Dissection de la fonction de Enhancer utilisant le Multiplex Enhancer CRISPR axée sur les interférences dans les lignées cellulaires

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génomique et de la régulation des gènes, telles que la façon dont plusieurs régions de régulation des gènes, également appelées amplificateurs, travaillent ensemble pour contrôler la transcription. Le principal avantage de cette technique est que plusieurs amplificateurs proches de plusieurs gènes différents peuvent être testés simultanément afin d’identifier rapidement les régions impliquées dans la régulation des gènes. Pour commencer la conception de l’ARN, générez d’abord des séquences d’ADN comme décrit dans le protocole de texte.

Utilisez un programme tel que E-CRISP sur les séquences d’ADN générées pour trouver des ARN guides avec de faibles hors cibles. Les ARN guides sont constitués de 20 nucléotides en amont d’un motif adjacent au protospacer, qui prend la forme de NGG pour le dCas9 de S. pyogenes. Sur le site Web E-CRISP, sélectionnez l’organisme d’intérêt à l’aide du menu déroulant.

L’ensemble du génome apparaît à droite du nom de l’espèce. Sélectionnez la case d’option Input is FASTA sequence. Copiez les séquences FASTA ci-dessus et collez-les dans la boîte de dialogue.

Assurez-vous qu’un en-tête FASTA est inclus pour chaque séquence. Sélectionnez la case d’option moyenne et le design unique dans le menu déroulant. Cliquez sur le bouton Démarrer la recherche d’ARNg unique.

Un nouvel onglet du navigateur s’ouvrira et les résultats s’afficheront. Téléchargez les séquences candidates en cliquant sur le bouton Télécharger un rapport tabulaire formulé Excel pour toutes les séquences de requête ensemble. Ensuite, utilisez le navigateur de génome de l’UCSC pour les séquences d’ARN guides complètes candidates au BLAT dans le génome.

Dans un navigateur, accédez au site Web du navigateur génomique de l’UCSC. Dans la section Nos outils, localisez le mot BLAT et cliquez dessus. L’outil de recherche BLAT s’ouvrira.

Utilisez les menus déroulants situés sous le texte de recherche du génome BLAT pour sélectionner l’organisme et l’assemblage du génome qui vous intéressent. Copiez les séquences d’ARN guides à partir du rapport tabulaire généré par E-CRISP et collez-les dans la boîte de dialogue. Assurez-vous que chaque séquence a un en-tête FASTA unique, puis cliquez sur Soumettre en bas de la boîte de dialogue.

Sur la page des résultats de recherche BLAT, les alignements de chaque séquence d’ARN guide apparaîtront, chaque ligne représentant un alignement. Idéalement, il devrait y avoir un alignement pour chaque ARN guide, indiquant le caractère unique de cet ARN guide. Évitez les guides qui correspondent à plusieurs emplacements dans le génome, si possible.

Pour examiner la localisation et la distribution de l’ARN guide dans la région d’intérêt, cliquez sur le lien du navigateur sous la section Actions de l’un des ARN guides interrogés. Le navigateur du génome apparaîtra et sera centré sur l’ARN guide sélectionné. Utilisez les boutons de zoom arrière en haut de la page pour visualiser la distribution des autres ARN guides identifiés par E-CRISP dans la région d’intérêt.

Sélectionnez quatre ARN guides, de préférence non chevauchants, répartis dans la région d’intérêt. Si la région d’intérêt dépasse 600 paires de bases, envisagez d’ajouter un à deux guides supplémentaires. Évitez les ARN guides avec des étirements homopolymères et une teneur extrême en GC, car ces caractéristiques peuvent entraver le processus de clonage de l’ARN guide et réduire l’efficacité du ciblage de l’ARN guide.

Reconstituer les oligonucléotides d’ARN guide à une concentration finale de 100 micromolaires dans de l’eau ultra-pure. Il doit y avoir au moins quatre oligos d’ARN guide distincts pour chaque région d’intérêt. Pour chaque région d’intérêt réglementaire, créez un pool de tous les oligonucléotides correspondant à la région d’intérêt.

Dans un tube d’Eppendorf, combinez cinq microlitres de chaque oligo d’ARN guide reconstitué pour chaque région. Bien mélanger la piscine par vortex, puis prélever un microlitre et diluer cet éloquat 1 à 200 dans de l’eau ultra-pure. Effectuez une courte PCR avec les amorces USICS pour attacher des régions d’homologie aux oligos, comme détaillé dans le protocole de texte.

Environ 40 bases seront ajoutées à chaque oligo, ce qui donnera un produit d’environ 100 paires de bases qui contient une homologie suffisante avec le spectre USIC aux deux extrémités. Ensuite, configurez les réactions de l’assemblage Gibson sur la glace. Utilisez 50 nanogrammes du vecteur digéré et sept nanogrammes de l’insert dans une réaction de 20 microlitres.

De plus, mettez en place une réaction d’assemblage Gibson digéré uniquement à l’aide de 50 nanogrammes du vecteur et en remplaçant l’insert par de l’eau. Incuber les réactions de l’assemblage Gibson pendant 15 minutes à 50 degrés Celsius, puis les maintenir à 4 degrés Celsius. Après avoir transféré les produits assemblés dans de la glace, diluez-les de 1 à 4 dans de l’eau ultra-pure sur de la glace.

Par exemple, ajoutez cinq microlitres de produit Gibson Assembly à 15 microlitres d’eau ultra-pure. Ensuite, transformez les produits d’assemblage Gibson dilués. Faites tomber des cellules compétentes à haut rendement sur de la glace et fabriquez des éloquats de 25 microlitres pour chaque transformation.

Si l’on souhaite un pool complexe ciblant plusieurs sites, répartissez suffisamment de cellules dans différents tubes pour effectuer plusieurs transformations indépendantes. Plaquez 50 microlitres de cellules transformées et placez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour les mini-préparations des piscines ciblant des sites individuels, placez les cellules directement dans trois à cinq millilitres de bouillon LB contenant de l’ampicilline ou de la carbénicline.

Incuber les cellules pendant la nuit en secouant à 250 tr/min et à 37 degrés Celsius. Pour les grandes bibliothèques, utilisez un grattoir à plaques pour rassembler toutes les colonies de chaque plaque individuelle en une seule maxi-préparation. Cela peut être facilité en versant environ cinq millilitres de LB avec l’antibiotique approprié dans un tube Falcon de 15 millilitres et en raclant les colonies dans le tube.

La veille de la transfection, plaquez les cellules dans une plaque à 24 puits, à 30 à 50 % de confluence. Plaquez suffisamment de cellules pour que les transfections puissent être effectuées en double, et incluez des puits à transfecter avec des ARN guides de contrôle. Assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties dans le puits, en secouant doucement la plaque après le placage des cellules.

Agitez toutes les cinq minutes pendant les 15 premières minutes. Le lendemain, préparez les transfections selon les instructions du réactif de transfection de votre choix. Pour les cellules d’Ishikawa, utilisez 550 nanogrammes de plasmide total pour chaque puits d’une plaque de 24 puits.

Diluez les plasmides à une concentration finale de 020 microgrammes par millilitre dans un milieu sans sérum. Utilisez trois microlitres de réactif de transfection pour chaque microgramme d’ADN, tourbillonnez doucement et incubez pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Ajouter 25 microlitres du mélange final dans chaque puits.

Préparez un volume suffisant de tampon de lyse avec 1 % de bêta-mercaptoéthanol. Aspirez le fluide à l’aide d’un aspirateur. Lavez les cellules une fois avec un volume égal de 1x PBS et aspirez pour éliminer autant de PBS que possible.

Ajouter 300 microlitres de la solution de lyse BME dans chaque puits, à l’aide d’une pipette multicanaux. Pipetez la solution de lyse de haut en bas huit à dix fois, puis transférez-la dans une plaque à puits profond ou des tubes Eppendorf de 1,7 millilitre sur de la glace. L’ARN peut être extrait immédiatement, ou les lysats peuvent être congelés à moins 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur.

Des plans d’ARN guides sont présentés pour les trois sites de liaison au facteur de transcription près de MMP17. La région cible est le site de liaison du RE alpha tel que défini par le ChiP-seq, et les quatre ARN guides sont des tuiles dans cette région. Voici le produit d’ARN guide attendu après une courte PCR, à l’aide des amorces internes de l’USIC.

La réaction ajoutera 20 paires de bases de séquence à chaque extrémité du fragment d’ARN guide de 59 paires de bases, ce qui donnera une séquence d’environ 100 paires de bases. Les résultats qualitatifs de la PCR d’une expérience Enhancer-I à MMP17 sont présentés. Les sites ciblés par Enhancer-I sont indiqués par un hexagone noir.

Les sites 1 et 2 sont nécessaires à la réponse œstrogénique complète de MMP17, tandis que le site 3 n’y contribue pas. Le site 1 peut contribuer à une certaine expression par lui-même, mais l’activité la plus importante est observée lorsque les sites 1 et 2 sont actifs. Une fois optimisée pour la lignée cellulaire d’intérêt, cette technique peut être réalisée en cinq à sept jours, si elle est effectuée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir des ARN guides pour Enhancer-I, de créer et de transfecter des pools complexes d’ARN guides et de récolter des cellules transfectées. Lors de cette procédure, il est important de maintenir un environnement de culture tissulaire stérile et d’utiliser des matériaux sans RNase et DNase. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le ChiP-seq et le RNA-seq, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que l’emplacement de la liaison d’Enhancer-I dans le génome et la façon dont il affecte l’expression globale des gènes.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la régulation des gènes induite par les œstrogènes au niveau des loci endogènes du génome humain, au lieu d’utiliser des rapporteurs épisomaux. N’oubliez pas que travailler dans des environnements de culture de tissus de mammifères peut être dangereux et que des précautions, telles que le port d’un équipement de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.