la reconnaissance moléculaire, qui permet aux biomolécules, en particulier aux protéines, de former des complexes transitoires ou stables avec d’autres macromolécules ainsi qu’avec de petites molécules ou des ligands1. Ainsi, les interactions protéine-ligand sont fondamentales pour tous les processus de la biologie, qui comprennent la régulation de l’expression et de l’activité des protéines, la reconnaissance des substrats et des cofacteurs par les enzymes, ainsi que la façon dont les cellules perçoivent et relaient les signaux 1,2. Une meilleure compréhension des propriétés cinétiques, thermodynamiques et structurelles du complexe protéine-ligand révèle la base moléculaire de l’interaction des ligands et facilite également la conception rationnelle de médicaments en optimisant l’interaction et la spécificité des médicaments. Une approche économique et plus rapide pour étudier l’interaction protéine-ligand consiste à utiliser l’amarrage moléculaire, qui est une méthode computationnelle qui crible virtuellement une gamme variée de petites molécules et prédit le mode de liaison et l’affinité de ces ligands pour cibler les protéines3. Cependant, les preuves expérimentales provenant de structures à haute résolution déterminées par diffraction des rayons X (DRX), résonance magnétique nucléaire (RMN) ou cryomicroscopie électronique (cryoEM) fournissent la preuve essentielle de ces prédictions et aident au développement d’activateurs ou d’inhibiteurs plus récents et plus efficaces pour une cible donnée. Cet article utilise l’abréviation « cryoEM » comme on l’appelle communément. Cependant, il y a un débat en cours sur le choix de la bonne nomenclature, et récemment, le terme cryogénique-échantillon Electron Microscopie (cryoEM) a été proposé pour indiquer que l’échantillon est à température cryogénique et imagé avec des électrons4. De même, les cartes dérivées de la cryoEM ont été appelées potentiel électron, potentiel électrostatique ou potentiel de Coulomb, et pour simplifier, nous utilisons ici les cartes cryoEM 5,6,7,8,9,10.
Bien que la XRD ait été la technique de référence dans la détermination de la structure à haute résolution des complexes protéine-ligand, la cryoEM post-révolutionde résolution 11 a pris de l’ampleur, comme l’indique l’augmentation des cartes de potentiel de Coulomb ou des cartes cryoEM déposées dans la base de données de microscopie électronique (EMDB)12,13 au cours des dernières années14. En raison des progrès réalisés dans les méthodes de préparation des échantillons, d’imagerie et de traitement des données, le nombre de dépôts de la banque de données sur les protéines (PDB)14 utilisant la cryoEM est passé de 0,7 % à 17 % entre 2010 et 2020, avec environ 50 % des structures signalées en 2020 déterminées à une résolution de 3,5 Å ou mieux15,16. La cryoEM a été rapidement adoptée par la communauté de la biologie structurale, y compris l’industrie pharmaceutique, car elle permet l’étude de macromolécules biologiques flexibles et non cristallines, en particulier les protéines membranaires et les complexes multiprotéiques, à une résolution quasi atomique, surmontant le processus de cristallisation et obtenant des cristaux bien diffractant nécessaires à la détermination de la structure à haute résolution par DRX.
La modélisation précise du ligand dans la carte cryoEM est primordiale, car elle sert de modèle du complexe protéine-ligand au niveau moléculaire. Il existe plusieurs outils automatisés de construction de ligands utilisés en cristallographie aux rayons X qui dépendent de la forme et de la topologie de la densité du ligand afin d’ajuster ou de construire le ligand dans la densité électronique 17,18,19,20. Néanmoins, si la résolution est inférieure à 3 Å, ces approches ont tendance à produire des résultats moins souhaitables car les caractéristiques topologiques dont elles dépendent pour la reconnaissance et la construction deviennent moins définies. Dans de nombreux cas, ces méthodes se sont avérées inefficaces pour modéliser avec précision les ligands dans des cartes cryoEM, car ces cartes ont été déterminées dans la gamme de résolution faible à moyenne, généralement entre 3,5 Å-5 Å17.
La première étape de la détermination de la structure 3D d’un complexe protéine-ligand par cryoEM consiste soit à co-purifier le ligand avec la protéine (lorsque le ligand a une affinité de liaison élevée avec la protéine), soit à incuber la solution protéique avec le ligand pendant une durée spécifique avant la préparation de la grille. Ensuite, un petit volume d’échantillon est placé sur une grille TEM perforée nettoyée au plasma, suivie d’une congélation instantanée dans de l’éthane liquide et enfin d’une imagerie avec un cryo-TEM. La moyenne des images de projection 2D de centaines de milliers à des millions de particules individuelles est calculée pour reconstruire une carte de potentiel de Coulomb en 3D (3D) de la macromolécule. L’identification et la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans ces cartes posent des défis importants dans de nombreux cas en raison de la résolution anisotrope sur l’ensemble de la carte (c’est-à-dire que la résolution n’est pas uniforme sur l’ensemble de la macromolécule), de la flexibilité dans la région où le ligand est lié et du bruit dans les données. De nombreux outils de modélisation, d’affinement et de visualisation qui ont été développés pour la DRX sont maintenant adaptés pour être utilisés dans la cryoEM aux mêmes fins 18,19,20,21. Dans cet article, nous présentons un aperçu des différentes méthodes et logiciels actuellement utilisés pour identifier les ligands, construire des modèles et affiner les coordonnées dérivées de la cryoEM. Un protocole étape par étape a été fourni pour illustrer les processus impliqués dans la modélisation de ligands à l’aide de complexes protéine-ligand spécifiques avec une résolution et une complexité variables.
La première étape de la modélisation des ligands dans les cartes cryoEM comprend l’identification de la densité du ligand (non-protéine) dans la carte. Si la liaison du ligand n’induit aucun changement de conformation dans la protéine, le calcul d’une simple carte de différence entre le complexe protéine-ligand et l’apo-protéine met essentiellement en évidence les régions de densité supplémentaire, suggérant la présence du ligand. De telles différences peuvent être observées immédiatement, car il suffit de deux cartes, et même des cartes intermédiaires pendant le processus de raffinement 3D peuvent être utilisées pour vérifier si le ligand est présent. De plus, si la résolution est suffisamment élevée (<3,0 Å), la carte des différences peut également fournir des informations sur l’emplacement des molécules d’eau ainsi que des ions interagissant avec le ligand et les résidus protéiques.
En l’absence de la carte apo-protéine, il est maintenant possible d’utiliser Servalcat22, qui est disponible en tant qu’outil autonome et a également été intégré dans la suite logicielle CCP-EM 23,24 dans le cadre du raffinement de Refmac et dans CCP4 8.0 version25,26. Servalcat permet le calcul d’une carte de différence pondérée FSC (Fo-Fc) en utilisant les demi-cartes non nettes et le modèle d’apoprotéine comme entrée. La carte omise Fo-Fc représente la disparité entre la carte expérimentale (Fo) et la carte dérivée du modèle (Fc). En l’absence d’un ligand dans le modèle, une densité positive dans une carte Fo-Fc qui chevauche la carte EM expérimentale suggère généralement la présence du ligand. L’hypothèse ici est que la chaîne protéique est bien ajustée sur la carte, et que la densité positive restante indique l’emplacement du ligand. Cependant, il est important d’examiner méticuleusement si la densité positive provient d’inexactitudes de modélisation, telles que le mauvais rotamère d’une chaîne latérale de protéines.
La deuxième étape consiste à obtenir ou à créer un fichier de coordonnées cartésiennes du ligand avec une géométrie bien définie à partir des informations chimiques disponibles. Les ligands standard (par exemple, ATP et NADP+) qui sont déjà disponibles dans la bibliothèque de monomères CCP4 peuvent être utilisés pour le raffinement en récupérant les fichiers de coordonnées et de géométrie via leur code d’accession de monomère. Cependant, pour les ligands inconnus ou non standard, divers outils sont disponibles pour créer les fichiers de géométrie. Parmi les exemples, citons l’eLBOW27 - (constructeur de ligands électroniques et atelier d’optimisation) dans Phenix28, Lidia - un outil intégré dans Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-un module de Glide au sein de la suite Schrödinger. Le fichier de coordonnées du ligand est ensuite ajusté dans la densité, guidé à la fois par la carte expérimentale cryoEM et la carte de différence dans Coot. Vient ensuite le raffinement dans l’espace réel dans Phenix28 ou le raffinement réciproque dans Refmac33. Un poste de travail Linux ou un ordinateur portable équipé d’une bonne carte graphique et des logiciels mentionnés ci-dessus est nécessaire. La plupart de ces programmes sont inclus dans diverses suites. CCP-EM24 et Phenix28 sont disponibles gratuitement pour les utilisateurs universitaires et incluent une variété d’outils qui sont utilisés dans cet article, notamment Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. De même, Chimera37 et ChimeraX38 fournissent des licences gratuites aux utilisateurs universitaires.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>Consortium de plusieurs instituts</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>Gratuit pour les utilisateurs académiques et comprend Coot et une liste d’outils développés pour la cristallographie aux rayons X</td></tr> Le <tr>consortium<td>CCP-EM</td><td>de plusieurs instituts</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>Gratuit pour les utilisateurs académiques et comprend Coot, Relion et bien d’autres</td></tr><tr><td>Coot.</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>Logiciel général pour la construction de modèles mais également disponible avec d’autres suites décrites ci-dessus</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>Consortium de plusieurs instituts</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>Logiciel à l’intérieur de la suite Phenix pour l’amarrage du modèle dans les cartes cryoEM</td></tr><tr><td>Banque de données de microscopie électronique&nbsp ;</td><td>Consortium de plusieurs instituts</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>Public Repository for Electron Microscopy</td></tr><tr><td>Maps Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>Commercial, appareil photo de Thermo Fisher</td></tr><tr><td>Phenix&nbsp ;</td><td>Consortium de plusieurs instituts</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>Gratuit pour les utilisateurs académiques et comprend la</td></tr><tr><td>banque de données</td> sur les protéines <td>Macrote Consortium de plusieurs instituts</td><td>https://rcsb.org</td><td>Base de données publique des structures macromoléculaires</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrödinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>Outil de visualisation moléculaire. La version éducative est gratuite mais comporte des limitations. La version complète peut être obtenue moyennant des frais minimes.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>Logiciel pour le traitement d’images cryoEM, également disponible avec CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific.</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp ; gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Commercial, cryoTEM de Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, États-Unis</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>Logiciel à usage général pour l’affichage, l’analyse et plus</td></tr> encore <tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Logiciel à usage général pour l’affichage, l’analyse et plus encore</td></tr></tbody></table>

modélisation de ligands dans des cartes dérivées de la cryomicroscopie électronique

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Déchiffrer les interactions protéine-ligand dans un complexe macromoléculaire est crucial pour comprendre le mécanisme moléculaire, les processus biologiques sous-jacents et le développement de médicaments. Ces dernières années, la microscopie électronique cryogénique d’échantillon (cryoEM) est apparue comme une technique puissante pour déterminer les structures des macromolécules et pour étudier le mode de liaison des ligands à une résolution proche de l’atome. L’identification et la modélisation de molécules non protéiques dans les cartes cryoEM sont souvent difficiles en raison de la résolution anisotrope de la molécule d’intérêt et du bruit inhérent aux données. Dans cet article, les lecteurs sont initiés à divers logiciels et méthodes actuellement utilisés pour l’identification des ligands, la construction de modèles et l’affinement des coordonnées atomiques à l’aide de macromolécules sélectionnées. L’une des façons les plus simples d’identifier la présence d’un ligand, comme illustré avec l’enzyme énolase, est de soustraire les deux cartes obtenues avec et sans le ligand. La densité supplémentaire du ligand est susceptible de se démarquer dans la carte des différences, même à un seuil plus élevé. Il y a des cas, comme le montre le cas du récepteur métabotropique du glutamate mGlu5, où de telles cartes de différences simples ne peuvent pas être générées. La méthode récemment introduite pour dériver la carte d’omission Fo-Fc peut servir d’outil pour valider et démontrer la présence du ligand. Enfin, en utilisant l’exemple bien étudié de la β-galactosidase, l’effet de la résolution sur la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans les cartes cryoEM est analysé, et une perspective sur la façon dont la cryoEM peut être utilisée dans la découverte de médicaments est présentée.

Ce protocole présente les outils disponibles pour la modélisation de ligands de petites molécules dans les cartes cryoEM des macromolécules.

Modélisation de ligands dans des cartes dérivées de la cryomicroscopie électronique

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

Nous nous intéressons à la compréhension des processus physiologiques qui se produisent dans la cellule, en particulier à l’interface membranaire. Nous utilisons la cryo-EM comme technique principale et travaillons sur divers problèmes biologiques intéressants et stimulants en étudiant plusieurs complexes macromoléculaires. Il y a quelques décennies, il était difficile de déterminer les structures des protéines membranaires et d’autres complexes labiles.Cependant, les progrès techniques de la cryo-EM, un nouveau détergent et mimétique des lipides et doté de dotations, ont ouvert la voie à la détermination rapide de la structure de ces complexes. Ces structures peuvent maintenant être obtenues à haute résolution et potentiellement utilisées dans la découverte de médicaments. Dans la cryo-EM à particules uniques, les défis comprennent l’acquisition d’un échantillon stable et homogène, l’intégration de l’échantillon dans une orientation aléatoire dans de la glace mince, le traitement d’un grand nombre d’images avec un faible rapport signal/bruit et la détermination précise de l’orientation angulaire et de la classification lors de la reconstruction 3D.L’identification et la modélisation de petites molécules dans les cartes cryo-EM des complexes de protéines de ligand sont difficiles en raison du bruit inhérent aux données, de la résolution isotrope et faible de la carte, de l’hétérogénéité de l’échantillon et de la flexibilité des ligands. Ce protocole est un guide étape par étape pour l’identification et la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans la cryo-EM à basse et moyenne résolution.

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