ELISA immunospot (ELISPOT): Quantification des Th-1 réponses immunitaires cellulaires contre des antigènes microbiens

L’objectif global de cette procédure est de détecter les réponses des lymphocytes T aux antigènes d’intérêt. Ceci est accompli en codant d’abord avec des anticorps de capture. La deuxième étape de la procédure consiste à ajouter des cellules et des antigènes d’intérêt, puis à incuber pendant la nuit.

La troisième étape de la procédure consiste à ajouter des anticorps de détection. La dernière étape de la procédure consiste à développer la plaque avec des réactifs de substrat et à analyser les points. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui choisissent les cytokines d’intérêt grâce à l’analyse d’unités formant des taches.

Bonjour, je m’appelle Dr.Ki Richter et je suis instructeur de recherche dans le laboratoire du Dr Wonder Drake à l’Université Vanderbilt dans la division des maladies infectieuses. Aujourd’hui, nous faisons la démonstration de la technique Ellie Spot, également connue sous le nom de dosage immuno-enzymatique. Le Dr Isfahan Chambers et Tiffany Cone feront une démonstration de la technique pour vous aujourd’hui.

Afin de maintenir les normes de culture cellulaire, effectuez des manipulations dans des conditions stériles dans la hotte, ouvrez une plaque de spot alliée et lavez trois fois avec du PBS. Préparez une solution d’enrobage de l’anticorps de capture dans le PBS. Bien mélanger en vortex pour plus de commodité.

Transférez la solution d’anticorps dans un réservoir pour le multicanaux, pipetez et aliquote 100 microlitres de solution d’enrobage dans chacun. Bien sceller la plaque avec du fil et placer au réfrigérateur pendant la nuit. Ces plaques recouvertes d’anticorps sont bonnes pendant des semaines.

La règle empirique dicte qu’une plaque peut être utilisée s’il reste encore du liquide dans les puits. Pour préparer les cellules à ce test, colorez des cellules mononucléées de sang périphérique fraîchement isolées avec du bleu trien pour la viabilité et comptez-les Plaquez le pbmc à 2 millions de cellules par millilitre dans nos 10 milieux et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Afin de garder une trace de l’expérience, étiquetez le couvercle de la plaque de spot Ali avec le numéro d’identification de l’échantillon, l’état du puits et la date.

Lavez la plaque six fois avec du PBS stérile en utilisant la méthode du dump and blot. Veillez à ne pas éclabousser la plaque pendant le vidage, car cela pourrait faire virer les puits de la plaque au violet. Ajoutez nos 20 milieux dans chaque puits et incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pendant que la plaque est en incubation, comptez les cellules qui ont été reposées pendant la nuit. Récoltez le pbmc par centrifugation. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans nos 10 milieux à une concentration de 1 million de cellules par millilitre.

Après l’incubation d’une heure de la plaque d’alvélité, retirer le milieu R 20 à l’aide de la méthode du basculement et du transfert. Veillez à ne pas éclabousser la plaque pendant le déversement. Ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire à chacun.

Suivez le plan expérimental avec l’ajout de peptides et d’antigènes dans les puits de test correspondants. Incluez toujours un contrôle négatif des cellules sans peptides et également des puits de contrôle positifs avec de la phytohémagglutinine ajoutée. Incuber l’assiette pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Lavez la plaque six fois avec 150 microlitres d’un XPBS en utilisant la méthode du dump and blot. Ajoutez 100 microlitres de PBS dans chaque puits de la plaque et placez la plaque au réfrigérateur ou à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant ce temps, préparez la solution d’anticorps à la biotine dans du PBS.

Sortez la plaque d’appoint ALI du réfrigérateur et jetez le PBS en le jetant dans la corbeille à papier. Veillez à ne pas éclabousser la plaque tout en versant une aliquote de la solution d’anticorps à la biotine dans chaque puits et incubez la plaque dans le capot de culture tissulaire à température ambiante pendant une heure. Lavez la plaque six fois avec du PBS en utilisant la méthode du déversement et du transfert au dernier lavage.

Laissez le PBS sur l’assiette maintenant. Préparez la solution d’anticorps STREPTAVIDIN dans du PBS, en vous assurant de mélanger la solution. Eh bien, jetez le dernier lavage PBS des puits et tracez la plaque de spot ALI.

Ajouter une solution d’anticorps anti-streptavidine dans chaque puits et incuber la plaque dans le capuchon de culture tissulaire à température ambiante pendant une heure. Afin d’éliminer l’excès d’anticorps de trévain, lavez la plaque six fois avec du PBS en utilisant la méthode du dump and blot lors du dernier lavage, dirigez le PBS sur la plaque. Compte tenu de la sensibilité à la lumière de la solution de substrat de phosphatase alcaline B-C-I-P-M-B-T.

Travaillez dans l’obscurité lors de la préparation de la solution de tige, comme décrit par les fabricants dans les instructions du kit de substrat de phosphatase alcaline, jetez le PBS restant des puits et épongez la plaque de point ly. Ajoutez une solution de substrat dans chaque puits et allumez la lumière. Après cinq à 10 minutes de développement de la couleur, laissez les réactifs rester sur la plaque jusqu’à ce que les taches commencent à devenir violettes et soient assez foncées.

Cela prend jusqu’à 20 minutes. Lavez trois fois la plaque d’appoint Ali à l’eau du robinet et laissez-la sécher à l’air libre. Chaque plaque contient un contrôle positif, un contrôle négatif et un peptide d’intérêt réalisé au minimum en double.

Les puits de contrôle positif sont d’une couleur violet foncé reflétant une couche confluente de cellules et pratiquement pas de fond blanc. Les puits de contrôle négatifs n’ont pas de fond violet et pas de taches comme prévu. Les puits d’échantillons de test illustrent ici les réponses cellulaires aux peptides microbiens.

Les taches violettes représentent une seule cellule réactive exprimant la cytokine d’intérêt lors de la réalisation de la technique de point LA. Veillez à ne pas percer la membrane avec les pointes de votre pipette ou à ne pas laisser votre plaque sécher car cela entraînerait un bruit de fond élevé.