Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

L’objectif global de l’utilisation d’une combinaison de techniques de micromanipulation et de microscopie optique telles que la FRAP et la photoactivation est de surveiller la dynamique spaciotemporelle des protéines impliquées dans la régulation et la migration du cytosquelette dans des conditions distinctes ou d’une manière dépendante de la voie de signalisation. Les méthodes de micromanipulation décrites ici sont utiles pour l’administration directe de tout type de molécule dans les cellules ainsi que pour une manipulation induite par la lumière de l’activité des protéines dans des emplacements subcellulaires définis. Le principal avantage des techniques présentées ici est donc qu’elles permettent de déterminer les effets instantanés que les protéines exercent sur les cellules ainsi que de suivre leur mobilité dans toute la cellule.

Pour commencer cette procédure, passez des cellules B16-F1 précédemment cultivées dans un rapport de un à cinq dans une boîte en plastique de trois centimètres. Aspirez le milieu de culture cellulaire. Lavez les cellules avec du PBS, aspirez le PBS et ajoutez de la trypsine EDTA pour détacher les cellules.

Ajouter du milieu de culture cellulaire aux cellules trypsinisées. Remettez en suspension et transférez les cellules dans des tubes de faucon, après cette centrifugeuse à 1000 tr/min pendant trois à cinq minutes. Après avoir placé les cellules B16-F1 dans une boîte de trois centimètres et les avoir laissées s’étaler pendant au moins six heures, transfectez les cellules B16-F1 en ajoutant un mélange de 500 nanogrammes de construction d’ADN et d’un microlitre de réactif de transfection dans une solution contenant 150 millimolaires de chlorure de sodium.

Pour les cellules B16-F1, enrobez des lamelles de 15 millimètres avec 150 microlitres de solution de laminine et incubez pendant une heure à température ambiante. Pour les cellules NIH 3T3, enrobez les lamelles d’une solution de fibronectine et incubez pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, laver la laminine et la fibronectine incubées avec du PBS, puis aspirer le PBS.

Semez deux millilitres de fibroblastes NIH 3T3 dans un rapport de un à 20 à partir d’une boîte confluente sur les lamelles enrobées de fibronectine. Pipetez deux millilitres des cellules B16-F1 transfectées dans un rapport de un à 30 à partir d’une boîte confluente sur les lamelles recouvertes de laminine. Ensuite, laissez les cellules se propager sur des lamines et des lamelles enrobées de fibronectine pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avant la microscopie.

Placez le verre de protection avec les cellules vers le haut sur une chambre d’imagerie en aluminium RC-26 conductrice de chaleur. Ensuite, placez une scelleuse en plastique sur le verre de couverture pour faire une étanchéité sûre entre la lamelle de couverture et la chambre, fixez en vissant la scelleuse en plastique avec les pinces coulissantes de la chambre pour éviter les fuites de fluide. Maintenant, pipetez un milieu de microscopie préchauffé à 37 degrés Celsius dans la zone centrale.

Insérez le détecteur de chaleur dans la fente désignée de la chambre et reliez les électrodes de la chambre à un régulateur de température automatique TC-324B en maintenant une température constante de 37 degrés Celsius. Centrifugez une solution protéique préalablement décongelée à 10 000 G pendant au moins 30 minutes pour éliminer les agrégats de protéines qui peuvent entraîner l’obstruction de l’aiguille s’ils sont présents dans le capillaire de microinjection. À l’aide d’une pointe de pipette flexible, chargez une aiguille de micro-injection avec un microlitre de solution protéique par l’arrière.

Si des bulles d’air sont présentes dans la pointe de l’aiguille, tapotez doucement la base de l’aiguille afin de les retirer. Ajustez ensuite avec précaution le porte-aiguille sur l’appareil de micromanipulation. Lors du vissage de l’aiguille de micro-injection dans le porte-aiguille, appliquez une pression sur l’aiguille à l’aide d’un dispositif de pression de micro-injection avant de déplacer la pointe de l’aiguille dans le milieu de culture cellulaire.

Ensuite, positionnez l’aiguille dans le champ de vision à l’aide d’un objectif à faible grossissement, puis trouvez une cellule d’intérêt et abaissez progressivement l’aiguille au-dessus de la cellule. Pour la micro-injection, touchez doucement la membrane plasmique de la cellule, ce qui peut suffire à pénétrer dans la cellule ou à faciliter la rupture transitoire de la membrane en tapotant très doucement sur la configuration du microscope. Arrêtez le processus d’injection dès que le flux dans la cellule est visible en déplaçant la pointe de l’aiguille vers le haut dans le milieu.

Avant de déclencher le laser, passez au canal GFP et lancez l’acquisition de l’image en accéléré. Ensuite, dessinez manuellement la région à photoblanchir sur le canal GFP tout en regardant l’affichage. Initier le photoblanchiment par un déclenchement manuel du laser de 405 nanomètres au moins trois à quatre images après le début de l’acquisition de l’image.

Réglez l’acquisition d’image nanométrique GFP 488 dans le logiciel sur une exposition de 500 millisecondes et un intervalle de temps de 1500 millisecondes. Ajustez ensuite les paramètres du logiciel pour l’acquisition de films timelapse à deux canaux ou à trois canaux en marquant le carré de la série de longueurs d’onde et en sélectionnant le nombre de canaux souhaité dans le menu d’acquisition de longueurs d’onde. Avant de déclencher le laser, lancez l’acquisition de l’image en accéléré et dessinez manuellement la région à photoactiver sur le canal de contraste de phase tout en regardant l’affichage.

Ensuite, déclenchez la photoactivation par un déclencheur manuel du laser de 405 nanomètres au moins trois à quatre images après le début de l’acquisition de l’image. Pour l’analyse des résultats FRAP, ouvrez les vidéos en accéléré dérivées de VisiView sur le logiciel MetaMorph. Dérivez les valeurs d’intensité des régions photoblanchies pour chaque point temporel de récupération de fluorescence en dessinant manuellement les régions respectives à l’aide de MetaMorph.

Dessinez une forme à l’extrémité du lamellipodium qui couvre la totalité ou une partie de la zone photoblanchie et ajustez manuellement sa position sur les images suivantes si nécessaire afin de suivre les changements dans les intensités lamellipodiales de la région respective au fil du temps pendant le déplacement de la pointe en progression. Pour la correction de l’arrière-plan et l’acquisition du photoblanchiment, analysez respectivement les régions à l’extérieur et à l’intérieur des cellules. Une fois qu’une région d’intérêt est sélectionnée, extrayez ses valeurs d’intensité sur MetaMorph à l’aide du menu mesurer les mesures de région.

Assurez-vous que les options de temps écoulé et d’intensité moyenne sont sélectionnées dans le menu de configuration. Cliquez sur Ouvrir le journal et sélectionnez Échange de données dynamique. Cliquez ensuite sur OK pour ouvrir une feuille de calcul Excel et cliquez à nouveau sur le bouton Ouvrir le journal pour coller les valeurs MetaMorph dans Excel.

Utilisez les valeurs d’intensité dérivées de MetaMorph pour calculer les courbes de récupération de fluorescence FRAP en collant les valeurs d’intensité dans une feuille de calcul Excel contenant les formules appropriées. La récupération de fluorescence de la région photoblanchie est normalisée dans les régions de fond et à l’intérieur. Pour calculer le demi-temps de récupération de fluorescence, collez les valeurs des courbes de récupération de fluorescence avec les temps correspondants dans SigmaPlot, puis effectuez un ajustement de courbe à l’aide de l’outil d’augmentation exponentielle de l’assistant d’ajustement dynamique, en sélectionnant la fonction mono ou bi-exponentielle en fonction du meilleur ajustement de courbe.

Les paramètres obtenus en résolvant la fonction sélectionnée peuvent être collés dans une feuille de calcul Excel contenant la formule appropriée qui permet de calculer le demi-temps de récupération respectif en secondes. Pour mesurer la diffusion de l’actine photoactivable lors de l’activation ainsi que son accumulation dans une région spécifique telle que le lamellipodium, utilisez MetaMorph pour déterminer les intensités au fil du temps dans les régions respectives ainsi qu’à l’extérieur de la cellule afin de déterminer la fluorescence de fond pour la normalisation. Pour examiner le taux précis de déplacement de l’actine photoactivable loin de la région d’activation ou son taux d’incorporation dans le lamellipodium, générez des courbes de fluorescence à partir de données précédemment dérivées de MetaMorph.

Collez les valeurs d’intensité de la région d’arrière-plan utilisée pour la normalisation, de la région cytosolique photoactivée ou de la région lamellipodiale à étudier dans une feuille de calcul Excel contenant les formules appropriées. Des images de contraste facial d’une cellule fibroblaste NIH 3T3 avant et après la micro-injection de la petite GTPase Rac1 sont présentées ici. Environ 12 minutes après la micro-injection, la cellule a changé de morphologie, ce qui indique que l’injection a réussi.

Le recyclage de l’EGFP VASP blanchi par des molécules non blanchies à l’extrémité du lamellipodium est montré ici. Dans cet exemple particulier, la fluorescence de récupération plafonne à environ 80 % de la fluorescence avant le blanchiment. Lors de la photoactivation, l’actine GFP photoactivée se diffuse rapidement hors de la région cytosolique.

Une fraction des monomères d’actine photoactivés se déplace vers l’avant, créant une poussée rapide de fluorescence dans les lamellipodes. L’incorporation de la fluorescence est délicieusement plus faible dans les lamellipodes éloignées de la région photoactivée, car la fraction des monomères d’actine photoactivés se dilue avec des monomères non activés lors de leur voyage à travers le cytosol. Au fur et à mesure que l’actine GFP photoactivée se diffuse loin de la région photoactivée au fil du temps, elle est continuellement remplacée par de l’actine non photoactivée et non fluorescente.

En conséquence, une diminution progressive de l’intensité de fluorescence de cette région est observée. Au fil du temps, les lamellipodes proches de la région d’activation cytosolique intègrent rapidement l’actine fluorescente. La baisse de fluorescence qui s’ensuit est simplement due à la dépolymérisation de l’actine et à la diffusion des monomères loin du lamellipodium.

Ainsi, lorsque des expériences sont réalisées sur un seul système de microscopie, la combinaison de la microinjection et des techniques FRAP ou de photoactivation peut être réalisée de manière réaliste en quelques minutes en fonction de la nature des protéines étudiées. N’oubliez jamais de vous garder heureux avant, pendant et après la micromanipulation ou après une exposition à la lumière laser. Pour la FRAP et la photoactivation, il est particulièrement important que la région sélectionnée conserve son intégrité structurelle pendant toute la durée du film.

La procédure de micro-injection peut être complétée par l’application locale de médicaments perméables à la membrane plasmique ou d’inhibiteurs du cytosquelette afin de faire face aux conséquences immédiates de traitements donnés au niveau subcellulaire. Les techniques de micromanipulation ont ouvert la voie à l’exploration des propriétés de diffusion et de la dynamique subcellulaire des composants et des complexes cytosquelettiques, ainsi qu’à la compréhension des voies de seconde main régulant la morphogenèse cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de suivre et de surveiller la dynamique spatio-temporelle des protéines cytosoliques, des protéines incorporées dans l’acte à l’intérieur du cytosquelette ou résidant dans différents organites subcellulaires, démêlant finalement la cinétique de la régulation cellulaire.