Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

L’objectif global de cette technique est d’étudier l’engagement des ARNm individuels avec les polysomes pendant la traduction. Le profilage des polysomes est une technologie puissante pour étudier l’engagement de l’ARNm avec les ribosomes et les polysomes. Cette technique est importante pour l’étude de la régulation de la synthèse des protéines, de l’activation de la traduction et de la répression.

Notre équipe présente ici les techniques de fractionnement polysomal, et d’analyse des fractions sur l’exemple de trois organismes. Parasite Leishmania major, des cellules humaines cultivées et un tissu animal. Cette approche se compose de quatre étapes principales, la préparation du lysat, la préparation du gradient de saccharose et l’ultracentrifugation, le fractionnement des polysomes et la collecte d’échantillons.

Analyse des fractions. Les cellules de différentes sources sont recueillies, lavées et lysées dans un tampon de lyse par passage à travers une aiguille ou un homogénéisateur Dounce. La centrifugation est utilisée pour éliminer les débris cellulaires, clarifiant ainsi le lysat.

Un gradient continu de saccharose est formé par le mélange de solutions de saccharose à 10 % et 50 % dans un fabricant de gradient. Le lysat est chargé au sommet du gradient. L’ultracentrifugation sépare les MRNA associés à un nombre différent de ribosomes.

Qui est surveillé par un détecteur UV pendant le fractionnement, formant des spectres absorbants distincts. Préparation de lysat. Il existe quelques différences dans la préparation du lysat selon la source.

Après la préparation du lysat, les procédures sont identiques quelle que soit l’origine de l’échantillon. Préparation de lysat cytoplasmique de Leishmania major. Placez les cellules de Leishmania major dans 30 millilitres de milieu à la densité de 100 000 cellules par millilitre.

Cette étape est effectuée dans une enceinte de biosécurité. Placez le ballon avec la culture de Leishmania dans l’incubateur et faites pousser les cellules à 27 degrés Celsius, jusqu’à la phase logarithmique. Il faut généralement environ deux jours pour pousser.

Les cellules majeures de Leishmania sont facilement visibles au microscope. Ajouter du cycloheximide à la culture cultivée de Leishmania jusqu’à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre, pour arrêter les ribosomes sur les ARNm traduits. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant dix minutes à 27 degrés Celsius.

Une fois le traitement au cycloheximide terminé, transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et faites-le tourner à 1 800 g pendant 8 minutes. Jeter le surnageant. Laver les cellules avec 30 millilitres de pbs et centrifuger.

Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS. Prenez une aliquote de cellules et mélangez-la avec la solution de formaldéhyde. Comptez ensuite les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Transférez le nombre souhaité de cellules dans le tube de microfuge. Faites tourner les cellules à 1 800 g pendant 8 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez ensuite le surnageant.

Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéase et de l’ARNasine. Passez trois fois les cellules dans une aiguille de calibre 23. Après être passé à travers l’aiguille, le lysat devient transparent.

Centrifuger à 11, 200 g pendant dix minutes à quatre degrés Celsius pour clarifier le lysat. Transférez le lysat clarifié dans un tube de microfuge frais et conservez-le sur de la glace jusqu’à l’ultracentrifugation du gradient de saccharose. Préparation de lysat cytoplasmique à partir de cellules humaines cultivées.

Cultivez des cellules HeLa dans une grande plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2. Ajoutez du cycloheximide aux cellules HeLa cultivées à la concentration finale de 100 microgrammes par millilitre pour arrêter les ribosomes sur les ARNm traduits. Incuber des cellules pendant dix minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2.

Aspirez le milieu et lavez la plaque sur de la glace deux fois avec des pbs froids. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse dans la plaque et grattez les cellules. Transférez les cellules lysées dans le tube microfuge.

Passez trois fois les cellules dans une aiguille de calibre 23. Essorer à 11 200 g pendant huit minutes pour clarifier le lysat. Après la centrifugation, déplacez les tubes sur de la glace et transférez le surnageant dans le nouveau tube.

Prenez une aliquote, diluez-la et mesurez l’absorbance à 260 nanomètres à l’aide d’une nanogoutte. S’il y a plusieurs échantillons, ajustez les lysats à la même densité optique et conservez les échantillons sur de la glace jusqu’à l’ultracentrifugation par gradient de saccharose. Préparation de lysat cytoplasmique à partir de testicules de souris.

Disséquez le testicule de la souris. Faites une petite incision dans la tunique albugenia et récupérez les tubules séminiforous du testicule et transférez-les dans le tube conique contenant cinq millilitres de pbs. Mélangez vigoureusement le tissu.

Et laissez le tissu se déposer sur la glace pendant cinq minutes. Retirez le tampon et lavez-le avec pbs deux fois de plus. Transférez les tubes séminifères dans un tube de deux millilitres et faites-les tourner à 500 g pendant une minute.

Retirez le surnageant. Ajoutez un tampon de lyse de 500 microlitres aux tubules et utilisez une pipette pour perturber le tissu. Transférez la suspension dans un petit volume d’homogénéisateur.

Perturbez le tissu avec sept à huit coups de pilon de verre. Transférez le lysat dans un micro-tube à centrifuger. Centrifuger l’échantillon à 12 000 g à quatre degrés Celsius pendant huit minutes pour éliminer le lysat.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube et conservez-le sur de la glace. Ensuite, procédez à la préparation du gradient de saccharose. Préparation du gradient de saccharose.

Placez un tube d’ultracentrifugation dans le microbloc et tracez la ligne le long du niveau supérieur du bloc. Transférez ensuite le tube dans un support stable. Prenez une seringue de dix millilitres, avec le dispositif de stratification attaché et remplissez la seringue avec une solution de saccharose à 10 %.

Relâchez-le doucement au fond du tube d’ultracentrifugation jusqu’à ce que la solution de saccharose atteigne le repère. Remplissez une autre seringue avec une solution à 50 % de saccharose et insérez soigneusement son dispositif de stratification à travers la couche à 10 % de saccharose jusqu’au fond du tube. Libérez doucement la solution de saccharose, en commençant par le bas jusqu’à ce qu’elle atteigne la marque sur le tube.

Scellez ensuite le tube avec le bouchon fourni. Pour préparer le dégradé de saccharose, allumez l’appareil de création de gradient. Ensuite, nivelez la plaque à l’aide des boutons haut ou bas et appuyez sur OK.

Après avoir nivelé la plaque, appuyez sur grad. Allez dans le menu de la liste des dégradés et sélectionnez le rotor SW41. Choisissez ensuite le dégradé de saccharose souhaité.

Appuyez sur utiliser. Placez le support de tube de base magnétique sur le fabricant de dégradé. Transférez ensuite le tube dans le support.

Jusqu’à six dégradés peuvent être préparés en même temps. Appuyez sur exécuter. Le fabricant de gradient fait pivoter les tubes à la vitesse et aux angles du programme, formant un gradient linéaire.

La préparation du dégradé ne prendra que quelques minutes. Une fois le processus terminé, placez le tube dans un support. Retirez le volume, égal au volume de l’échantillon, du haut des tubes d’ultracentrifugation avec des gradients de saccharose.

Chargez soigneusement 500 microlitres de lysat sur le dessus. Placez les tubes dans les godets du rotor et équilibrez-les. Centrifuger à 260 000 g pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

Fractionnement des polysomes et prélèvement d’échantillons. Après l’ultracentrifugation, placez les tubes dans les godets du rotor sur de la glace. Allumez le collecteur de fractions et le fractionneur.

Cliquez sur Scanner dans le menu du fractionneur. Mettez un support avec des tubes de collecte dans le collecteur de fractions. Remplissez un réservoir de rinçage, sur le côté du fractionneur avec de l’eau déminéralisée.

Appuyez sur la touche de rinçage pendant dix secondes pour rincer la pompe. Fixez un adaptateur de rinçage avec la seringue remplie d’eau au piston pour l’étalonnage. Ouvrez le logiciel de fractionnement sur l’ordinateur.

Appuyez sur calibrer. Utilisez le réglage par défaut et appuyez sur Ok.Be prêt pour injecter de l’eau de la seringue. Appuyez sur Ok pour effectuer l’étalonnage.

Commencez immédiatement à injecter de l’eau pendant les cinq prochaines secondes. Le signe Étalonnage du zéro terminé apparaîtra. Retirez un adaptateur de rinçage avec la seringue et fixez une pointe au piston du fractionneur.

Ouvrez la soupape d’air en laiton et appuyez sur la touche d’air pendant dix secondes pour sécher le tube d’air et la cellule d’écoulement. Fermez la vanne d’air. Prenez le tube incliné du godet du rotor et placez-le dans le rack.

Appliquez le capuchon du support de tube sur le haut du tube, déplacez soigneusement le tube dans le support de tube et verrouillez-le. Placez le support sous le piston. Souvent, les bandes polysomiques peuvent être vues à l’œil nu.

Introduisez les paramètres souhaités pour les nombres de fractions et le volume. Nommez le fichier et appuyez sur Ok, puis sur le bouton graphique. Dans la fenêtre suivante, appuyez sur Démarrer l’analyse.

Les paramètres apparaîtront et appuieront sur Ok.Le collecteur se déplacera de la gouttière à la première fraction, et le piston se déplacera dans le tube. Lorsque le piston atteint le sommet de la pente, il ralentit à la vitesse que vous avez sélectionnée et les fractions sont collectées. Habituellement, nous collectons 24 fractions de 500 microlitres chacune.

Une fois terminé, le piston sortira du tube incliné. Ouvrez la soupape d’air en laiton. Appuyez sur la touche air du fractionneur pour récupérer la dernière fraction.

À la fin de la course, vous verrez le profil d’absorbance du gradient. Analyse des fractions. Les fractions obtenues peuvent être utilisées pour l’analyse de l’ARN et des protéines.

L’ARN peut être analysé par électrophorèse suivie d’un transfert de Northern ou utilisé pour la production d’ADNc, suivie d’une réaction RT-qPCR pour analyser l’association d’ARNm individuels avec des polysomes. Le séquençage de nouvelle génération peut être utilisé pour analyser l’état traductionnel des ARNm sur une échelle de transcriptome. Pour l’analyse protéique des fractions polysomiques, les protéines sont précipitées avec de l’acide tricluricédique pour les concentrer.

Ensuite, les protéines sont analysées par Western Blot, ou par Mass Spec au niveau du protéome. Résultats. Nous présentons ici les résultats du fractionnement et de l’analyse des polysomes sur les exemples de trois organismes. Leishmania, cellules humaines cultivées et tissus de souris.

Le fractionnement des polysomes a été utilisé pour étudier l’association de l’ARNm de Sherp et de Tubuline avec les ribosomes pendant la traduction et la majeure de Leishmania. Le graphique d’absorbance pour le fractionnement a une forme distincte avec des pics typiques pour les sous-unités de ribosome 40S et 60S, les monosomes 80S et les polysomes. Les aliquotes des fractions ont été combinées en trois groupes.

Pré-polysomes, polysomes légers et polysomes lourds. Les niveaux relatifs d’ARNm ont été étudiés par PCR quantitative en temps réel. Les données suggèrent que l’ARNm de la tubuline est activement traduit.

Comme il était principalement associé aux polysomes lourds et légers. Alors que la traduction de l’ARNm Sherp est moins active. Il a été principalement trouvé en association avec des pré-polysomes et des polysomes légers.

Ainsi, cette expérience démontre clairement la capacité de la technique à étudier l’engagement individuel de l’ARNm dans la traduction. Cette figure présente un graphique d’absorbance typique du fractionnement des polysomes des cellules HeLa. Les protéines ont été concentrées par précipitation avec 10 % d’acide trichloracétique.

La protéine ribosomique de petite sous-unité RPS6 et la protéine ribosomique de grande sous-unité RPL11 ont été détectées par Western Blot. Leur distribution était bien corrélée avec les pics distincts, sur le spectre d’absorbance. Sur cette figure, nous présentons un exemple de détection d’ARN ribosomiques par électrophorèse dans des polysomes fractionnés du testicule de souris. Conclusions.

Le profilage polysomal est une technique polyvalente qui peut être utilisée pour analyser l’état traductionnel d’ARNm individuels, examiner les protéines associées aux ribosomes et étudier la régulation translationnelle dans différents organismes modèles dans différentes conditions.