Name: Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Découvrez une méthode simple pour isoler les polysomes et monosomes des tissus végétaux chez Arabidopsis thaliana. Cette technique permet d'identifier les ARNm activement traduits et d'étudier la régulation de la traduction.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par l&#39;Agence Nationale de la Recherche française (ANR-14-CE02-0010). Nous remercions le Dr Benjamin champs et le Dr Elodie Lanet pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions M. Michel Terese pour son aide avec le montage vidéo.

1. Préparation de 20 à 50% (p / v) de saccharose Gradients Nota: Les gradients sont constitués de 4 couches de saccharose (50%, 35% et 2 couches de 20%) dans un tube d&#39;ultracentrifugation 13,2 ml. Dans notre expérience, la coulée du saccharose à 20% en deux couches séparées améliore grandement la qualité des préparations de polysomes. <ol><li> Préparer les solutions mères. Veiller à ce que toutes les solutions sont RNAse et DNAse libre. <ol><li> Préparer une solution saline 10X: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM de KCl et 100 mM de MgCl 2. </li><li> Préparer 2 M sucrose Solution: Pour 200 ml, dissoudre 137 g de saccharose dans 1X solution saline. </li></ol></li><li> Diluer la solution de saccharose dans une solution saline, telle que décrite dans le tableau 1, pour préparer les gradients. Les volumes sont donnés à six gradients. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> La concentration finale en saccharose </td><td> saccharose 2M (ml) </td><td> Sel solution 1X (ml) </td><td> Vol final. (ml) </td></tr><tr><td> 50% </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35% </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Dilutions de la solution de sucrose pour préparer six gradients. <ol start="3"><li> Verser les couches selon le tableau 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> couche sucrose </td><td> 50% </td><td> 35% </td><td> 20% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> Vol. (Ml) </td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1,35 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Volume de solution de saccharose par couche. <ol start="4"><li> Après avoir versé chaque couche, garder les tubes dans un -40 ° C ou -80 ° C congélateur jusqu&#39;à congélation complète avant d&#39;ajouter la couche suivante de saccharose. La congélation est généralement atteint après 2 heures à -40 ° C, mais en attendant environ 6 heures avant de verser la couche suivante est recommandée. La dernière couche de 20% peut être congelé ou ajouté fraîchement le jour de l&#39;expérience. Remarque: La congélation chaque couche avant d&#39;ajouter le suivant empêche de tout mélange ou de perturbation des couches. Gradients peuvent être conservés dans un -40 ° C ou -80 ° C congélateur pendant au moins six mois. </li><li> Si elle n&#39;a pas déjà été fait, ajoutez la dernière couche de 20% aux gradients le jour de l&#39;expérience. Ensuite, laissez les gradients dégeler dans une chambre froide ou un réfrigérateur. </li></ol> 2. Préparation de cytosoliques Extraits Note: Nous RECOMMmettre fin à l&#39;aide de deux gradients par échantillon biologique. 300 mg est la quantité optimale de matériel végétal pour préparer deux gradients lorsque l&#39;on travaille avec 6 jours plants âgés d&#39; Arabidopsis thaliana. Lorsque l&#39;on travaille avec moins de tissus traductionnelle actifs, la quantité de matière végétale peut être augmentée jusqu&#39;à 600 mg. <ol><li> Récolte de six jours vieux plants cultivés sur ½ Murashige et Skoog 8 supplémenté avec 1% de saccharose ou un document équivalent par congélation rapide dans de l&#39; azote liquide </li><li> matériel végétal Grind dans un mortier et un pilon prérefroidi avec de l&#39;azote liquide. </li><li> Peser 300 mg de matériau en poudre dans un plat de pesage prérefroidi. Effectuez cette étape rapidement pour éviter la décongélation de l&#39;échantillon. Remarque: Conservez les échantillons congelés pour plus d&#39;une semaine dans un -80 ° C congélateur. </li><li> Ajouter 2,4 ml de tampon de pré - refroidi polysomes (solution saline 4X, 5,26 mM d&#39; EGTA, 0,5% (v / v) octylphénoxy poly (éthylèneoxy) éthanol, ramifiés, 50 μg.ml -1 cycloheximide, 50 μg.ml 1chloramphénicol) et homogénéiser par mélange avec la pointe de la pipette. Transfert en deux tubes de 1,5 ml. Travaillez rapidement pour empêcher les échantillons de se réchauffer. </li><li> Centrifuger à 16 000 g pendant 15 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse pour sédimenter les débris. Remarque: Pour éviter la dégradation de l&#39;ARN, toujours garder les échantillons à 4 ° C, utiliser RNase / DNase solutions gratuites et de travailler dans RNase / DNase conditions libres. L&#39; héparine peut être ajoutée au tampon de polysomes, à une concentration finale de 300 μg.ml - 1, pour renforcer la protection de l&#39; ARN. Cependant, étant donné que l&#39;héparine peut interférer avec l&#39;analyse en aval, elle devra être enlevée pendant l&#39;étape de précipitation de l&#39;ARN en effectuant la précipitation du chlorure de lithium au lieu de précipitation à l&#39;éthanol (voir note 4.7). </li></ol> 3. polysomes Profiling <ol><li> Pipetter prudemment le surnageant sans perturber le culot. Si des fragments de plantes ont été pipetés, répétez l&#39;étape 2.5. Chargez le surnageant au-dessus du gradient par pipettin doucementg sur la paroi latérale du tube dans un flux constant. Utilisez un gradient pour chaque tube de 1,5 ml. </li><li> Transfert à prérefroidi seaux et centrifuger à 175.000 xg pendant 2 h 45 min à 4 ° C, dans une ultracentrifugeuse (par exemple 32.000 rpm lors de l&#39;utilisation d&#39;un rotor SW41). </li><li> Mettre en place le système de collecte de gradient tel que décrit dans la figure 1. La cuvette UV a une longueur de trajet de 1 mm. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> Figure 1. Le système de collecte de gradient. La cuvette UV est relié par un tube de chlorure de polyvinyle dans un tube capillaire en verre qui descend vers le bas de la pente. Le gradient progresse dans le système grâce à une pompe péristaltique. OD 260 est continuellement lu et fractions de 2 ml sont recueillies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande</a>cette figure. <ol start="4"><li> Réglez le collecteur de fraction à la température ambiante, et régler le carrousel à une vitesse qui permettra la collecte de fractions de 2 ml. Utiliser des tubes pré-refroidi collecte. </li><li> Collecter les fractions de bas en haut à l&#39;aide d&#39;un tube capillaire en verre relié par un tube de polychlorure de vinyle dans le système de collecte de gradient. Utiliser un film plastique de paraffine pour assurer la liaison entre le tube en chlorure de polyvinyle et le tube capillaire en verre. </li><li> Lire l&#39;absorbance à 260 nm à partir du bas vers le haut du gradient. Lorsque l&#39;ensemble du gradient est recueilli, placer les tubes de prélèvement sur la glace avant l&#39;extraction de l&#39;ARN. </li></ol> 4. Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Réunir les fractions recueillies à partir de deux gradients, dans 50 ml plafonnés tubes de centrifugation, comme suit: Polysomes: fractions 1 à 3 (12 ml) Monosomes: fraction 4 (4 ml) Les fractions surnageantes: 5 et 6 (8 ml) </li><li> Pour chaque fraction, ajouter 1 vol. le chlorhydrate de guanidine 8M,50 pg de support de acryl et 1,5 vol. l&#39;isopropanol. Note: Le support acrylique est l&#39;acrylamide linéaire, utilisé en tant que coprécipitant pour améliorer la récupération des acides nucléiques lors de la précipitation à l&#39;alcool. </li><li> Mélanger en retournant les tubes et précipiter O / N à -20 ° C. </li><li> Centrifuger à 175 000 g pendant 1 heure à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse (32.000 tpm dans un rotor SW32). Si l&#39;étape de précipitation est effectuée dans un tube qui est incompatible avec l&#39;ultracentrifugation, transvaser dans un tube approprié. </li><li> Rejeter le surnageant et on dissout le culot dans 200 ul de tampon TE sans RNase (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 à 1 mM d&#39;EDTA). Transfert à un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Extraire l&#39;ARN par addition de 1 vol. l&#39;eau phénol saturé (pH 6,6) et 1 vol. chloroforme: alcool isoamylique (24: 1). Mélanger vigoureusement. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 ml. Remarque: le phénol acide (pH 4,5) peut être utilisé afin de minimiser la contamination de l&#39;ADN. </li><li>Précipiter l&#39;ARN par addition de 1/10 volume. L&#39;acétate de sodium 3 M et 3 vol. 100% d&#39;éthanol. Autoriser la précipitation à -80 ° C pendant 20 min ou O / N à -20 ° C. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Remarque: Si vous utilisez l&#39; héparine dans le tampon de polysomes (cf. note 2.5), effectuer un chlorure de lithium (LiCl) précipitation au lieu de la précipitation de l&#39; éthanol pour éliminer correctement toute trace de l&#39; héparine qui pourrait interférer avec l&#39; analyse aval 9. Après extraction, ajouter LiCl à une concentration finale de 2,5 M. Laisser la précipitation pendant 30 min à -20 ° C ou O / N à 4 ° C. Centrifugeuse à 15.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Laver le culot avec 500 ul de 75% d&#39;éthanol. Air sécher le culot et dissoudre dans un tampon TE 30 pl. Évaluer la qualité de l&#39;ARN par électrophorèse sur un libre 1,2% gel d&#39;agarose ARNase (100 V, 15 min) ou par des procédés d&#39;électrophorèse capillaire. </li></ol> Analyse 5. Données <ol><li> données brutes à l&#39;exportation vers un logiciel graphique et l&#39;analyse des données. Remarque: Comme le montre la figure 2A et B, les profils premières donnent une information qualitative: le nombre de pics de polysomes qui peut être vu, la hauteur du pic de monosome, et la présence d&#39;un épaulement correspondant aux sous - unités ribosomiques libres. </li><li> Fusionner les profils pour permettre la comparaison des profils entre les échantillons. Utilisez l&#39;outil de lecture d&#39;écran pour déterminer la valeur de X du pic de monosome pour chaque échantillon et aligner les pics de monosome en supprimant les points de données supplémentaires au début des courbes. Identifier le point de la courbe le plus bas et de déterminer sa valeur Y (en utilisant l&#39;outil de lecture d&#39;écran). Réglez la valeur la plus faible de Y points à 0 en utilisant la fonction &quot;valeur de colonnes de jeu&quot;. </li><li> Déterminer le rapport polysomes / monosomes en intégrant la surface sous la courbe des profils bruts (figure 3C). Utiliser l&#39;outil de sélection de données pour définir la limite de la zone à intégrer. Ensuite, utilisez la fonction d&#39;intégrer (Analyse-mathématiques). </li><li> Normaliserles courbes à pic de monosome en divisant tous les points de données d&#39;une courbe par la valeur Y du sommet du pic de monosome (déterminées en utilisant l&#39;outil de lecture d&#39;écran). Sélectionnez la colonne, puis sous Analyse-Mathématiques, sélectionnez Normaliser et choisir les méthodes &quot;divisé par une valeur spécifiée&quot;. Cette étape permet de comparer le niveau relatif de polysomes (figure 3D). </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> Figure 2. profils de polysomes représentatifs. Type sauvage Arabidopsis thaliana (poids, écotype Col-0) et les plantules mutantes ont été cultivées pendant six jours sur ½ Murashige et Skoog sous photopériode de jours longs (lumière 16 h, 8 h sombres). A: profils de polysomes premières de semis wt. B: profils de polysomes premières provenant de plants mutants. C: Détermination du pourcentage de polysomes et monosomes par intégration de l&#39;aire sous la courbe D: profi polysomesles normalisée au pic de monosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<ol><li>Nelson, C. J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+in+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Protein turnover in plant biology.</a> Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).</li>
<li>Warner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economics+of+ribosome+biosynthesis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The economics of ribosome biosynthesis in yeast.</a> Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).</li>
<li>Amthor, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+McCree-de+Wit-Penning+de+Vries-Thornley+Respiration+Paradigms%3A+30+Years+Later%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later.</a> Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).</li>
<li>Preiss, T., W Hentze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starting+the+protein+synthesis+machine%3A+eukaryotic+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).</li>
<li>Baerenfaller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteomics+reveals+Arabidopsis+thaliana+gene+models+and+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics.</a> Science. 320 (5878), 938-941 (2008).</li>
<li>Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+Polyribosomal+Complexes+of+Arabidopsis+for+Global+Analysis+of+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiol%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression.</a> Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Arabidopsis+protocols%22">Arabidopsis protocols</a>. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).</li>
<li>Piques, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+and+transcript+copy+numbers%2C+polysome+occupancy+and+enzyme+dynamics+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+syst+biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis.</a> Mol syst biol. 5 (314), 314(2009).</li>
<li>Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+Profiling+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome Profiling Analysis.</a> bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).</li>
<li>Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li>
<li>Sormani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+cadmium+intoxication+in+Arabidopsis+thaliana+impacts+translation+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels.</a> Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).</li>
<li>Lanet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+translational+repression+by+Arabidopsis+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs.</a> Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).</li>
<li>Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rice+cis-Natural+Antisense+RNA+Acts+as+a+Translational+Enhancer+for+Its+Cognate+mRNA+and+Contributes+to+Phosphate+Homeostasis+and+Plant+Fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness.</a> Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIngolia%2C+NT+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).</li>
<li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler

Le protocole que nous présentons ici est une méthode simple et peu coûteuse pour générer des profils de polysomes et isoler des ARNm associés à des polysomes, des ribosomes simples ou exempts de ribosomes. Un large éventail de méthodes différentes de fractionnement des polysomes est décrit dans la littérature. La méthode que nous avons décrite ici a été optimisée pour ne conserver que les composés nécessaires et a été adaptée au matériel végétal. En particulier, nous avons réduit la quantité dedétergent11 et a...

La synthèse des protéines est un processus essentiel et coûteux en énergie dans toutes les cellules 1. Tout d&#39;abord, les cellules doivent investir de l&#39;énergie dans la production de la machine de traduction, les ribosomes. Par exemple, une cellule de levure divisant activement produit jusqu&#39;à 2000 ribosomes par minute. Une telle production nécessite jusqu&#39;à 60% de l&#39;activité totale de la transcription et jusqu&#39;à 90% de l&#39;activité totale de raccordement de la cellule 2. En outre, l&#39;énergie est nécessaire pour la synthèse des acides aminés, des aminoacyl-ARNt et des liaisons peptidiques. Chez les plantes, l&#39; ajout d&#39; un acide aminé à un coût de la chaîne peptidique de 4,5 à 5,9 molécules d&#39;ATP 3. Par conséquent, il est peu surprenant que la traduction de l&#39;ARNm de la protéine est un site majeur de la réglementation, notamment en matière de traitement des conditions environnementales changeantes. L&#39;étape d&#39;initiation de la traduction, qui est l&#39;association d&#39;un ARNm avec le ribosome, est la cible principale de la régulation desTraduction 4. En conséquence de la régulation de la traduction, ainsi que d&#39; autres mesures réglementaires post-transcriptionnel, seulement 40% des variations de la concentration de protéine peut être expliquée par l&#39;abondance d&#39; ARNm 5,6. Ainsi, l&#39;étude de l&#39;ARNm total donne relativement peu d&#39;informations sur les protéines d&#39;abondance. D&#39;autre part, l&#39;association de l&#39;ARNm aux ribosomes donne une meilleure idée de l&#39;abondance des protéines en donnant accès à ces ARNm impliqués dans la traduction. ARNm traduit activement sont associés à plusieurs ribosomes dans des structures appelées polysomes. A l&#39;inverse, les ARNm mal traduits seront associés à un seul ribosome (monosome). Par conséquent, le statut de la traduction d&#39;un ARNm peut être évaluée en surveillant son association avec les ribosomes 7. Ce protocole décrit l&#39;isolement de polysomes de six jours plants âgés d&#39; Arabidopsis thaliana, l&#39;isolement ultérieur de l&#39; ARN et l&#39;analyse des résultats. Polysosomes et les monosomes sont séparés par un gradient de densité de saccharose. Dégradés sont recueillies en six fractions. Certaines des fractions sont réunies pour obtenir trois fractions bien séparées: polysomes, monosomes et la fraction légère (ci-après appelé surnageant), qui contient les libres 60S et 40S sous-unités ribosomiques et ARNm qui ne sont pas associés à des ribosomes. l&#39;activité de traduction globale peut être évaluée en générant un polysomes rapport signal / bruit de monosome, qui est déterminé par intégration de l&#39;aire sous la courbe, et en comparant les profils de polysomes. ARNm et les protéines sont ensuite extraits des différentes fractions et utilisées pour l&#39;analyse par RT-PCR, la qRT-PCR, transfert de type Northern, puces à ADN, transfert ou protéomiques occidental. Ce protocole a été validé pour d&#39;autres plantes et tissus. L&#39;équipement nécessaire pour effectuer ce protocole sont couramment dans la plupart des laboratoires: Il n&#39;y a pas besoin d&#39;une machine à gradient. Congélation chaque couche avant d&#39;ajouter la suivante prévenirs de tout mélange ou de perturbation des couches. Aucun tube perforateur est utilisé pour la collecte de gradient qui peut être obtenue par immersion d&#39;un tube capillaire en verre dans le gradient. Par conséquent, les tubes d&#39;ultracentrifugation coûteux restent intacts et peuvent être réutilisés plusieurs fois. Collectivement, ce qui rend le présent protocole d&#39;une méthode facile et pas cher pour le profilage polysomes.

<table><tbody><tr><td>Tube d’ultracentrifugation, paroi mince, polyallomère - 13,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’ultracentrifugation, paroi mince, polyallomère - 38,5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire en verre</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse&nbsp ;</td><td>Rotor d’ultracentrifugeuse Beckman Coulter</td><td>série</td><td></td>Optima</tr><tr><td>SW41</td><td>Rotor d’ultracentrifugeuse Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Tout</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tube en polychlorure de vinyle Tygon R3607&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Tube en polychlorure de vinyle, 2,29 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Collecteur de fractions Modèle 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette UV</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Cuvette à quartz à circulation</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Lire toutes les 0.0125 s</td></tr><tr><td>Tous les produits chimiques</td><td>N’importe quel</td><td></td><td>Utilisation uniquement Biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Grade Murashige et Skoog Mélange de sels de base (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans RNASE</td><td>Toutes les</td><td></td><td></td></tr><tr><td>boîtes de Pétri Fisher</td><td>Scientific</td><td>10083251&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol, ramifié (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide linéaire (support acrylique)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>Support de précipitation d’ARN</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>Logiciel d’analyse OriginLab</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode facile pour des plantes polysomes profiling

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

La traduction de l’ARNm en protéine est un processus biologique fondamental et hautement régulé. Le profilage des polysomes est considéré comme un étalon-or pour l’analyse de la régulation translationnelle. La méthode décrite ici est un moyen simple et économique de fractionner les polysomes de divers tissus végétaux. Un dégradé de saccharose est réalisé sans avoir besoin d’un créateur de dégradés en congelant séquentiellement chaque couche. Les extraits cytosoliques sont ensuite préparés dans un tampon contenant du cycloheximide et du chloramphénicol pour immobiliser les ribosomes cytosoliques et chloroplastiques en ARNm et sont chargés sur le gradient de saccharose. Après centrifugation, six fractions sont directement collectées du bas vers le haut du gradient, sans percer le tube d’ultracentrifugation. Pendant la collecte, l’absorbance à 260 nm est lue en continu pour générer un profil de polysome qui donne un aperçu de l’activité translationnelle globale. Les fractions sont ensuite regroupées pour préparer trois populations d’ARNm différentes : les polysomes, des ARNm liés à plusieurs ribosomes ; les monosomes, ARNm liés à un ribosome ; et les ARNm qui ne sont pas liés aux ribosomes. Les ARNm sont ensuite extraits. Ce protocole a été validé pour différentes plantes et tissus, notamment les semis et les plantes adultes d’Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum et les feuilles d’Oryza sativa.

Dans la littérature, les profils de polysomes sont souvent montrés à partir de la fraction légère de la fraction lourde en raison de la façon dont les gradients sont recueillis, à savoir du haut vers le bas. Etant donné que dans le protocole décrit ici les gradients sont collectées à partir du bas vers le haut, les profils que nous montrons commencent avec la fraction lourde (les polysomes) et aller à la fraction légère (sous - unités de ribosomes libres et ARN) (figure 2A).</str...

Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Bonjour, je suis Cecile. Je travaille au LGBP à Marseille. Le protocole que nous allons décrire dans cette vidéo est une méthode simple permettant d'isoler des polysomes et des monosomes à partir de divers tissus végétaux afin d'identifier les ARNm qui sont activement traduits et d'étudier la régulation de la traduction.À titre d'exemple, nous allons vous montrer l'isolement de polysomes à partir de jeunes plants d'Arabidopsis thaliana âgés de six jours, suivi de l'isolement de l'ARN et de l'analyse des résultats. Ensemencez les graines sur une boîte de Pétri et laissez-les deux jours à quatre degrés. Puis faites pousser les plantes pendant six jours.Récolter la plantule et la broyer dans de l'azote liquide. Peser 300 milligrammes de poudre végétale et ajouter 2,4 millilitre de tampon polysomal. Centrifuger pour recueillir les fragments végétaux et charger le surnageant sur le dessus d'un gradient de saccharose.Effectuez une ultracentrifugation sur gradient, puis recueillez les fractions de la base vers le sommet avec une lecture continue de l'OD. Répartissez la fraction en polysome, monosome et fraction surnageante, puis précipitez l'ARN toute la nuit. Effectuez une ultracentrifugation, resuspendez le culot et extrayez l'ARN pour les analyses ultérieures. Quelques jours avant d'effectuer le profilage des polysomes, préparez le gradient de saccharose.Préparez des solutions de saccharose à 50, 35 et 20 % et conservez-les à quatre degrés. Versez la couche de saccharose à 50 %. Congelez-la dans un congélateur à moins 40.Après six heures, ajouter la couche à 35 % et la congeler toute la nuit dans un congélateur à -40. Verser la première couche à 20 % et la congeler. Le jour de l'expérience, sortir du congélateur le nombre nécessaire de gradients.Ajouter la dernière couche de saccharose à 20 % et laisser les gradients décongeler dans une chambre froide. Préparer l'échantillon à partir de plantes que nous avons récemment collectées. Ici, nous utilisons des semis de six jours d'Arabidopsis thaliana.Récolter les plantes congelées à l'azote liquide et les broyer complètement. Peser 300 milligrammes de poudre végétale. Ajouter rapidement 2,4 millilitre de tampon polysomal frais et homogénéiser.Transférez la solution dans deux tubes de 1,5 millilitre. Faites centrifuger l'extrait cytosolique. Prélèvez le surnageant à l'aide d'une pipette.Veillez à éviter tout fragment végétal. Ils altéreraient le profil à l'étape suivante. Déposez le surnageant sur le gradient de saccharose sans perturber le gradient.Placer le gradient dans un godet de rotor SW 41. Faire centrifuger. Pour visualiser le profil des polysomes et collecter la fraction, nous utilisons un système simple composé d'un tube capillaire plongeant dans le gradient. Celui-ci est relié à une cuvette UV.Il est relié en boucle à une pompe péristaltique. Un spectrophotomètre UV enregistre en continu l'OD au fur et à mesure que le gradient progresse dans la cuvette. Le collecteur de fractions permet la récupération de fractions de deux millilitres.Nettoyez la cuvette et placez-la dans le spectrophotomètre. Retirez le gradient du seau sans le perturber. Les chlorophylles doivent être concentrées en haut du gradient.Plongez les tubes capillaires au fond du gradient. Démarrez la pompe péristaltique. Le gradient est recueilli du bas vers le haut et la D.O. est lue en continu.Des fractions de deux millilitres sont collectées. Voici l'allure d'un profil classique. La précipitation de l'ARN est réalisée en utilisant de l'hydrochlorure de guanidinium et de l'isopropanol.Versez d'abord un volume de chlorure de guanidinium dans un tube de 50 millilitres, puis ajoutez la fraction. Ajoutez ensuite 1,5 volume d'isopropanol et 50 microgrammes d'agent vecteur équivalent. Précipitez l'ARN toute la nuit à moins 20 degrés.Transférez les fractions dans des tubes d'ultracentrifugation de 40 millilitres et équilibrez le tube avec de l'isopropanol. Centrifugez. Éliminez le surnageant et séchez le culot à l'air. Resuspendez le culot dans 200 microlitres de tampon TE tiède.Extraire davantage l'ARN en effectuant une extraction classique au phénol-chloroforme. Un profil représentatif d'extrait de polysomes provenant de plantules d'Arabidopsis âgées de six jours est présenté ici. Le pic principal correspond au monosome, c'est-à-dire aux ARNm associés à un seul ribosome.La première partie du profil correspond aux fractions polysomales, c'est-à-dire les ARNm associés à de nombreux ribosomes. Chaque pic correspond à l'association d'un nouveau ribosome à l'ARNm. La dernière partie du profil correspond à la fraction dite de surnageant, qui contient les sous-unités ribosomiques libres et les ARN.Une grande quantité de sous-unités 60S forme un bourrelet à côté du pic du monosome. Pour évaluer leur intégrité, les ARN extraits des fractions peuvent être analysés sur un gel d'agarose classique avant d'être utilisés dans des expériences ultérieures. Nous avons utilisé ce protocole pour isoler des polysomes de jeunes pousses d'Arabidopsis thaliana, mais aussi de rosettes jeunes et âgées, ainsi que de feuilles de Nicotiana benthamiana, de tomate et de riz ; il devrait donc fonctionner avec un large éventail de plantes et de tissus.Les ARN purifiés sont compatibles avec l'analyse par puces à ADN ainsi qu'avec l'identification des petits ARN associés aux fractions polysomales.

an-easy-method-for-plant-polysome-profiling

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cet article décrit un protocole pour l'extraction de traduire les ribosomes des cellules eucaryotes. Une fois extraites, les ribosomes sont séparés en monosomes et polyribosomes par fractionnement sur gradient de saccharose pour permettre à différentes populations ribosomique pour être analysé. En tant que tel, cette méthode est le gold standard pour examiner la régulation de la traduction.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l'isolement et l'identification des protéines de liaison de l'ARNm de la plante à partir d'un environnement physiologique.

Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

L’objectif global de la technique de profilage polysome est analyse de l’activité traductionnelle de différents mRNAs ou transcriptome ARNm au cours de la synthèse des protéines. La méthode est importante pour les études de règlement de la synthèse de protéine, l’activation de la traduction et répression en santé et les maladies humaines multiples.

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Ce protocole décrit une méthode de purification eucaryote des polysomes à partir de nodules de soja intacts. Après le séquençage, des pipelines standard pour l’analyse de l’expression génique peuvent être utilisés pour identifier les gènes exprimés différentiellement aux niveaux du transcriptome et du translatome.

Purification des polysomes à partir de nodules symbiotiques de soja

Le protocole présenté ici implique un profilage polysomal pour isoler le translatome, ARNm associé aux ribosomes, en ARN non polysomiques et polysomiques d’Arabidopsis par centrifugation à gradient de densité de saccharose. Cette méthode démontre l’efficacité de traduction d’Arabidopsis soumis à un stress thermique.

Test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique

Découvrez une méthode simple pour isoler les polysomes et monosomes des tissus végétaux chez Arabidopsis thaliana. Cette technique permet d'identifier les ARNm activement traduits et d'étudier la régulation de la traduction.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Explorer plus de vidéos