Name: Microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez la microscopie à feuille de lumière pour visualiser les cellules immunitaires humaines en trois dimensions dans une matrice de collagène. Cette méthode permet de suivre la migration cellulaire avec une réduction significative du photoblanchiment.

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Nous remercions l’Institut Hemostaseology clinique et médecine de Transfusion pour la fourniture de sang du donneur ; Carmen Hässig et Cora Hoxha pour l’aide technique excellente. Nous remercions Jens Rettig (Université de la Sarre) pour le vecteur mis à jour le pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Université de Münster) pour la construction de LifeAct-Ruby originale et Christian Junker (Université de la Sarre) pour générer la construction LifeAct-mEGFP. Ce projet a été financé par Sonderforschungsbereich 1027 (projet A2 à B.Q.) et 894 (projet A1 à M.H.). Le microscope de lumière-feuille a été financé par la DFG (GZ : FUGG 19-1 INST 256/4).

Les recherches menées pour la présente étude avec le matériel humain (chambres de système réduction leucocytaire de donneurs de sang humain) sont autorisé par le Comité d’éthique local (déclaration de 16.4.2015 (84/15 ; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) et suit les directives correspondantes.
1. préparation de la Solution de collagène neutralisée (500 µL)
<ol><li>Transférer 400 µL de la solution mère de collagène réfrigérés (10,4 mg/mL) dans un tube stérile de 1,5 mL sous le capot de la culture cellulaire. Lentement, ajouter 50 µL de réfrigérée 10 x PBS (pH de 7,0 à 7,3) à 400 µL de solution mère de collagène réfrigérés. Mélanger la solution de carrelage doucement le tube. Remarque : Toutes les étapes dans la partie 1 doivent se faire sous une hotte de culture cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 8 µL de NaOH 0,1 M en 500 µL de la solution de collagène de 1,1. pour ajuster le pH à 7,2 et 7,6. Utilisez les bandelettes de test pH (gamme de pH : 6-10) pour déterminer la valeur pH du mélange. Remarque : Les Volumes peuvent varier pour les différents lots de collagène. Solution de NaOH doit être mélangé lentement pour éviter les bulles d’air. Le mélange doit être maintenu sur la glace pour éviter la formation de collagène.</li>
	<li>Ajouter 2 µL de ddH stérile2O pour transformer le volume final à 500 µL. bien mélanger et conserver cette solution de collagène (8,32 mg/mL) sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure. Remarque : Dans ces conditions, neutralisé collagène peut être utilisé pendant 24 h. parties aliquotes ne sont pas recommandés pour éviter les bulles d’air.</li>
</ol>2. préparation pour la microscopie de Fluorescence lumière-feuille à l’aide de capillaires
<ol><li>Fluorescent étiqueter les cellules vivantes d’intérêt avec les colorants fluorescents primaire désiré15 ou protéines fluorescentes11 comme décrit plus haut.</li>
	<li>Transférer 1 × 106 cellules dans un tube stérile de 1,5 mL sous une hotte de culture cellulaire. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 8 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 200 µL de milieu de culture. Remarque : La densité cellulaire de 5 × 106 cellules/mL est recommandée pour la visualisation de la migration des cellules immunitaires humaines, surtout pour les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses naturelles (NK).</li>
	<li>Ajouter 85,9 µL de solution neutralisée collagène de 1,3. dans la suspension cellulaire de 2,2. et mélanger correctement pour atteindre une concentration de collagène de 2,5 mg/mL. Laisser le mélange cellulaire/collagène sur glace dans la hotte. Remarque : Supposons que la concentration désirée du collagène est N mg/mL, a neutralisé le volume de solution de collagène (pour 200 µL de la suspension cellulaire) = 200 × N /(8.32-N)</li>
	<li>Ensuite, mettre le piston correspondant dans le capillaire (diamètre intérieur ~ 1 mm) jusqu'à ce que le piston soit 1 mm sur le tube capillaire. Mouiller le piston en plongeant dans le milieu de culture (Figure 1 a). Remarque : Cette étape permettrait d’éviter les bulles d’air lorsque le capillaire est plongé dans le mélange de cellule/collagène. Le capillaire et le piston n’ont pas à être stérile.</li>
	<li>Plonger le tube capillaire dans le mélange de cellule/collagène de 2,3. Tirez lentement sur le piston arrière pour 10-20 mm (Figure 1 b). Essuyer la paroi extérieure du capillaire avec un essuie-tout humidifié avec un spray d’éthanol 70 % pour supprimer la solution restante de collagène.</li>
	<li>Monter le tube capillaire avec le modelage d’argile sur la paroi d’un tube de 5 mL et placer le mélange de cellule/collagène sur le bord du capillaire (Figure 1).</li>
	<li>Gardez le tube capillaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 1 h pour la polymérisation de collagène.</li>
	<li>Ajouter le milieu de culture (environ 1 à 2 mL) dans un tube de 5 mL. Soigneusement, appuyer sur le piston de collagène polymérisé out dans le milieu à environ 3/4 du collagène suspendus dans le milieu (Figure 1).</li>
	<li>Gardez le capillaire, comme ça, à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 30 min à équilibrer la tige de collagène avec le milieu. Remarque : Par la suite, la tige de collagène peut être tiré vers l’arrière dans le capillaire et d’élevage supplémentaire avant d’utiliser.</li>
</ol>3. image Acquisition microscope à lumière-feuille
<ol><li>Assemblée de la chambre de mesure selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Allumez l’incubation et le microscope pour chauffer la chambre de mesure à 37 ° C (pour l’imagerie de cellules vivantes seulement).</li>
	<li>Placer le tube capillaire dans le compartiment de mesure et de localiser l’échantillon pour trouver la zone d’intérêt pour l’acquisition d’images.</li>
	<li>Activer la laser(s) correspondante. Définissez les paramètres suivants : laser puissance, durée d’exposition, étape-taille de position z-pile, de début et de fin de z-pile et l’intervalle de temps pour l’imagerie de cellules vivantes. Remarque : par exemple, l’exemple à la Figure 2 a été photographié chaque 40 s pendant 6 h à 37 ° C, avec une taille de palier 1 µm (épaisseur totale : 538 µm). La puissance du laser était de 1 % avec un temps de pose de 30 m la taille en pixels à l’axe x-y est 0,23 µm.</li>
	<li>Démarrer l’acquisition de l’image.</li>
</ol>4. automatisée d’analyse de suivi
<ol><li>Ouvrir le convertisseur de fichier, cliquez sur Ajouter des fichiers pour choisir l’ou les fichiers d’imagerie à convertir dans le format de fichier du logiciel (*.ims). Cliquez sur Parcourir et sélectionnez un dossier dans lequel enregistrer les fichiers convertis. Cliquez sur Démarrer Tous.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’analyse. Cliquez sur le surpasser. Allez dans fichier et cliquez sur ouvrir, puis choisissez le fichier image à analyser. Remarque : Si la taille du fichier est grande cette étape peut prendre de temps. Fichiers de plus de 1 téraoctet (to) ne sont pas recommandés pour une expérience unique dans le processus de ces gros fichiers sont hautement calcul capacité exigeant.</li>
	<li>Cliquez sur ajouter de nouveaux Spots. Cochez la case Processus toute Image enfin. Cliquez sur suivant.</li>
	<li>Entrez les coordonnées x et y (en pixels) pour définir la zone d’intérêt. Entrez le nombre d’images (temps et z-position) à analyser. Cliquez sur suivant.</li>
	<li>Sélectionnez la chaîne cible, qui contient les objets à être l’objet d’un suivi, dans la liste déroulante du Canal Source. Renseignez estimée xy diamètre (µm). Cliquez sur suivant. Remarque : Diamètre estimé xy est le diamètre moyen dans la dimension x-y d’objets à suivre.</li>
	<li>Cliquez sur qualité. Définir un seuil, dans lequel la plupart des cellules (objets) devraient être incluse. Cliquez sur suivant.</li>
	<li>Choisir l’algorithme souhaité (Autoregressive Motion est recommandé). Entrez la distance max (il est recommandé de20 µm ) et la taille de l’écart maximum (3 ou 2 est recommandée). Cliquez sur le processus entier d’images enfin. Remarque : Distance Max et Max écart taille sont deux seuils pour briser les titres. Plus précisément, dans les deux cadres continus lorsque la distance entre le même objet dépasse la distance Max, cet objet dans le cadre plus tard est considéré comme un nouvel objet. Parfois lors de l’acquisition, le même objet peut disparaître pour quelques images et apparaître à nouveau. Dans ce cas, seulement lors cet objet réapparaît au sein de la taille d’écart Max, elle est considérée comme l’objet même.</li>
	<li>Cliquez sur le Type de filtre , choisissez l’option d’exclure des pistes non désirés. Remarque : Cette étape est facultative.</li>
	<li>Cliquez sur suivant et puis cliquez sur Terminer. Remarque : Cette étape peut prendre des heures à jours en fonction des performances de calcul.</li>
	<li>Cliquez sur Modifier les titres et choisissez Dérive Correct. Sélectionnez l’algorithme approprié (Drift translationnelle est recommandé). Sélectionnez le Résultat Dataset taille (Taille nouveau égal à la taille actuelle est recommandé). Cliquez sur OK. Remarque : Cette étape n’est nécessaire quand le collagène dérivé lors de l’acquisition de l’image.</li>
	<li>Cliquez sur statistiques et choisissez Configurer liste de statistiques valeurs visibles. Vérifiez les options d’intérêt à être exporté (p. ex., coordonnées, vitesse et ainsi de suite). Cliquez sur OK.</li>
	<li>Cliquez sur Exporter toutes les statistiques de fichier et entrez le nom du fichier.</li>
</ol>5. fixation et Immunofluorescence souillant des cellules dans des Matrices de collagène
<ol><li>Transférer 1 000 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA, dans du PBS) dans un tube de 5 mL sous une hotte chimique. Remarque : IFP doit être équilibré à température ambiante.</li>
	<li>Plonger le tube capillaire avec collagène polymérisée de 2,9. dans la solution de la PFA (pour ~ 5 mm) et monter le capillaire sur la paroi interne du tube 5 mL avec le modelage d’argile (comme illustré à la Figure 1).</li>
	<li>Appuyez doucement sur le piston jusqu'à ce que la moitié de la tige de collagène est suspendu dans la solution de la PFA (Figure 1). Maintenir le tube à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Sortez le capillaire et jeter la PFA.</li>
	<li>Monter le capillaire dans un nouveau tube et ajouter 1 mL de PBS. Assurez-vous que le tube capillaire est plongé dans du PBS.</li>
	<li>Appuyez doucement sur le piston jusqu'à ce que la moitié de la tige de collagène est suspendu dans la solution. Monter le capillaire sur la paroi intérieure avec le modelage d’argile.</li>
	<li>Maintenir le tube à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>5.4 le répète. -5.7 pour un autre 2 fois.</li>
	<li>Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Jeter les PBS. Transférer 1 à 2 mL de tampon de blocage/perméabilisation (1-% de BSA, PBS + surfactant non ionique de 0,1 %) dans le tube et répétez 5,6. Remarque : La BSA (1 %) peut être remplacée par 5 % de sérum de l’animal dans que l’Ab secondaire a été soulevée.</li>
	<li>Maintenir le tube à température ambiante pendant 30-60 min.</li>
	<li>Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Jeter le tampon perméabilisation. 200-500 µL de l’anticorps primaire dans un tampon bloquant/perméabilisation de transfert et expulse la tige dans la solution.</li>
	<li>Maintenir le tube à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Lavez la tige de collagène 3 fois avec PBST (PBS + surfactant non ionique - 0,1 %), comme décrit au point 5.4. -5,8.</li>
	<li>Incuber la tige dans l’anticorps secondaire dans un tampon bloquant/perméabilisation pendant 1 h à température ambiante. Garder de la lumière.</li>
	<li>Lavez la tige de collagène 3 fois avec du PBS comme décrit au point 5.4. -5,8.</li>
	<li>Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Conserver les échantillons dans du PBS jusqu’en imagerie.</li>
	<li>Analyser les échantillons comme décrit dans 3.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, financier ou commerciaux.

La plupart des essais in vitro sont réalisées sur une surface 2D, par exemple dans les plaques de culture cellulaire, Pétri ou à lamelles, considérant que l’expérience in vivo des cellules, en particulier les cellules immunitaires, pour la plupart un micro-environnement 3D. Des preuves nouvelles montre que les patrons de migration des cellules immunitaires diffèrent entre 2D et 3D de scénarios17. En outre, les profils d’expression des cellules tumorales sont également différents ...

La plupart des connaissances sur la migration cellules vient de 2D expériences1,2,3, qui sont normalement effectués dans un verre ou une surface en plastique d’une culture/imagerie plat. Toutefois, un scénario physiologique exige, dans la plupart des cas, un micro-environnement 3D, dans laquelle la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle décisif. ECM non seulement fournit l’essentiel de la structure 3D afin de maintenir la morphologie cellulaire appropriée, mais offre également des signaux de survie ou des indications directionnelles pour un fonctionnement optimal de nombreuses cellules4,5 . Par conséquent, il faut un environnement 3D pour mieux identifier les fonctions cellulaires et le comportement dans un environnement reflétant mieux le contexte physiologique.
Dans le corps humain, la plupart des cellules en particulier les cellules immunitaires, exercent leurs fonctions selon un scénario 3D. Par exemple, les lymphocytes T activés patrouillent tissus recherchant des cellules cibles, cellules naïves T migrent dans les ganglions lymphatiques dans la recherche de leurs cellules présentatrices d’antigène apparentés au cours de laquelle le mode de migration et les machines sont adaptées aux correspondants extracellulaire environnement,3,6,7. Le gel de collagène 3D a été largement utilisé comme une cellule 3D bien établies et bien caractérisé la culture système8,9,10. Nos travaux antérieurs montre que les lymphocytes humains primaires sont très mobiles et migrent à une vitesse moyenne d’environ 4,8 µm/min dans une matrice à base de collagène de 0,25 %11. Réarrangement du cytosquelette joue un rôle clé dans la migration de cellules12. Accumulation de preuves montre que les lymphocytes ne s’appliquent pas seulement à un seul mode de migration mais peuvent passer d’un certain comportement de migration selon l’emplacement, cytokines, microenvironnement, gradient chimiotactique et des signaux extracellulaires qui tune le comportement migratoire dans différentes manières 3.
Pour analyser efficacement les fonctions des cellules immunitaires et comportement, par exemple, migration, formation de protrusion ou le transport vésiculaire, c’est un avantage pour être en mesure d’acquérir des images dans des quantités relativement importantes de 3D de manière rapide et fiable. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) offre une solution satisfaisante13,14. Au cours de l’acquisition de l’imagerie, une mince feuille de lumière statique est générée pour éclairer l’échantillon. De cette façon, sur le plan focal, une grande surface peut être illuminée simultanément sans affecter les cellules hors plan. Cette fonctionnalité permet une vitesse d’acquisition élevée avec un blanchiment drastiquement réduite et la photocytotoxicité. Dans cet article, nous décrivons comment visualiser des cellules immunitaires humaines primaires microscope à lumière-feuille et comment analyser la migration dans un scénario de 3D.

<table><tbody><tr><td>Fibricol, solution de collagène bovin</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>&nbsp ;#5133-20ML</td><td>Matrice de collagène</td></tr><tr><td>0,5 M Solution NaOH</td><td>Merck</td><td>1091381000</td><td>pour neutraliser la solution Fibricol</td></tr><tr><td>Agarose à fusion ultra-faible</td><td>Affymetrix</td><td>32821-10GM</td><td>Préparation d’échantillons dans des cellules T CD8 humaines à faible teneur en c[Col]</td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD8 Cell Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>11348D</td><td>Isolement des lymphocytes T CD8+ primaires humains à partir de PBMC</td></tr><tr><td>Dynabeads Activateur T humain CD3/CD28 pour l’expansion et l’activation des lymphocytes</td><td>T Thermo Fisher</td><td>11132D</td><td>Activation des populations de CTL</td></tr><tr><td>Interleukine-2 recombinante humaine</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC0023</td><td>Stimulation de CTL</td></tr><tr><td>P3 en culture Kit de solution primaire</td><td>Lonza</td><td>V4XP-30XX</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>Anticorps &alpha ;-PFN1, lapin, IgG</td><td>Abcam</td><td>ab124904</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22284</td><td>IF</td></tr><tr><td>CellMask Orange Membrane plasmique Stain Thermo</td><td>Fisher</td><td>C10045</td><td>Fluorescent cell</td></tr><tr><td>label Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-250mL</td><td>IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Eurobio</td><td>018774</td><td>IF</td></tr><tr><td>DPBS Solution saline tamponnée au phopsphhate de Dulbecco</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td>IF</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A9418-100G</td><td>IF</td></tr><tr><td>Chèvre & alpha ; Rabbit 568, IgG, rabbit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11011</td><td>IF</td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 (Microscopie à feuillet de lumière)</td><td>Zeiss</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Hotte de culture cellulaire</td><td>Thermo Fisher</td><td>HeraSafe KS</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire HERACell 150i&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuses 5418 et 5452</td><td>Eppendorf</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pippettes</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pippette pointes</td><td>VWR</td><td>89079-444, 89079-436, 89079-452&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp ; 62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires 50 & micro ; L</td><td>VWR (Marque)</td><td>613-3373</td><td>Zeiss LSFM Préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>Piston pour capillaires</td><td>VWR (Marque)</td><td>BRND701934</td><td>"Tampons avec pointe en téflon » Préparation d’échantillons LSFM</td></tr><tr><td>MColorPhast Pointes de pH</td><td>Merck</td><td>1095430001</td><td>pour tester le pH des seringues neutralisées Fibricol</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1mL</td><td>BD</td><td>Z230723&nbsp ; ALDRICH</td><td>Préparation alternative d’échantillons</td></tr><tr><td>Pâte à modeler (Hasbro Play-Doh A5417EU7)</td><td>Play-Doh</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Imaris file converter</td><td>Bitplane</td><td>disponible à l’adresse http ://www.bitplane.com&nbsp ;</td><td>Convertir des fichiers d’imagerie au format de fichier Imaris</td></tr><tr><td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td><td>Bitplane</td><td>disponible à l’adresse http ://www.bitplane.com&nbsp ;</td><td>Analyse de données d’imagerie 3D et 4D</td></tr></tbody></table>

microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, l’activation, la prolifération et la fonction des cellules immunitaires tous se produisent dans un environnement de tridimensionnel (3D), par exemple dans les ganglions lymphatiques ou des tissus. Jusqu'à date, la plupart des systèmes in vitro reposent sur une surface bidimensionnelle (2D), tels que plaques de culture cellulaire ou de lamelles. De façon optimale de reproduire les conditions physiologiques in vitro, nous utilisons une matrice de collagène 3D simple. Collagène est l’une des principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) et a été largement utilisé pour constituer des matrices 3D. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) est décrit avec acquisition haute vitesse, grande profondeur, faible de blanchiment et photocytotoxicité. En outre, microscopie à lumière-feuille est particulièrement avantageuse pour la mesure à long terme. Nous décrivons ici un protocole optimisé comment configurer et gérer les cellules immunitaires humaines, par exemple primaire humains lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses naturelles (NK) dans la matrice de collagène 3D pour une utilisation avec la microscopie en lumière-feuille pour l’imagerie de cellules vivantes et échantillons fixes. La procédure d’acquisition d’images et analyse de la migration cellulaire sont présentés. Une attention particulière est donnée pour mettre en évidence les étapes critiques et des facteurs pour la préparation des échantillons et l’analyse des données. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans une matrice de collagène 3D et n’est pas limité aux cellules immunitaires.

Formation de saillie au cours de la migration des cellules T est un processus très dynamique, qui est dépendante de l’actine. Pour visualiser la formation de saillie de CTL humain primaire, nous transfectées transitoirement une protéine mEGFP fusionné pour étiqueter le cytosquelette d’actine en CTL comme décrit avant11. Un jour après la transfection, les cellules ont été incorporés dans la matrice de collagène. Piles d’images ont été acquises chaque 40 s avec une t...

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les cellules immunitaires noyées dans une matrice tridimensionnelle (3D) collagène microscope à lumière-feuille. Ce protocole précise également comment suivre la migration cellulaire en 3D. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans la matrice 3D.

Microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que le comportement exact des cellules immunitaires dans un contexte physiologiquement pertinent, comme la recherche efficace de cellules cibles dans un environnement tridimensionnel. Le principal avantage de cette méthode est de générer une très fine feuille de lumière pour éclairer uniquement le plan focal sans affecter les cellules hors plan. Cela permet une vitesse d’acquisition très rapide avec une réduction prononcée du blanchiment et de la photocytotoxicité.La démonstration de cette procédure sera faite par le Dr Renping Zhao, un post-doctorant de mon laboratoire. Pour commencer, sous une hotte de culture cellulaire, transférez 400 microlitres de solution mère de collagène réfrigérée dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Ajoutez lentement 50 microlitres de 10X PBS réfrigéré.Mélangez ensuite la solution en inclinant doucement le tube. Ajoutez 48 microlitres d’hydroxyde de sodium à 0,1 molaire à la solution de collagène pour ajuster le pH à 7,2 à 7,6. Utilisez des bandelettes de test de pH pour déterminer la valeur du pH du mélange.Ajoutez deux microlitres d’eau distillée déminé

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de microscopie à feuillet de lumière sur réseau pour visualiser les interactions entre les lymphocytes T vivants et les cellules présentatrices d’antigènes. Le procédé consiste à focaliser une feuille de lumière en réseau ultramince sur une paire de cellules en interaction pour obtenir une série d’images bidimensionnelles, qui sont combinées pour obtenir des images quadridimensionnelles à haute résolution qui révèlent la dynamique spatio-temporelle...

Microscopie à feuillet de lumière sur réseau pour visualiser les interactions récepteur-ligand dans les cellules vivantes

Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Ce protocole décrit la configuration d'une feuille microscope optique et sa mise en œuvre pour l'imagerie in vivo de C. elegans embryons.

Configuration d&#39;une nappe de lumière Microscope simple pour<em&gt; En Toto</em&gt; Imagerie de<em&gt; C. elegans</em&gt; Développement

Un module de plan unique éclairage microscopie (SPIM) est décrit qui est facilement adapté à un microscope à grand champ inversé et optimisée pour des cultures de cellules en 3 dimensions. L'échantillon se trouve à l'intérieur d'un capillaire rectangulaire, et par l'intermédiaire d'un micro-fluidiques colorants fluorescents de système, des agents pharmaceutiques ou des médicaments peut être appliquée dans de petites quantités.

Simple Plan Illumination module et l&#39;approche micro-capillaire pour un microscope à grand champ

Nous décrivons ici un workflow complet pour l’analyse qualitative et quantitative du système immunitaires synapses entre les cellules T humaines primaires et les cellules présentatrices d’antigène. La méthode est basée sur l’imagerie cytométrie en flux, qui permet l’acquisition et l’évaluation de plusieurs images de milliers de cellules dans un délai relativement court.

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

Ici, nous décrivons une approche de microscopie de feuille lumineuse pour visualiser l'infiltration de leucocytes CD45 + cardiaque dans un modèle murin de myocardite fulminante aseptique, qui est induite par le traitement intratrachéal de la toxine diphtérique des souris CD11c.DTR.

Visualisation quantitative de l&#39;infiltration de leucocytes dans un modèle murin de myocardite fulminante par microscopie à feuilles lumineuses

Cette étude utilise une technique de microscopie (LSFM) de fluorescence lumière-feuille recto-verso illumination combinée avec compensation optique pour étudier le coeur murin.

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

Le but de ce protocole est de montrer comment utiliser la microscopie lattice Light-Sheet pour visualiser en quatre dimensions la dynamique des récepteurs de surface dans les cellules vivantes. Ici, les récepteurs des lymphocytes T sur les lymphocytes T CD4et primaires sont montrés.

Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

Ce protocole décrit en détail comment construire un microscope à fluorescence à feuillet de lumière à objectif unique et son utilisation pour visualiser les réseaux de cytosquelettes.

Conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes

Découvrez la microscopie à feuille de lumière pour visualiser les cellules immunitaires humaines en trois dimensions dans une matrice de collagène. Cette méthode permet de suivre la migration cellulaire avec une réduction significative du photoblanchiment.

Microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines

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