Microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que le comportement exact des cellules immunitaires dans un contexte physiologiquement pertinent, comme la recherche efficace de cellules cibles dans un environnement tridimensionnel. Le principal avantage de cette méthode est de générer une très fine feuille de lumière pour éclairer uniquement le plan focal sans affecter les cellules hors plan. Cela permet une vitesse d’acquisition très rapide avec une réduction prononcée du blanchiment et de la photocytotoxicité.

La démonstration de cette procédure sera faite par le Dr Renping Zhao, un post-doctorant de mon laboratoire. Pour commencer, sous une hotte de culture cellulaire, transférez 400 microlitres de solution mère de collagène réfrigérée dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Ajoutez lentement 50 microlitres de 10X PBS réfrigéré.

Mélangez ensuite la solution en inclinant doucement le tube. Ajoutez 48 microlitres d’hydroxyde de sodium à 0,1 molaire à la solution de collagène pour ajuster le pH à 7,2 à 7,6. Utilisez des bandelettes de test de pH pour déterminer la valeur du pH du mélange.

Ajoutez deux microlitres d’eau distillée déminéralisée stérile pour porter le volume final à 500 microlitres. Mélangez bien et conservez la solution de collagène sur de la glace ou à quatre degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Après avoir marqué par fluorescence les cellules vivantes selon le protocole de texte, sous le capot de culture cellulaire, transférez une fois 10 à la sixième cellules dans un tube stérile de 1,5 millilitre.

Centrifugez le tube à 200 fois g pendant huit minutes. Jetez ensuite le surnageant et utilisez 200 microlitres de milieu de culture pour remettre la pastille en suspension. Ajoutez 85,9 microlitres de la solution de collagène neutralisé à la suspension cellulaire et mélangez correctement pour atteindre une concentration de collagène de 2,5 milligrammes par millilitre.

Laissez le mélange de collagène cellulaire sur de la glace dans le capot. Ensuite, insérez un piston dans le capillaire correspondant jusqu’à ce que le piston dépasse d’un millimètre du capillaire. Mouillez ensuite le piston en le trempant dans le milieu de culture.

Sauter cette étape peut entraîner l’introduction indésirable de bulles d’air entre le piston et la matrice de collagène. Trempez le capillaire dans le mélange de collagène cellulaire et tirez lentement le piston vers l’arrière de 10 à 20 millimètres. Ensuite, avec un flacon pulvérisateur de 70 % d’éthanol, humidifiez une serviette en papier et utilisez-la pour essuyer la paroi externe du capillaire afin d’éliminer la solution de collagène restante.

Utilisez maintenant de la pâte à modeler pour monter le capillaire sur la paroi interne d’un tube de cinq millilitres. Poussez le mélange de collagène cellulaire vers le bord du capillaire. Ensuite, incubez le tube avec le capillaire à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant une heure pour polymériser le collagène.

Après l’incubation, ajoutez un à deux millilitres de milieu de culture dans le tube. Ensuite, expulsez soigneusement la tige de collagène polymérisé dans le milieu jusqu’à ce qu’environ la moitié du collagène soit suspendue dans le milieu. Incuber le capillaire pendant encore 30 minutes.

Pour effectuer la microscopie à feuillet de lumière, assemblez la chambre d’échantillonnage selon les instructions du fabricant. Après avoir allumé le microscope et l’incubateur si vous effectuez une imagerie en direct, placez le capillaire dans la chambre d’échantillonnage, localisez l’échantillon et trouvez la zone d’intérêt pour l’acquisition d’images. Activez les lasers correspondants.

Réglez ensuite la puissance du laser et le temps d’exposition. Définissez également la taille du pas de la pile Z, les positions de début et de fin de la pile Z et l’intervalle de temps pour l’imagerie de cellules vivantes. Lancez ensuite l’acquisition de l’image.

Transférez un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS dans un tube de cinq millilitres sous une hotte chimique. Trempez ensuite le capillaire avec le collagène polymérisé dans la solution de paraformaldéhyde et utilisez de la pâte à modeler pour monter le capillaire sur la paroi interne du tube. Appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que la moitié de la tige de collagène soit suspendue dans la solution de paraformaldéhyde.

Tirez ensuite sur le piston pour ramener la tige de collagène dans le capillaire. Retirez le capillaire du tube et jetez le paraformaldéhyde. Montez le capillaire dans un tube frais et ajoutez un millilitre de PBS.

Assurez-vous que le capillaire est immergé dans le PBS. Appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que la moitié de la tige de collagène pende dans la solution et incubez pendant cinq minutes. Tirez le piston vers l’arrière pour prendre la tige de collagène dans le capillaire.

Remplacez ensuite le PBS par du PBS frais et expulsez la tige de collagène dans la solution. Après le troisième lavage, ajoutez un à deux millilitres de tampon de perméabilisation bloquant dans le tube. Expulsez la tige de collagène dans la solution et incubez le tube à température ambiante pendant 30 à 60 minutes.

Remplacez le tampon de perméabilisation bloquant par 200 à 500 microlitres d’anticorps primaires dans le tampon de perméabilisation bloquant et incubez le bâtonnet de collagène immergé dans la solution pendant une heure. Après avoir utilisé PBST pour laver la tige de collagène trois fois, incubez la tige dans des anticorps secondaires dans un tampon de perméabilisation bloquant à température ambiante pendant une heure. Après trois autres lavages dans le PBS, ramenez la tige de collagène dans le capillaire et conservez l’échantillon dans le PBS jusqu’à l’imagerie.

Comme on le voit dans ce film, pendant la migration, les cellules CTL transfectées avec une protéine de fusion d’actine EGFP ont formé des protubérances majeures en forme de citron, frangées de fines structures fusiformes. Les trajectoires des chargeurs linéaires sont illustrées ici avec la vitesse et la persistance ou le déplacement divisé par la longueur totale de la piste comme paramètres mesurés. Les vitesses varient de 0,01 à 0,19 micron par seconde avec une différence de près de 20 fois et la persistance varie de zéro à 0,7.

Cette figure montre des cellules CTL fixes dans un gel de collagène 3D coloré pour la perforine-1 endogène et l’actine. L’échantillon a été éclairé d’un seul côté ou des deux côtés. À partir de différentes positions Z, les cellules sont uniformément colorées, ce qui indique une bonne pénétration des anticorps dans les gels de collagène.

Les CTL fixes présentaient la même morphologie que les cellules vivantes, ce qui indique que la morphologie est bien maintenue avec ce protocole. Lors de cette procédure, il est très important de se rappeler d’éviter les bulles d’air et d’ajuster correctement la valeur du pH. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la coloration de cellules vivantes avec des molécules de surface particulières, peuvent être mises en œuvre pour répondre à des questions supplémentaires telles que la corrélation entre le comportement cellulaire et la différenciation ou avec différents sous-types cellulaires, ou pour étudier l’interaction cellule-cellule et le destin cellulaire.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire, de l’immunologie et de la recherche sur le cancer pour explorer le comportement cellulaire, le destin cellulaire, la différenciation et l’interaction cellulaire dans le système in vitro le plus pertinent sur le plan physiologique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’échantillons avec des cellules intégrées dans une matrice de collagène tridimensionnelle, de la visualisation d’échantillons à l’aide de la microscopie à feuillet de lumière, en direct ou fixe, et du suivi de la migration cellulaire en 3D.