Modélisation de ligands dans des cartes dérivées de la cryomicroscopie électronique
19 juillet 2024
Ce protocole présente les outils disponibles pour la modélisation de ligands de petites molécules dans les cartes cryoEM des macromolécules.
Nous nous intéressons à la compréhension des processus physiologiques qui se produisent dans la cellule, en particulier à l’interface membranaire. Nous utilisons la cryo-EM comme technique principale et travaillons sur divers problèmes biologiques intéressants et stimulants en étudiant plusieurs complexes macromoléculaires. Il y a quelques décennies, il était difficile de déterminer les structures des protéines membranaires et d’autres complexes labiles.
Cependant, les progrès techniques de la cryo-EM, un nouveau détergent et mimétique des lipides et doté de dotations, ont ouvert la voie à la détermination rapide de la structure de ces complexes. Ces structures peuvent maintenant être obtenues à haute résolution et potentiellement utilisées dans la découverte de médicaments. Dans la cryo-EM à particules uniques, les défis comprennent l’acquisition d’un échantillon stable et homogène, l’intégration de l’échantillon dans une orientation aléatoire dans de la glace mince, le traitement d’un grand nombre d’images avec un faible rapport signal/bruit et la détermination précise de l’orientation angulaire et de la classification lors de la reconstruction 3D.
L’identification et la modélisation de petites molécules dans les cartes cryo-EM des complexes de protéines de ligand sont difficiles en raison du bruit inhérent aux données, de la résolution isotrope et faible de la carte, de l’hétérogénéité de l’échantillon et de la flexibilité des ligands. Ce protocole est un guide étape par étape pour l’identification et la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans la cryo-EM à basse et moyenne résolution.
Aperçu
Ce protocole présente les outils disponibles pour modéliser des ligands de petites molécules dans des cartes cryoME de macromolécules. L'étude se concentre sur la compréhension des processus physiologiques à l'interface membranaire en utilisant la cryoME pour répondre à divers défis biologiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microscopie électronique cryogénique (cryoME)
- Complexes macromoléculaires
- Découverte de médicaments
Contexte
- Compréhension des processus physiologiques au niveau cellulaire.
- Difficultés liées à la détermination des structures des protéines membranaires.
- Progrès réalisés dans les techniques de cryomicroscopie électronique (cryoME).
- Importance des structures à haute résolution pour la découverte de médicaments.
Objectif de l'étude
- Modéliser des ligands de petites molécules dans des cartes de cryoME.
- Améliorer la compréhension des structures des protéines membranaires.
- Faciliter la détermination rapide de la structure de complexes instables.
Méthodes utilisées
- Technique de cryo-MET en microscopie de particules individuelles.
- Incorporation des échantillons dans une couche de glace mince.
- Traitement d'images à faible rapport signal sur bruit.
- Reconstruction 3D et classification selon l'orientation angulaire.
Résultats principaux
- Obtention de structures à haute résolution de protéines membranaires.
- Modélisation réussie de ligands de petite taille dans des cartes cryoME.
- Surmontage des défis liés à la stabilité et à l'homogénéité des échantillons.
- Progrès du potentiel de découverte de médicaments grâce aux données structurales.
Conclusions
- La cryo-microscopie électronique est un outil puissant pour l'étude des complexes macromoléculaires.
- La modélisation des ligands améliore la compréhension des interactions médicamenteuses.
- Les progrès techniques continuent d'améliorer la recherche en biologie structurale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La modélisation à haute résolution des interactions protéine-ligand à l'aide de cartes cryoME devient essentielle pour la découverte précoce de médicaments et l'analyse mécanistique des risques. La capacité à identifier et affiner précisément la fixation du ligand dans des assemblages macromoléculaires complexes renforce la confiance prédictive dans la validation de la cible et oriente les décisions de tri du portefeuille. L'intégration de flux de travail avancés de cryoME permet aux équipes de biopharmacie de lever les ambiguïtés structurales et d'accélérer l'identification de candidats fondés sur la structure.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet la visualisation directe des sites de fixation des ligands et des réseaux d'interaction dans les complexes macromoléculaires.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en clarifiant la base structurale de l'engagement de la cible.
- Améliore la confiance prédictive pour la validation fonctionnelle des cibles et le tri ultérieur.
Développement de criblages et de tests
- Facilite la préparation de modèles structuraux validés pour les flux de travail de criblage computationnel et expérimental.
- Permet l'identification reproductible de densités de ligands et l'évaluation quantitative des modes de liaison.
- Prend en charge la standardisation des tests en fournissant des structures de référence pour les états liés au ligand et les états apo.
Recherche translationnelle et préclinique
- Associe les données structurales à des systèmes pertinents pour la maladie en modélisant des complexes physiologiquement importants.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en soutenant une optimisation guidée par la structure.
- Réduit le risque de translation en confirmant l'interaction du ligand avec des assemblages biologiques pertinents.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce flux de travail de modélisation de ligands basé sur la cryoME comble le fossé entre la découverte précoce, l'identification de candidats et la recherche préclinique en fournissant des données structurales hautement fiables pour les tests d'hypothèses et l'optimisation des composés.
- Biologie de la découverte : Permet l'interrogation fondée sur des hypothèses de la liaison des ligands et de la modulation des voies.
- Criblage : Fournit des cartes quantitatives reproductibles de densité des ligands pour l'analyse comparative.
- Analytique : Fournit des coordonnées atomiques affinées et des cartes de différence pour appuyer l'évaluation statistique des événements de liaison.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes structurales à des cibles pertinentes pour les maladies et à des stratégies de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Établit un flux de travail normalisé et évolutif pour les initiatives continues de conception de médicaments fondées sur la structure.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Normalise la modélisation et l'optimisation des ligands pour divers systèmes protéiques.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et améliore l'efficacité du capital en réduisant les risques structurels en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des cibles validées structurellement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en traitement des données de cryoME, en construction et en affinement de modèles.
- Exige un accès à une infrastructure informatique haute performance et à des outils de visualisation.
- Implique une standardisation interéquipes des seuils de cartes, des critères de validation et de l'affinement des coordonnées.
- Peut nécessiter des adaptations selon les classes de protéines, les types de ligands ou les régimes de résolution.
- Dépend de la qualité de l'échantillon, de la résolution de la carte et des limites inhérentes au bruit dans les données de cryoME.
