Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Bonjour, je suis Cecile. Je travaille au LGBP à Marseille. Le protocole que nous allons décrire dans cette vidéo est une méthode simple permettant d'isoler des polysomes et des monosomes à partir de divers tissus végétaux afin d'identifier les ARNm qui sont activement traduits et d'étudier la régulation de la traduction.

À titre d'exemple, nous allons vous montrer l'isolement de polysomes à partir de jeunes plants d'Arabidopsis thaliana âgés de six jours, suivi de l'isolement de l'ARN et de l'analyse des résultats. Ensemencez les graines sur une boîte de Pétri et laissez-les deux jours à quatre degrés. Puis faites pousser les plantes pendant six jours.

Récolter la plantule et la broyer dans de l'azote liquide. Peser 300 milligrammes de poudre végétale et ajouter 2,4 millilitre de tampon polysomal. Centrifuger pour recueillir les fragments végétaux et charger le surnageant sur le dessus d'un gradient de saccharose.

Effectuez une ultracentrifugation sur gradient, puis recueillez les fractions de la base vers le sommet avec une lecture continue de l'OD. Répartissez la fraction en polysome, monosome et fraction surnageante, puis précipitez l'ARN toute la nuit. Effectuez une ultracentrifugation, resuspendez le culot et extrayez l'ARN pour les analyses ultérieures. Quelques jours avant d'effectuer le profilage des polysomes, préparez le gradient de saccharose.

Préparez des solutions de saccharose à 50, 35 et 20 % et conservez-les à quatre degrés. Versez la couche de saccharose à 50 %. Congelez-la dans un congélateur à moins 40.

Après six heures, ajouter la couche à 35 % et la congeler toute la nuit dans un congélateur à -40. Verser la première couche à 20 % et la congeler. Le jour de l'expérience, sortir du congélateur le nombre nécessaire de gradients.

Ajouter la dernière couche de saccharose à 20 % et laisser les gradients décongeler dans une chambre froide. Préparer l'échantillon à partir de plantes que nous avons récemment collectées. Ici, nous utilisons des semis de six jours d'Arabidopsis thaliana.

Récolter les plantes congelées à l'azote liquide et les broyer complètement. Peser 300 milligrammes de poudre végétale. Ajouter rapidement 2,4 millilitre de tampon polysomal frais et homogénéiser.

Transférez la solution dans deux tubes de 1,5 millilitre. Faites centrifuger l'extrait cytosolique. Prélèvez le surnageant à l'aide d'une pipette.

Veillez à éviter tout fragment végétal. Ils altéreraient le profil à l'étape suivante. Déposez le surnageant sur le gradient de saccharose sans perturber le gradient.

Placer le gradient dans un godet de rotor SW 41. Faire centrifuger. Pour visualiser le profil des polysomes et collecter la fraction, nous utilisons un système simple composé d'un tube capillaire plongeant dans le gradient. Celui-ci est relié à une cuvette UV.

Il est relié en boucle à une pompe péristaltique. Un spectrophotomètre UV enregistre en continu l'OD au fur et à mesure que le gradient progresse dans la cuvette. Le collecteur de fractions permet la récupération de fractions de deux millilitres.

Nettoyez la cuvette et placez-la dans le spectrophotomètre. Retirez le gradient du seau sans le perturber. Les chlorophylles doivent être concentrées en haut du gradient.

Plongez les tubes capillaires au fond du gradient. Démarrez la pompe péristaltique. Le gradient est recueilli du bas vers le haut et la D.O. est lue en continu.

Des fractions de deux millilitres sont collectées. Voici l'allure d'un profil classique. La précipitation de l'ARN est réalisée en utilisant de l'hydrochlorure de guanidinium et de l'isopropanol.

Versez d'abord un volume de chlorure de guanidinium dans un tube de 50 millilitres, puis ajoutez la fraction. Ajoutez ensuite 1,5 volume d'isopropanol et 50 microgrammes d'agent vecteur équivalent. Précipitez l'ARN toute la nuit à moins 20 degrés.

Transférez les fractions dans des tubes d'ultracentrifugation de 40 millilitres et équilibrez le tube avec de l'isopropanol. Centrifugez. Éliminez le surnageant et séchez le culot à l'air. Resuspendez le culot dans 200 microlitres de tampon TE tiède.

Extraire davantage l'ARN en effectuant une extraction classique au phénol-chloroforme. Un profil représentatif d'extrait de polysomes provenant de plantules d'Arabidopsis âgées de six jours est présenté ici. Le pic principal correspond au monosome, c'est-à-dire aux ARNm associés à un seul ribosome.

La première partie du profil correspond aux fractions polysomales, c'est-à-dire les ARNm associés à de nombreux ribosomes. Chaque pic correspond à l'association d'un nouveau ribosome à l'ARNm. La dernière partie du profil correspond à la fraction dite de surnageant, qui contient les sous-unités ribosomiques libres et les ARN.

Une grande quantité de sous-unités 60S forme un bourrelet à côté du pic du monosome. Pour évaluer leur intégrité, les ARN extraits des fractions peuvent être analysés sur un gel d'agarose classique avant d'être utilisés dans des expériences ultérieures. Nous avons utilisé ce protocole pour isoler des polysomes de jeunes pousses d'Arabidopsis thaliana, mais aussi de rosettes jeunes et âgées, ainsi que de feuilles de Nicotiana benthamiana, de tomate et de riz ; il devrait donc fonctionner avec un large éventail de plantes et de tissus.

Les ARN purifiés sont compatibles avec l'analyse par puces à ADN ainsi qu'avec l'identification des petits ARN associés aux fractions polysomales.