Une analyse de Microarray de protéine pour détermination sérologique de l’Infection à Clostridium difficile anticorps réponses suivantes spécifiques à l’antigène

Cette méthode peut aider à optimiser et à sélectionner des immunothérapies cliniquement utiles pour l’infection à Clostridium difficile d’une manière spécifique au patient, et à élucider les réponses immunitaires humaines à Clostridium difficile. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification précise et simultanée des réponses des anticorps multi-isotypes et spécifiques à la souche aux antigènes de C. difficile. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés car une expertise est nécessaire pour établir et optimiser un panel d’antigènes hautement purifiés et mettre en place la plate-forme technologique.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les types de listes méthodologiques impliqués dans la préparation de la plaque micro-ondes, l’impression des réseaux, une procédure sûre et l’analyse des données nécessitent une attention particulière aux détails. Une démonstration de la procédure sera faite par Sam Greenwood, un technicien de mon laboratoire. Pour commencer, diluez les antigènes de Clostridium difficile et le tampon d’impression à une concentration optimale.

Ensuite, transférez 10 microlitres de solution d’antigène dans une plaque à 384 puits. Couvrez la plaque avec un joint de plaque et centrifugez à 300 fois la gravité pendant cinq minutes à température ambiante. Pour l’impression de microréseaux, utilisez un brûleur à gaz portatif pour chauffer la broche en silicium trois fois pendant deux secondes chacune.

Ensuite, rincez la broche en silicone à l’eau claire trois fois pendant trois secondes chacune. Placez la plaque de la puce dans la cartouche de chargement d’un arrayer. Éjectez le plateau, puis placez les lames d’amino silane dans le plateau de diapositives et appuyez sur le bouton OK pour allumer l’aspirateur.

Assurez-vous que toutes les diapositives sont sécurisées, puis cliquez sur OK. Remettez le plateau à l’origine et fermez le couvercle. Ensuite, lancez le programme approprié et allez dans Fichier, puis Paramètres de microarray, puis Ouvrir. Sélectionnez le fichier Clostridium difficile pour imprimer tous les antigènes en quadruplicate.

Sous cette fenêtre, ouvrez l’onglet Source pour indiquer le stockage de l’échantillon et l’onglet Cible pour saisir les détails de la puce à microarray. Ensuite, ouvrez l’onglet Options pour sélectionner l’outil de lavage. Sous l’onglet Général des préférences d’exécution, dans la barre d’outils de la suite d’applications TAS, sélectionnez Laver au début de l’exécution et Laver à la fin de l’exécution.

Ouvrez l’onglet Climat et réglez le niveau d’humidité entre 55 et 60 %Maintenant, démarrez la course et vérifiez périodiquement le arrayer pour assurer son bon fonctionnement. Après l’impression, placez soigneusement les lames imprimées dans un porte-lames avec 16 chambres multi-puits. Ajoutez ensuite 100 microlitres de 5 % BSAT dans chaque bloc.

Couvrez les lames et incubez pendant une heure à température ambiante en secouant. Utilisez 120 microlitres de PBST pour laver chaque bloc cinq fois pendant une minute chacune en secouant. Ensuite, décongelez les échantillons de sérum obtenus chez des patients infectés par C difficile et des témoins sains sur de la glace pendant 20 minutes.

Ajoutez un diluant d’anticorps disponible dans le commerce au bloc maître, puis ajoutez des échantillons au bloc maître et mélangez. Jetez le tampon de lavage et ajoutez 100 microlitres de chaque échantillon dilué dans les blocs expérimentaux. Pour le bloc de contrôle négatif, ajoutez 100 microlitres de diluant d’anticorps uniquement.

Ensuite, incubez les lames pendant une heure à température ambiante en les secouant doucement. Ensuite, utilisez 120 microlitres de PBST pour laver chaque bloc cinq fois pendant trois minutes chacune en secouant. Ajoutez ensuite 100 microlitres d’anticorps anti-humains de chèvre biotinylés dilués dans un diluant d’anticorps à chaque bloc.

Couvrez les lames et incubez pendant une heure à température ambiante en secouant doucement. Utilisez 120 microlitres de PBST pour laver chaque bloc cinq fois pendant trois minutes chacune en secouant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de conjugué de streptavidine SY5 dilué dans 5 % BSAT, dans un rapport de un à deux mille pour chaque bloc.

Couvrir les lames d’une feuille d’aluminium et incuber pendant 15 minutes à température ambiante en secouant doucement. Lavez d’abord les lames avec 120 microlitres de PBST cinq fois pendant une minute chacune, puis lavez-les deux fois de plus pendant une minute chacune avec du PBS. Pour sécher les lames, faites-les tourner pendant cinq minutes à 300 fois la gravité.

Allumez le scanner laser 30 minutes avant le balayage, pour lui permettre de se réchauffer. Placez ensuite la diapositive dans le scanner avec la surface imprimée vers le haut jusqu’à ce que le voyant de la plaque devienne vert fixe. Ensuite, appuyez sur le bouton Paramètres.

Sur le premier onglet, assurez-vous que le défilement automatique et le code-barres ne sont pas cochés. Ensuite, réglez la taille des pixels sur 10, le mode de balayage sur Moyen, l’acquisition sur 635 uniquement, le mode d’acquisition sur Manuel, le gain sur 20 et la puissance sur faible. Dans le deuxième onglet, assurez-vous que le type de diapositive n’est pas étiqueté.

Dans le troisième onglet, réglez le paramètre Focus sur Mise au point automatique. Appuyez sur le bouton Importer la grille pour sélectionner la liste de matrices appropriée associée à l’image numérisée. Ensuite, appuyez sur le bouton de recherche automatique pour aligner la grille sur les points de la diapositive.

Enfin, appuyez sur le bouton Processus de quantification pour mesurer l’intensité de fluorescence de chaque point. Ensuite, enregistrez les résultats dans un format approprié pour une analyse plus approfondie. Dans ce protocole, une puce à protéines est comparée à l’ELISA afin d’évaluer la reproductibilité entre ces deux techniques.

L’analyse du coefficient de corrélation de Spearman montre une concordance significative entre la puce et l’ELISA pour détecter les niveaux d’IgG, d’antitoxine A et d’antitoxine B dans les échantillons de sérum. La reproductibilité du test d’introduction et la reproductibilité inter-test de la puce à protéines sont calculées à l’aide des échantillons de sérum de sept patients. Les échantillons analysés sur deux lames différentes contre la toxine A, la toxine B, la SLP001, la SLP002, la SLP027, la toxine B de la toxine B ne produisant que la souche CCUG et les antigènes pCDTb révèlent une bonne reproductibilité.

Une micropuce à protéines est réalisée pour détecter une réponse anticorps spécifique à l’isotype contre les toxines de Clostridium difficile. Les échantillons de sérum de patients et d’individus en bonne santé sont utilisés pour détecter les niveaux d’IgG et d’IgA contre la toxine A, la toxine B, la toxine B d’une toxine B de Clostridium difficile exprimant uniquement la souche et la forme précurseur d’un fragment B de la toxine binaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures.

L’expérience de contrôle de la qualité, différents paramètres tels que la sélection de la chimie de surface appropriée, les tampons d’impression, les tampons de blocage et les dilutions des échantillons de sérum et des anticorps secondaires doivent être évalués avant de prélever des échantillons. L’impression d’un réseau de haute qualité nécessite une bonne compréhension du réseau ou un logiciel permettant d’ajuster l’impression des paramètres en fonction du protocole expérimental. Il est crucial de maintenir des performances optimales de l’arrayer et un environnement exempt de poussière tout au long de l’expérience.

Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie et de la biologie moléculaire, en termes de caractérisation des réponses immunitaires humorales à l’infection et de découverte d’antigènes sérodiagnostiques. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de sang infectés et des toxines bactériennes peut être dangereux. En général, en laboratoire, la sécurité et les précautions standard doivent toujours être prises en compte lors de l’exécution de cette procédure.