Lorsque vous coupez des questions : Une Dissection et Guide de l’analyse de l’Orientation spatiale de la rétine de souris de repères oculaires

Le but de ce protocole de dissection est de fournir une méthodologie standardisée pour l’utilisation de repères anatomiques oculaires, tels que les muscles droits, la fissure choroïde et le gradient S-opsin pour l’orientation topographique de la rétine de la souris. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles offrent un moyen fiable d’identifier avec précision les pôles dorsal, ventral, nasal et temporal d’une rétine de souris isolée. Commencez par identifier un point sur la cornée dorsale près du bord de la cornée sclérotique et entre les canthi nasal et temporal.

Touchez la cornée avec un stylo cautérisé chauffé pendant moins d’une seconde pour créer une marque de brûlure à des fins d’orientation. Répétez l’opération pour le deuxième œil. La présence de la brûlure dorsale permet d’identifier le muscle droit supérieur.

Pour l’énucléation, utilisez une pince incurvée pour pousser doucement l’œil hors de son orbite et saisir le globe par le dessous. Ensuite, soulevez lentement le globe de sa douille tout en le déplaçant doucement de gauche à droite jusqu’à ce que le globe soit libéré de la douille. Transférez le globe avec les muscles droits attachés dans une boîte de Pétri contenant un moyen de dissection.

Si vous travaillez avec les deux yeux, assurez-vous de garder une trace de l’œil gauche et de l’œil droit. Sous l’endoscope de dissection, localisez visuellement la brûlure cornéenne dorsale et identifiez le muscle droit supérieur auquel elle est associée. À l’aide de ciseaux de dissection ou d’une aiguille de calibre 20, percez la cornée au niveau de la marque de brûlure.

Ensuite, faites une coupe de soulagement profonde dans le globe vers le nerf optique pour couper en deux le muscle supérieur. Une rétine isolée avec cette coupe est vue ici, et une rétine reconstruite avec cette coupe est montrée ici. À l’aide de deux paires de pinces, commencez à isoler la rétine en déchirant doucement le trou fait par la ponction jusqu’à ce qu’une partie de la rétine soit exposée.

Ensuite, séparez la rétine de la sclérotique jusqu’à ce que la sclère ait été complètement retirée. Retirez l’iris, le cristallin, le vitré et toutes les structures restantes jusqu’à ce que la rétine soit complètement isolée. La présence d’une brûlure dorsale permet d’identifier la fissure choroïde nasale et temporale.

Si vous travaillez avec l’œil droit, la fissure choroïde nasale est située à droite de la brûlure et la fissure choroïde temporale est située à gauche de la brûlure. C’est l’inverse du travail avec l’œil gauche. Pour utiliser le point de repère de la fissure choroïde pour identifier l’orientation de la rétine, localisez et identifiez la fissure choroïde à l’arrière de l’œil.

Orientez le globe de manière à ce que la marque de brûlure dorsale soit située au pôle supérieur, comme ce serait le cas si l’œil était encore dans la souris. Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection ou une aiguille de calibre 20 pour faire une ponction dans le globe, d’abord là où se trouve la brûlure dorsale. Ensuite, faites une coupe de soulagement peu profonde vers le nerf optique où se trouve la brûlure cornéenne dorsale.

Ensuite, faites les deux coupes de soulagement profondes suivantes vers le nerf optique. L’une en alignant les lames des ciseaux de dissection avec la ligne de fissure choroïde temporale à l’arrière de l’œil, et l’autre en alignant les lames des ciseaux de dissection avec la ligne de fissure choroïde nasale à l’arrière de l’œil. Ces coupures sont montrées ici sur une rétine isolée et reconstruite.

Après avoir fait ces coupes, utilisez deux paires de pinces pour déchirer doucement les trous de perforation jusqu’à ce qu’une partie de la rétine soit exposée. À l’aide de ciseaux de dissection, faites quatre incisions de soulagement dans la rétine afin qu’elle repose à plat. Montez la rétine, côté cellule ganglionnaire vers le haut, sur une membrane de nitrocellulose en appuyant doucement chaque coin de la rétine sur la membrane à l’aide d’une pince.

Ensuite, à l’aide d’une pince, vous pouvez immerger la rétine montée dans un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % contenu dans le premier puits d’une plaque à 24 puits. Placez la plaque de 24 puits sur un agitateur orbital à température ambiante et fixez la rétine pendant exactement 40 minutes. Après la fixation, transférez la rétine dans le deuxième puits de la plaque, qui est rempli d’un millilitre de PBS 0,1 molaire et lavez la rétine pendant 15 minutes à température ambiante.

Une fois le lavage terminé, transférez la rétine montée dans le cinquième puits contenant un millilitre de solution bloquante et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, ajoutez l’anticorps primaire anti-S-opsine de lapin à la solution bloquante à une concentration de un à 500 et incubez pendant trois jours à quatre degrés Celsius. Après l’incubation de trois jours, lavez l’excès d’anticorps primaire de la rétine six fois en le plaçant séquentiellement dans six puits remplis d’un millilitre de PBS pendant 10 minutes chacun à température ambiante.

Placez ensuite la rétine lavée dans un puits avec une solution de blocage fraîche et ajoutez l’anticorps secondaire anti-lapin Alexa 594. Incuber la rétine avec l’anticorps secondaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, lavez la rétine dans du PBS six fois, comme précédemment.

À l’aide d’une pince, transférez la rétine montée dans une boîte de Pétri contenant du PBS. Libérez la rétine de la membrane de nitrocellulose en insérant doucement les pointes de la pince entre la rétine et la membrane jusqu’à ce que la rétine ne soit plus attachée. Plongez une lame de microscope en verre dans le PBS et montez la rétine sur la lame en la faisant flotter sur la lame et en la poussant doucement avec une pince jusqu’à ce que la rétine adhère au verre.

Couvrez la rétine de la lame avec un support de montage et placez une lamelle de protection 1,5. Mettez la lame dans un plateau à lames et laissez-la reposer à température ambiante pendant une heure. Au bout d’une heure, placez le plateau de diapositives à quatre degrés Celsius.

Une fois que la lame a été recouverte pendant 24 heures, utilisez du vernis à ongles pour sceller les côtés de la lame afin d’éviter la dessiccation. Voici un exemple d’une rétine isolée de l’œil droit qui a été immunomarquée pour marquer la S-opsine et imagée avec un microscope à épifluorescence. Il est important de noter que les coupures dans cette rétine sont arbitraires puisque l’orientation topographique peut être identifiée par le gradient S-opsin.

L’image acquise de la rétine peut ensuite être reconstruite numériquement avec le logiciel ReadiStruct. Les coupes originales sont pseudo-colorées en rouge dans cette image. Notez que le fichier de sortie de ce programme n’aligne pas correctement la rétine.

Une fois que la rétine a été passée par le code de laboratoire de tapis personnalisé, la rétine est tournée de sorte que la concentration la plus élevée de coloration à la S-opsine soit placée en bas et identifiée comme la rétine ventrale. Cette image montre la rétine d’un œil gauche. Le pôle temporal est situé à 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre par rapport au pôle ventral et le pôle nasal est situé à 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre à partir du pôle ventral.

Une fois maîtrisées, ces techniques de dissection peuvent être réalisées assez rapidement en quelques minutes si elles sont effectuées correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’orienter avec précision et fiabilité la rétine de la souris en utilisant le muscle droit supérieur, la fissure choroïde ou le gradient S-opsin comme point de repère.