Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling
28 août 2016
Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.
Bonjour, je m’appelle Cécile. Je travaille au LGBP à Marseille. Le protocole que nous allons décrire dans cette vidéo est une méthode simple pour isoler les polysomes et les monosomes de divers tissus végétaux afin d’identifier les ARNm qui sont activement traduits et d’étudier la régulation de la traduction.
À titre d’exemple, nous allons vous montrer l’isolement des polysomes de semis d’Arabidopsis thaliana âgés de six jours, l’isolement ultérieur de l’ARN et l’analyse des résultats. Semez les graines sur une assiette et laissez-les deux jours à quatre degrés. Ensuite, faites pousser les plantes pendant six jours.
Récoltez les plants et broyez-les dans de l’azote liquide. Poids 300 milligrammes de poudre de plante et ajouter 2,4 millilitres de tampon polysome. Centrifuger pour collecter des fragments de plantes et charger le surnageant au sommet d’un gradient de saccharose.
Le gradient de l’ultra-centrifugeuse le collecte ensuite de bas en haut avec lecture continue de la DO. Tirez la fraction dans un polysome, un monosome et une fraction surnageante et précipitez l’ARN pendant la nuit. Ultra-centrifuger, remettre en suspension la pastille et extraire l’ARN pour une analyse ultérieure. Quelques jours avant d’effectuer le profilage des polysomes, préparez le gradient de saccharose.
Préparez une solution de saccharose à 50, 35 et 20 % et maintenez-les à quatre degrés. Versez la couche de saccharose à 50 %. Congelez-le dans un congélateur à moins 40.
Après six heures, ajoutez la couche de 35 % et congelez-la dans un congélateur à moins 40 pendant la nuit. Versez la première couche de 20 % et congelez-la. Le jour de l’expérience, retirez le nombre nécessaire de gradients du congélateur.
Ajoutez les 20 % restants de saccharose et laissez les dégradés dégeler dans une chambre froide. Préparez l’échantillon que nous avons fraîchement collecté pour la plante. Ici, nous utilisons des semis d’Arabidopsis thaliana âgés de six jours.
Récoltez les plantes congelées à l’azote liquide et broyez-les soigneusement. Poids 300 milligrammes de poudre de plante. Ajouter rapidement 2,4 millilitres de tampon de polysome frais et homogénéiser.
Pipetez la solution dans deux tubes de 1,5 millilitre. Centrifuger l’extrait cytosolique. Pipeter le surnageant.
Attention à éviter les fragments de plantes. Ils gâcheraient le profil à l’étape suivante. Chargez le surnageant sur le gradient de saccharose sans perturber le gradient.
Mettez la pente dans un godet rotor SW 41. Centrifugeuse. Pour visualiser le profil des polysomes et collecter la fraction, nous utilisons un système simple composé d’un tube capillaire qui plonge dans le gradient. Il est relié à une cuvette UV.
Il est auto-connecté à une pompe péristaltique. Un spectrophotomètre UV enregistre en continu le DO au fur et à mesure que le gradient progresse dans la cuvette. Le collecteur de fractions permet de collecter des fractions de deux millilitres.
Nettoyez la cuvette et placez-la dans le spectrophotomètre. Retirez la pente du godet sans le déranger. Les chlorophylles doivent être concentrées sur le haut du gradient.
Plongez les tubes capillaires vers le bas de la pente. Démarrez la pompe péristaltique. Le gradient est collecté de bas en haut et le diamètre extérieur est lu en continu.
Deux fractions de millilitres sont recueillies. Voici la forme d’un profil classique. La précipitation de l’ARN est effectuée à l’aide de chlorhydrate de guanidinium et d’isopropanol.
Tout d’abord, versez un volume de chlorhydrate de guanidinium dans un tube de 50 millilitres, puis ajoutez la fraction. Ajoutez ensuite 1,5 volume d’isopropanol et 50 microgrammes de courrier égal. Faites précipiter l’ARN pendant la nuit à moins 20 degrés.
Transférez les fractions dans des tubes ultra-centrifuges de 40 millilitres et équilibrez le tube avec de l’isopropanol. Centrifugeuse. Retirez le surnageant et faites sécher la pastille à l’air. Remettez le granulé en suspension dans 200 microlitres de tampon TE chaud.
Extrayez ensuite l’ARN en effectuant une extraction classique au phénol chloroforme. Un profil représentatif de l’extrait de polysomes d’un semis d’Arabidopsis âgé de six jours est présenté ici. Le pic principal correspond au monosome, les ARNm qui sont associés à un seul ribosome.
La première partie du profil correspond aux fractions polysomiques à savoir l’ARNm associé à de nombreux ribosomes. Chaque pic correspond à l’association du nouveau ribosome à l’ARNm. La dernière partie du profil correspond à la fraction surnageante qui contient les sous-unités ribosomales libres et l’ARN.
Une grande quantité de sous-unité 60S forme une épaule à côté du pic du monosome. Pour évaluer leur intégrité, les ARN extraits des fractions peuvent être analysés sur un gel d’Aragose classique avant d’être utilisés pour d’autres expériences. Nous avons utilisé ce protocole pour isoler les polysomes des semis d’Arabidopsis thaliana, mais aussi des rosettes jeunes et âgées ainsi que des feuilles de Nicotiana benthamiana, de tomates et de riz, de sorte qu’il devrait fonctionner avec un large éventail de plantes et de tissus.
Les ARN purifiés sont compatibles avec l’analyse par micropuces ainsi que pour l’identification de petits ARN associés à des fractions polysomiques.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler les polysomes et les monosomes à partir de tissus végétaux, permettant l'identification des ARNm activement traduits et l'étude de la régulation de la traduction. L'exemple fourni se concentre sur l'isolement des polysomes à partir de plantules d'Arabidopsis thaliana âgées de six jours.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Biologie végétale
- Régulation de la traduction
- Analyse des ARNm
Contexte
- Comprendre l'activité de traduction est crucial pour étudier l'expression des gènes.
- Les polysomes sont des grappes de ribosomes traduisant un ARNm, tandis que les monosomes sont des ribosomes simples.
- Cette méthode fournit des aperçus sur le statut translationnel de certains ARNm.
- Arabidopsis thaliana sert d'organisme modèle dans la recherche végétale.
Objectif de l'étude
- Isoler les polysomes et les monosomes à partir de tissus végétaux.
- Identifier les ARNm qui sont activement traduits.
- Étudier la régulation de la traduction chez les plantes.
Méthodes utilisées
- Semis de graines sur des plaques et stratification à froid pendant deux jours.
- Culture des plantules pendant six jours dans des conditions optimales.
- Isolation des polysomes et monosomes à partir des tissus végétaux.
- Analyse de l'ARN pour déterminer l'activité de traduction.
Résultats principaux
- Isolation réussie des polysomes à partir des plantules d'Arabidopsis thaliana.
- Identification des ARNm activement traduits.
- Aperçus sur la régulation de la traduction dans les tissus végétaux.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode pour étudier la traduction.
Conclusions
- Ce protocole fournit une méthode fiable pour étudier la traduction chez les plantes.
- Il améliore la compréhension de la régulation de l'expression des gènes.
- L'approche peut être appliquée à diverses espèces végétales.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Polysome profiling provides a direct snapshot of translational activity, enabling mechanistic de-risking of target hypotheses in plant-based biopharma discovery. By distinguishing actively translated mRNA pools, the method supports target validation and phenotypic screening in agriculturally relevant systems. This approach enhances predictive confidence when prioritizing leads for crop improvement or molecular farming applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mRNA abundance to translational output.
- Operational Value: Clarifies pathway activity through ribosome engagement metrics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with sustained translational engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening in plant expression platforms.
- Operational Value: Enables assay standardization via quantitative OD260 profiling and fraction reproducibility.
- Scalability: Supports platform reuse across Arabidopsis, Nicotiana, tomato, and rice tissues.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target validation to preclinical biomarker assessment in plant systems.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by isolating mRNA populations defined by ribosome load.
- Disease-Relevant System: Applicable to crop models used in molecular farming and biopharma production.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing before lead identification and enabling translational continuity into preclinical evaluation in plant-based systems.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in polysome/monosome ratios under experimental conditions.
- Screening: Delivers ribosome-profiling readouts that help compare compound or genetic perturbation effects.
- Analytics: Generates quantitative OD260 tracings and fractionated RNA yields for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery in plant molecular farming pipelines.
- Enterprise Reuse: Establishes a fractionation capability applicable across diverse plant tissues and species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving translational states of target mRNAs.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sucrose gradient fractionation and continuous OD monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation at the translation level.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on translational activity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and polysome buffer preparation.
- Depends on ultracentrifugation equipment and fraction collection systems with UV monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for gradient preparation and fraction pooling protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to non-model plant systems.
- Involves practical limitations related to RNA integrity during fractionation and extraction steps.
