Name: Lorsque vous coupez des questions : Une Dissection et Guide de l’analyse de l’Orientation spatiale de la rétine de souris de repères oculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Apprenez une méthode de dissection standardisée pour orienter précisément la rétine de souris isolée en utilisant les repères anatomiques oculaires comme le muscle droit supérieur, la fissure choroïdienne et le gradient de S-opsine.

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Nous tenons à remercier un jour Bretagne, Jessica Onyak pour leur assistance technique et le Dr Liu de bien vouloir nous laisser utiliser son microscope à épifluorescence. Remerciements de soutien : R15EY026255 NIH-01 et la Fondation de Kirchgessner Karl.

<ol><li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
<li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li>
<li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+ganglion+cell+outer+retinal+dendrites%3A+Morphologically+distinct+and+asymmetrically+distributed+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).</li>
<li>Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+space+is+represented+by+nonmatching+topographies+of+distinct+mouse+retinal+ganglion+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types.</a> Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).</li>
<li>Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhomogeneous+Encoding+of+the+Visual+Field+in+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina.</a> Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).</li>
<li>Valiente-Soriano, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+melanopsin+positive+neurons+in+pigmented+and+albino+mice%3A+evidence+for+melanopsin+interneurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina.</a> Front Neuroanat. 8, 131(2014).</li>
<li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li>
<li>Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+selectivity+in+the+retina%3A+Symmetry+and+asymmetry+in+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).</li>
<li>Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Ikbkap+causes+slow%2C+progressive+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Maiorano, N. A., Hindges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+perinatal+retinal+degeneration+induces+retina+reshaping+and+correlated+structural+rearrangement+of+the+retinotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map.</a> Nat Commun. 4, 1938(2013).</li>
<li>Hadj-Said, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+topographical+analysis+of+the+losses+of+cone+photoreceptors+and+retinal+ganglion+cells+under+taurine+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+topography+of+the+N-Methyl-+N-nitrosourea+induced+photoreceptor+degeneration+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina.</a> Sci Rep. 5, 18612(2015).</li>
<li>Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axogenic+mechanism+enhances+retinal+ganglion+cell+excitability+during+early+progression+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).</li>
<li>Estevez, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+and+function+of+the+M4+cell%2C+an+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+type+contributing+to+geniculocortical+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision.</a> J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+Rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+type%2C+size%2C+and+spacing+can+be+specified+independent+of+homotypic+dendritic+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts.</a> Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).</li>
<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degeneration+and+apoptosis+patterns+of+cone+photoreceptors+in+rd11+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice.</a> J Ophthalmol. 2017, 9721362(2017).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+spatial+organization+of+Muller+glia+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina.</a> J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).</li>
<li>Stabio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+map+of+the+mouse+eye+for+orienting+retinal+topography+in+anatomical+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space.</a> J Comp Neurol. 526 (11), (2018).</li>
<li>Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+vertebrate+eye%3A+Opsins%2C+photoreceptors%2C+retina+and+eye+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).</li>
<li>Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina%3A+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Il n’y a eu aucun protocole exhaustif et normalisé pour la détermination et l’orientation de la rétine de souris isolées dans l’espace anatomique d’étiquetage. Le protocole ici tente de combler cette lacune en normalisant et détaillant l’utilisation de repères anatomiques profondes comme points de référence fiable identifier l’orientation rétinienne. Il a été démontré que les repères anatomiques profondes dans ce protocole fournissent une méthode plus précise et fiable pour orienter la rétine de souris que superficielles monuments tels que brûlure cornéenne22. Ainsi, les études qui sont sont appuyés sur la cornée brûlures rétiniennes orientation ont pu plus erreurs dans l’orientation que les études qui se sont appuyés sur des sites tels que les muscles rectus et fissure choroïde. Cette différence met en évidence la nécessité et l’importance du présent protocole standardisé en ce qui concerne l’interprétation des résultats et de faire des comparaisons entre les études qui dépendent de l’orientation exacte rétinienne. Dans l’ensemble, un protocole standardisé fournira une méthode commune pour les chercheurs de la vision à suivre, ce qui évite la présence d’une variable confusionnelle en acquisition de données qui peut-être se produire avec l’utilisation de méthodes non normalisées pour l’identification rétinienne orientation.
Les méthodes présentées ici sont facilement reproductibles et applicable à de nombreux types de protocoles expérimentaux. En fait, un des grands avantages de ce protocole est sa capacité d’adaptation. Parce que la fissure choroïde, l’expression de s-opsine et points de repère rectus muscle ont été jugées pour identifier de façon fiable l’orientation rétinienne22 le point de repère qui adapte les paramètres expérimentaux peut être choisi pour optimiser l’acquisition de données (Table 1). en outre, les méthodes de dissection peuvent être combinés afin de clarifier davantage l’orientation de la rétine. Par exemple, fissure choroïde coupes peuvent être combinés avec s-opsine immunohistochemistry pour orienter tous les quatre pôles de la rétine : hémisphères nasales et temporelles peuvent être identifiés par les réductions de fissure choroïde, et s-opsine immunohistochimie permet d’identifier hémisphères ventrales et dorsales. Pourtant, la capacité d’adaptation du présent protocole peut-être être limitée par la nature sensible au temps des expériences de physiologie. Parce que le temps que nécessaire pour identifier un point de repère, établir une brûlure cornéenne et exécuter une coupe relève pourrait entraîner la mort tissulaire importante dans les expériences de ex vivo , certaines de ces méthodes de dissection peuvent être moins qu’optimales. Heureusement, une fois un dissecteur s’est familiarisé avec la fissure choroïde ou méthode de dissection de muscle rectus supérieur, identifier les repères profondes et la soulager coupures rapidement devient une partie de la routine de dissection et n’ajoutent pas de manière significative à la longueur de la dissection. Même si nous reconnaissons que les étapes détaillées ici peuvent ajouter ponctuellement à des expériences extrêmement sensibles au temps, nous conseillons d’utiliser le gradient de s-opsine pour post hoc rétinienne orientation lorsque la viabilité du tissu n’est plus un problème (Figure 3 ). La coloration de la rétine pour s-opsine est un moyen efficace d’orienter la rétine, comme il peut identifier tous les quatre pôles : s-opsine coloration divise pôles dorsales et ventrales de la rétine et permet pour identification des nasales et temporelle pôles selon que la rétine est d’un œil droit ou gauche (Figure 3). Par conséquent, nous croyons que ce protocole offre un ensemble fiable et reproductible des méthodes pour l’orientation exacte rétinienne qui peut s’acquitter de tous les paramètres expérimentaux.
Comme avec toute dissection rétinienne modifiée, la validité de la méthode de dissection est limitée par l’exactitude de la dissecteur et la qualité du tissu qui a été isolé. Si n’importe quel tissu est perdu au cours de la dissection ou la rétine est trop tronquée pour reconstruction exacte, Retistruct et le programme MATLAB sera pas en mesure de manière fiable reconstruire ou orienter la rétine. Il est donc important de pratiquer la méthode de dissection avant de l’utiliser pour la collecte de données des expériences. Tandis que les types de dissections expliquées ici ne sont pas difficiles, ils doivent être pratiqués afin d’assurer la répétabilité d’identification rétinienne orientation avec un point de repère particulier. En outre, il est essentiel que la pratique de dissecteur identifier visuellement les repères anatomiques avant de commencer la collecte de données pour s’assurer que le point de repère correct est utilisée. Une façon de vérifier l’exactitude d’un dissecteur particulière est de faire soit fissure choroïde coupes ou muscle droit supérieur coupe et ensuite comparer l’emplacement des incisions au dégradé s-opsine, puisqu’elle est un repère fixe et n’est donc pas tributaire de l’exactitude des dissectio n. dissecteurs potentiels peuvent également comparer leurs rétines reconstruits aux exemples des rétines reconstituées avec point de repère précis coupes sont indiquées à la Figure 1 et la Figure 2. Essentiellement, un dissecteur potentiel doit effectuer les étapes décrites dans le présent protocole pour un type particulier de dissection, qu’il s’agisse du muscle droit supérieur ou choroïde fissure méthode et comparer les résultats au dégradé s-opsine pour établir la validité d’un dissecteur particulière. Car si le dissecteur est incertain au sujet de l’emplacement de l’historique, il peut se produire dans une orientation erronée de la rétine qui permettront, par défaut, affecte interprétation et collecte de données.

Un aspect important et parfois négligé des neurosciences rétinienne est l’orientation correcte et l’analyse de la rétine tout montage isolée, que ce soit l’orientation de la rétine dans une chambre d’enregistrement électrophysiologie ou sur une lame histologique. Cela est particulièrement important pour les études concernant la rétine de souris, qui est actuellement le modèle plus répandu pour les enquêtes du système visuel chez les mammifères. Des découvertes récentes révèlent que la rétine de souris n’est pas uniforme dans l’espace, mais a des gradients de densité et la taille des types de cellules rétiniennes fonctionnellement distinctes, telles que cellules ganglionnaires melanopsin et les cellules ganglionnaires OFF-alpha transitoires opsines des cônes1,2 ,3,4,5. En conséquence, la méthode utilisée pour déterminer l’orientation de la rétine peut influencer les résultats expérimentaux impliquant les cellules type ou opsine distributions2,3,6, direction réglage de direction sélective ganglion cellules7,8,9et les modèles topographiques de dégénérescence rétinienne10,11,12,13,14 . En fait, le pas considérée orientation comment rétinienne est rapportée peut causer divergences dans la littérature et de la confusion lorsque vous essayez de comparer les données entre les études. Il est donc essentiel que les chercheurs déclarent la méthode pour déterminer l’orientation de la rétine afin que les résultats de ces études peuvent être correctement interprétés.
Orientation rétinienne est couramment identifiée en marquant la cornée dorsale, ventrale, nasale ou temporelle avant énucléation oculaire1,3,12,15,16,17 ,18,19 ou par coupure ou coloration repères oeil profond anatomiques tels que les muscles extraoculaires6,7, la choroïde fissure20,21, ou le s-opsine dégradé2,3. Les muscles rectus peuvent servir à identifier le nasal dorsal, ventral, et la rétine temporale en faisant une coupe profonde relaxation qui divise l’attachement de l’autre le rectus supérieur, rectus inférieur, rectus médial ou muscle latéral droit, respectivement. Cependant, pour la plupart des expériences, à l’aide d’un muscle droit est suffisant pour orienter la rétine22. La fissure choroïde, qui est un vestige du développement de le œil, peut être considérée comme une légère ligne horizontale à l’arrière de le œil. Chaque extrémité de cette ligne se termine à la nasale ou le pôle temporal du globe23. Enfin, expression s-opsine est distribuée asymétrique à la rétine ventrale chez les souris, et s-opsine anticorps peuvent être utilisés pour révéler la rétine ventrale dans immunohistochemical expériences1.
Travaux récents de Stabio, et al. 22 a démontré que des monuments oculaires superficielles comme cornéens brûlures sont une méthode moins fiable pour orienter la rétine dans l’espace anatomique, probablement en raison de l’erreur humaine et la variabilité dans la fabrication de la brûlure cornéenne lorsque vous utilisez le temporel et médial canthi comme points de référence. En revanche, monuments profondes, comme le muscle droit supérieur, fissure choroïde et le gradient de s-opsine, ont démontré d’être des repères plus fiables et précises pour orienter la rétine22. Cependant, l’identification de ces repères anatomiques nécessite des étapes de la dissection unique qui ne sont pas décrites en détail dans la littérature. Ainsi, l’objectif du présent protocole est de fournir un tutoriel complet sur la façon d’utiliser le muscle droit supérieur, fissure choroïde et gradient de s-opsine d’identifier avec précision l’orientation spatiale de la rétine de souris. En outre, nous avons inclus une comparaison de l’efficacité des deux anticorps s-opsine, mais aussi un protocole pour immunohistochemistry s-opsine.
Un défi supplémentaire aux études s’appuyant sur l’orientation précise rétinienne est la grosse pièce relève pour aplatir les rétines wholemount sur un plat, chambre d’enregistrement ou une diapositive. Cela peut introduire des défis pour l’analyse de ce qui est naturellement une structure tridimensionnelle lorsqu’il est imagé comme une structure plane à deux dimensions. Un programme appelé Retistruct24 peut servir pour renvoyer un plat wholemount de la rétine à sa structure tridimensionnelle avant que les données recueillies auprès d’elle sont analysées. Ainsi, une section du présent protocole est dédiée à mettre en évidence les étapes qui sont nécessaires pour utiliser le logiciel Retistruct pour reconstruire la rétine de souris s-opsine immunomarquage. Nous avons également inclus une section du protocole pour l’utilisation de notre script personnalisé de MATLAB, qui a été développé à la rétine de souris de précisément faire pivoter et orienter colorées avec s-opsine.

<table><tbody><tr><td>0,1 m de solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Microscope épifluorescent Axioplan2</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Agitateur orbital à basse vitesse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC-Treated 24-well Microscope</td> à dissection <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-Chèvre Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-Lapin Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Normal Serum</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>Utilisation à 5,2 % (52 &mu ; L avec 86 &mu ; L de 20 % Triton X-100 et 863 &mu ; L de 0,1 M PBS pour 1 mL de solution de blocage)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-s-opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp ;</td><td>sc-14363</td><td>Non disponible commercialement à partir de 2017</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ou FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>Logiciel disponible gratuitement</td></tr><tr><td>Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Au moins la version 2007b ou plus récent</td></tr><tr><td>Lunettes Micro Cover&nbsp ;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Plateaux Micro Slide</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira Pince Ultra Fine</td><td>Science Tools&nbsp ;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15714-S</td><td>Utilisation à 4 % (25 &mu ; L et 875 &mu ; L de 0,1 M PBS pour 1 mL de fixateur)</td></tr><tr><td>Aiguille PrecisionGlide 20G (0,90 mm x 25 mm)&nbsp ;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Verre Boîte de Pétri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>Logiciel disponible gratuitement ; version 3.4.3 ou ultérieure</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsin</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Caméra microscope</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Logiciel disponible gratuitement&nbsp ; compatible avec Windows 7 ou Windows 10</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount Support de montage de diapositives</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Utilisation 1,7 % (86 &mu ; L de 20 % Triton-X avec 52 &mu ; L de sérum normal d’âne et 863 &mu ; L de 0,1 M PBS pour 1 mL de solution de blocage)</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection à ressort Vannas&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>5MP Microscope USB Appareil photo numérique</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>À utiliser avec le microscope de dissection Olympus</td></tr></tbody></table>

lorsque vous coupez des questions : une dissection et guide de l’analyse de l’orientation spatiale de la rétine de souris de repères oculaires

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Avec précision et fiabilité identifier l’orientation spatiale de la rétine de souris isolé est important pour de nombreuses études en neuroscience visuelle, y compris l’analyse de la densité et les gradients de la taille des types de cellules rétiniennes, l’accordage de sens de direction-sélectif cellules ganglionnaires et l’examen des profils topographiques dégénérescence dans certaines maladies de la rétine. Cependant, il existe de nombreuses méthodes de dissection oculaires différents rapportés dans la littérature qui sont utilisés pour identifier et étiqueter rétinienne orientation dans la rétine de souris. Alors que la méthode d’orientation utilisée dans ces études est souvent négligée, orientation comment rétinienne pas considérée est déterminée peut causer écarts dans la littérature et de la confusion lorsque vous essayez de comparer les données entre les études. Des monuments oculaires superficielles comme cornéens brûlures sont couramment utilisées, mais ont récemment été démontrés être moins fiables que les monuments plus profondes comme les muscles rectus, la fissure choroïde ou le gradient de s-opsine. Ici, nous fournissons un guide complet pour l’utilisation des points de repère profond oculaires de disséquer avec précision et de documenter l’orientation spatiale d’une rétine de souris isolé. Nous avons aussi comparé l’efficacité des deux anticorps s-opsine et inclus un protocole pour immunohistochemistry s-opsine. Parce que l’orientation de la rétine selon le gradient de s-opsine nécessite une reconstruction rétinienne avec le logiciel Retistruct et rotation avec un code personnalisé, nous avons présenté les mesures importantes nécessaires pour utiliser ces deux programmes. Dans l’ensemble, le but du présent protocole est de livrer un ensemble fiable et reproductible des méthodes pour l’orientation rétinienne précise qui s’adapte aux protocoles plus expérimentales. Des grands objectifs de ce travail consiste à normaliser les méthodes d’orientation rétinienne pour de futures études.

Une coupe relève qui traverse le muscle droit supérieur avec précision et fiabilité identifie la rétine dorsale (Figure 1). La fissure choroïde avec précision et fiabilité identifie la rétine nasale et temporelle avec des coupes de relaxation profondes le long de la fissure choroïde temporelle et nasale (Figure 2). Dans cet exemple, une coupe relève également a été déposée dans la rétine dorsale afin d’identifier l’axe de la dorsale/ventrales de la rétine (Figure 2D, flèche verticale). Les étapes de ces processus sont indiqués à des fins de réplication par dissecteurs futures. Une combinaison d’immunohistochimie s-opsine (Figure 3 a et 3D), reconstruction avec le logiciel Retistruct (3 b, 3E) et une rotation précise avec un code personnalisé de MATLAB (3C, 3F) permettant la identification des moitiés ventrales et dorsales de la rétine, mais aussi les pôles nasales et temporelles si elle ne sait pas si la rétine est d’un œil droit ou gauche (Figure 3). Nous avons également comparé les deux anticorps primaires s-opsine couramment utilisés pour l’efficacité dans l’étiquetage des cônes s-opsine (Figure 4A-D) : les deux la chèvre anti-s-opsine anticorps primaire et l’anticorps primaire de lapin anti-s-opsine efficacement l’étiquette cônes s-opsine (Figure 4E) dans la même souris.
Soulager coupures ont été identifiés sur les rétines immunomarquage reconstruit s-opsine et leurs emplacements ont été comparés à l’orientation déterminée par le gradient de s-opsine. En utilisant notre personnalisé MATLAB code rétines (voir Matériaux supplémentaires), ont été tournés avec précision afin que la concentration la plus élevée de s-opsine coloration est située sur le ventre, plaçant ainsi le vrai dorsale à 90 ° (pour rectus supérieur), véritable nasale à 0 ° (pour les voies nasales fissure choroïde) et vrai temporelle à 180 ° (pour fissure choroïde temporelle). La valeur de chaque individu relève coupée l’angle a été déterminée à l’aide de l’outil angle dans ImageJ après que rétines ont redressé selon le gradient de s-opsine. Un angle moyen a été calculé pour chaque relève coupé type et la valeur moyenne de chaque type de coupe relève a été ensuite tracée sur un terrain polaire (Figure 6). En moyenne, coupes de muscle rectus supérieur identifiés le pôle dorsal à 96,3 ± 4,3 ° (n = 11) (Figure 6). La fissure choroïde nasale identifié le pôle nasal à 6,7 ± 5,8 ° et la fissure choroïde temporelle du pôle temporal à 172,0 ± 4,4 ° (n = 9 ; La figure 6).
<img alt="Analyse microscopique de la structure oculaire ; effet de brûlure dorsale ; diagrammes de neuroanatomie ; données de recherche." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : à l’aide du muscle droit supérieur afin d’identifier précisément la rétine dorsale d’un bon oeil. (A) un exemple d’une brûlure cornéenne dorsale près de la frontière cornée sclère faite avec un feutre cautérisation (flèche blanche). Le muscle droit supérieur est également visible dans ce point de vue (flèche blanche). (B) un exemple d’un ensemble monté rétine avec un soulagement coupe faite dans la rétine dorsale en coupant le muscle droit supérieur. Flèche représente le profond soulagement coupe opérée dans la rétine dorsale en coupant le muscle droit supérieur. La rétine est colorée avec l’anticorps primaire chèvre anti-s-opsine (voir Table des matières) et anticorps secondaire âne anti-chèvre Alexa 594 (voir Table des matières; excitation : 590 nm ; émission : 620 nm) (cyan). Rétine a été photographié avec un microscope à épifluorescence avec un filtre de Texas Red (595 nm). (C) une rétine reconstruit en Retistruct et tourné avec un code MATLAB personnalisé (voir la Documentation supplémentaire) avec le rectus supérieur muscle soulager coupé visible (flèche blanche). D: dorsale, V: ventrale, T: temporelle, N: nasale. Barreaux de l’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse du développement oculaire ; brûlure dorsale et fissure choroïde ; image au microscope ; schéma anatomique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : à l’aide de la fissure choroïde afin d’identifier précisément les pôles nasales et temporale de la rétine d’un œil droit. (A) un exemple d’une brûlure cornéenne dorsale près de la frontière cornée sclère faite avec un feutre cautérisation. (B) la choroïde fissure visible à l’arrière de le œil sur la sclère (flèche blanche). La brûlure cornéenne dorsale est également visible dans ce point de vue, situé à environ 90° de la fissure choroïde temporelle. (C) la choroïde fissure visible à l’arrière de le œil sur la sclère, voyageant du nerf optique jusqu'à la frontière cornée sclère. (D) une rétine tachée de chèvre anti-s-opsine (voir Table des matières) et anticorps secondaire âne anti-chèvre Alexa 594 (voir Table des matières; excitation : 590 nm ; émission : 620 nm) (cyan) avec des coupes de fissure choroïde (horizontal les flèches) et la relaxation dorsale coupe (flèche verticale). Rétine a été photographié avec un microscope à épifluorescence avec un filtre de Texas Red (595 nm). E une rétine reconstruit en Retistruct et tourné avec un code personnalisé de MATLAB (voir matériaux supplémentaires) avec la coupe de relaxation dorsale et les coupes nasale et temporelle fissure choroïde visibles (flèches blanches). D: dorsale, V: ventrale, T: temporelle, N: nasale. Barreaux de l’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma de cartographie de la rétine ; analyse de la rétine droite et gauche ; visualisation non pivotée et pivotée." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : en utilisant le gradient de s-opsine d’identifier tous les quatre pôles de la rétine. (A) un exemple d’une rétine dissection d’un œil droit qui a été immunomarquées à étiqueter s-opsine et photographié avec un microscope à épifluorescence avec un filtre de Texas Red (595 nm). Les réductions de cette rétine sont arbitraires puisque l’orientation topographique est déterminée par le gradient de s-opsine. (B) les résultats de la reconstruction de la rétine chez les A avec Retistruct. Notez que le gradient de s-opsine n’est pas aligné correctement parce que la rétine n’a pas été exécutée par le code MATLAB personnalisé (voir Matériaux supplémentaires). (C) les résultats de la rotation de la rétine dans A avec le code personnalisé. La rétine a été tournée afin que la concentration la plus élevée de s-opsine coloration se trouve en bas et identifiée comme la rétine ventrale. Parce que la rétine est un œil droit, le pôle temporal est situé à 90° dans le sens inverse du pôle dorsal et le pôle nasal est situé à 90° vers la droite du pôle dorsal. (D) un exemple d’une rétine dissection d’un œil gauche qui a été immunomarquées à étiqueter s-opsine et photographié avec un filtre de Texas Red (595 nm). Les réductions de cette rétine sont arbitraires puisque l’orientation topographique est déterminée par le gradient de s-opsine. (E) les résultats de reconstituer numériquement la rétine en ré avec Retistruct. Notez que le gradient de s-opsine n’est pas aligné correctement parce que la rétine n’a pas subi une rotation par le code personnalisé. (F) les résultats de la rotation de la rétine en ré avec le code personnalisé. La rétine a été tournée afin que la concentration la plus élevée de s-opsine coloration se trouve en bas et identifiée comme la rétine ventrale. Parce que la rétine est un œil gauche, le pôle nasal est situé à 90° dans le sens inverse du pôle dorsal et le pôle temporal est situé à 90° vers la droite du pôle dorsal. D: dorsale, V: ventrale, T: temporelle, N: nasale. Barreaux de l’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="images de microscope d’immunocoloration anti-S-opsine de lapin de chèvre ; coupes efficaces d’histologie ; Graphique de données" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Comparaison de deux anticorps primaires s-opsine dans l’étiquetage des cônes s-opsine. (A) A rétine colorées avec l’anticorps primaire de chèvre anti-s-opsine (voir Table des matières). (B) autre la rétine de souris même colorées avec l’anticorps primaire de lapin anti-s-opsine (voir Table des matières). (C), une région représentative (0,1 x 0,1 mm2) de la rétine colorées avec l’anticorps primaire de chèvre anti-s-opsine. Image prise sur un microscope à épifluorescence à un grossissement de 40 X. (D), une région représentative (0,1 x 0,1 mm2) de la rétine tachée de lapin anti-s-opsine (voir Table des matières), une alternative de l’anticorps primaire. Image a été prise sur un microscope à épifluorescence à un grossissement de 40 X. (E) les deux anticorps étiqueter le même nombre de segments externes s-cône car il n’y a pas de différence significative du nombre d’immunopositifs s-cônes qui sont souillés de chèvre anti-s-opsine et de lapin anti-s-opsine à tout de la rétine testé excentricités (n = 2 ; Analyse de la variance avec test de Bonferroni post hoc ; p &gt; 0,05). Barreaux de l’échelle = 1 mm (A-B) ; 25 µm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse d’équilibre statique, schéma de l’interface logicielle avec les données d’imagerie, montrant la structure et les résultats." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : un guide visuel pour utiliser le logiciel de Retistruct pour reconstruire les rétines immunomarquage avec s-opsine. Rétine (A), A ouvert en Retistruct dont le contour est visible et une « larme » ajouté. Points de la « déchirure » sont indiquées par des flèches blanches superposées. Toutes les découpes de cette rétine sont arbitraires, car aucun point de repère particulier ne servait à marquer l’orientation rétinienne au cours de la dissection. Les touches importantes sont encadrés en rouge. (B) une rétine avec tous les « larmes » ajouté et la rétine dorsale identifié avec « D » sur le bord de la rétine. Notez que le bouton de « Reconstruire la rétine » est maintenant visible. Les touches importantes sont encadrés en rouge. (C) le processus de reconstruction de la rétine. L’intrigue polaire de la rétine reconstituée s’affiche sur la droite, montrant que le soulager des coupes cyan (flèches bleues superposées afin de préciser les endroits coupés). (D) le résultat final de l’exécution de la rétine par l’intermédiaire de Retistruct. La rétine wholemount original reste sur la gauche et la rétine reconstituée apparaît sur la droite. Les coupes relève sont visibles en cyan (flèches blanches superposées afin de préciser les endroits coupés). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Carte radiale montrant les directions des muscles oculaires ; droit supérieur, fissures choroïdes (nasale, temporale) données." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figure 6 : la fissure de muscle et de la choroïde rectus supérieur peut être utilisée pour orienter avec précision la rétine de souris. Un tracé polaire des angles obtenus de chaque muscle droit supérieur soulager coupures ou fissure choroïde coupe dans la rétine qui ont été reconstruits avec Retistruct. Soulager coupures ont été identifiés sur les rétines immunomarquage reconstruit s-opsine et leurs emplacements ont été comparés à l’emplacement du dégradé s-opsine. En utilisant le code MATLAB personnalisé à tourner avec précision les rétines, afin que la concentration la plus élevée de s-opsine coloration est situé sur le ventre, la vraie dorsale (90° pour rectus supérieur), vrai nasal (0° pour fissure choroïde nasale) et vrai temporelle (180° pour la choroïde temporelle fissure) ont été déterminés pour chaque rétine. La valeur de chaque relaxation individuelle, angle de coupe a été déterminée dans ImageJ et un angle moyen a été calculée pour chaque relève coupé type. Coupes de muscle rectus supérieur identifiés le pôle dorsal à 96,3 ± 4,3 ° (n = 11). La fissure choroïde nasale identifié le pôle nasal à 6,7 ± 5,8 ° et la fissure choroïde temporelle du pôle temporal à 172,0 ± 4,5 ° (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Landmark profonde</td>
			<td>Localisation de la brûlure cornéenne</td>
			<td>Pôle de rétine identifié</td>
			<td>Application à titre expérimental</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rectus supérieur</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Webcam live ou fixe</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fissure choroïde nasale</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Nasal</td>
			<td>Webcam live ou fixe</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fissure choroïde temporelle</td>
			<td>Dorsale</td>
			<td>Temporelle</td>
			<td>Webcam live ou fixe</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsine Gradient</td>
			<td>Aucun</td>
			<td>Dorsale, ventrale, nasale, temporelle</td>
			<td>Fixe</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Repères profondes, le pôle de la rétine, ils s’identifient, et qu’ils peuvent être utilisés pour l’application de tissus vivants ou fixe.

Ce protocole fournit un guide complet de la dissection et l’analyse de l’utilisation de repères profond oculaires, s-opsine immunohistochimie, Retistruct et du code personnalisé avec précision et fiabilité orienter la rétine de souris isolées dans l’espace anatomique.

Lorsque vous coupez des questions : Une Dissection et Guide de l’analyse de l’Orientation spatiale de la rétine de souris de repères oculaires

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Le but de ce protocole de dissection est de fournir une méthodologie standardisée pour l’utilisation de repères anatomiques oculaires, tels que les muscles droits, la fissure choroïde et le gradient S-opsin pour l’orientation topographique de la rétine de la souris. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles offrent un moyen fiable d’identifier avec précision les pôles dorsal, ventral, nasal et temporal d’une rétine de souris isolée. Commencez par identifier un point sur la cornée dorsale près du bord de la cornée sclérotique et entre les canthi nasal et temporal.Touchez la cornée avec un stylo cautérisé chauffé pendant moins d’une seconde pour créer une marque de brûlure à des fins d’orientation. Répétez l’opération pour le deuxième œil. La présence de la brûlure dorsale permet d’identifier le muscle droit supérieur.Pour l’énucléation, utilisez une pince incurvée pour pousser doucement l’œil hors de son orbite et saisir le globe par le dessous. Ensuite, soulevez lentement le globe de sa douille tout en le déplaçant doucement de gauche à droite jusqu’à ce que le globe soit libéré de la douille. Transférez le globe avec les muscles droits attachés dans une boîte de Pétri contenant un moyen de dissection.Si vous travaillez avec les deux yeux, assurez-vous de garder une trace de l’œil gauche et de l’œil droit. Sous l’endoscope de dissection, localisez visuellement la brûlure cornéenne dorsale et identifiez le muscle droit supérieur auquel elle est associée. À l’aide de ciseaux de dissection ou d’une aiguille de calibre 20, percez la cornée au niveau de la marque de brûlure.Ensuite, faites une coupe de soulagement profonde dans le globe vers le nerf optique pour couper en deux le muscle supérieur. Une rétine isolée avec cette coupe est vue ici, et une rétine reconstruite avec cette coupe est montrée ici. À l’aide de deux paires de pinces, commencez à isoler la rétine en déchirant doucement le trou fait par la ponction jusqu’à ce qu’une partie de la rétine soit exposée.Ensuite, séparez la rétine de la sclérotique jusqu’à ce que la sclère ait été complètement retirée. Retirez l’iris, le cristallin, le vitré et toutes les structures restantes jusqu’à ce que la rétine soit complètement isolée. La présence d’une brûlure dorsale permet d’identifier la fissure choroïde nasale et temporale.Si vous travaillez avec l’œil droit, la fissure choroïde nasale est située à droite de la brûlure et la fissure choroïde temporale est située à gauche de la brûlure. C’est l’inverse du travail avec l’œil gauche. Pour utiliser le point de repère de la fissure choroïde pour identifier l’orientation de la rétine, localisez et identifiez la fissure choroïde à l’arrière de l’œil.Orientez le globe de manière à ce que la marque de brûlure dorsale soit située au pôle supérieur, comme ce serait le cas si l’œil était encore dans la souris. Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection ou une aiguille de calibre 20 pour faire une ponction dans le globe, d’abord là où se trouve la brûlure dorsale. Ensuite, faites une coupe de soulagement peu profonde vers le nerf optique où se trouve la brûlure cornéenne dorsale.Ensuite, faites les deux coupes de soulagement profondes suivantes vers le nerf optique. L’une en alignant les lames des ciseaux de dissection avec la ligne de fissure choroïde temporale à l’arrière de l’œil, et l’autre en alignant les lames des ciseaux de dissection avec la ligne de fissure choroïde nasale à l’arrière de l’œil. Ces coupures sont montrées ici sur une rétine isolée et reconstruite.Après avoir fait ces coupes, utilisez deux paires de pinces pour déchirer doucement les trous de perforation jusqu’à ce qu’une partie de la rétine soit exposée. À l’aide de ciseaux de dissection, faites quatre incisions de soulagement dans la rétine afin qu’elle repose à plat. Montez la rétine, côté cellule ganglionnaire vers le haut, sur une membrane de nitrocellulose en appuyant doucement chaque coin de la rétine sur la membrane à l’aide d’une pince.Ensuite, à l’aide d’une pince, vous pouvez immerger la rétine montée dans un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % contenu dans le premier puits d’une plaque à 24 puits. Placez la plaque de 24 puits sur un agitateur orbital à température ambiante et fixez la rétine pendant exactement 40 minutes. Après la fixation, transférez la rétine dans le deuxième puits de la plaque, qui est rempli d’un millilitre de PBS 0,1 molaire et lavez la rétine pendant 15 minutes à température ambiante.Une fois le lavage terminé, transférez la rétine montée dans le cinquième puits contenant un millilitre de solution bloquante et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, ajoutez l’anticorps primaire anti-S-opsine de lapin à la solution bloquante à une concentration de un à 500 et incubez pendant trois jours à quatre degrés Celsius. Après l’incubation de trois jours, lavez l’excès d’anticorps primaire de la rétine six fois en le plaçant séquentiellement dans six puits remplis d’un millilitre de PBS pendant 10 minutes chacun à température ambiante.Placez ensuite la rétine lavée dans un puits avec une solution de blocage fraîche et ajoutez l’anticorps secondaire anti-lapin Alexa 594. Incuber la rétine avec l’anticorps secondaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, lavez la rétine dans du PBS six fois, comme précédemment.À l’aide d’une pince, transférez la rétine montée dans une boîte de Pétri contenant du PBS. Libérez la rétine de la membrane de nitrocellulose en insérant doucement les pointes de la pince entre la rétine et la membrane jusqu’à ce que la rétine ne soit plus attachée. Plongez une lame de microscope en verre dans le PBS et montez la rétine sur la lame en la faisant flotter sur la lame et en la poussant doucement avec une pince jusqu’à ce que la rétine adhère au verre.Couvrez la rétine de la lame avec un support de montage et placez une lamelle de protection 1,5. Mettez la lame dans un plateau à lames et laissez-la reposer à température ambiante pendant une heure. Au bout d’une heure, placez le plateau de diapositives à quatre degrés Celsius.Une fois que la lame a été recouverte pendant 24 heures, utilisez du vernis à ongles pour sceller les côtés de la lame afin d’éviter la dessiccation. Voici un exemple d’une rétine isolée de l’œil droit qui a été immunomarquée pour marquer la S-opsine et imagée avec un microscope à épifluorescence. Il est important de noter que les coupures dans cette rétine sont arbitraires puisque l’orientation topographique peut être identifiée par le gradient S-opsin.L’image acquise de la rétine peut ensuite être reconstruite numériquement avec le logiciel ReadiStruct. Les coupes originales sont pseudo-colorées en rouge dans cette image. Notez que le fichier de sortie de ce programme n’aligne pas correctement la rétine.Une fois que la rétine a été passée par le code de laboratoire de tapis personnalisé, la rétine est tournée de sorte que la concentration la plus élevée de coloration à la S-opsine soit placée en bas et identifiée comme la rétine ventrale. Cette image montre la rétine d’un œil gauche. Le pôle temporal est situé à 90 degrés dans le sens inverse des aiguilles d’une montre par rapport au pôle ventral et le pôle nasal est situé à 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre à partir du pôle ventral.Une fois maîtrisées, ces techniques de dissection peuvent être réalisées assez rapidement en quelques minutes si elles sont effectuées correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’orienter avec précision et fiabilité la rétine de la souris en utilisant le muscle droit supérieur, la fissure choroïde ou le gradient S-opsin comme point de repère.

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