Génération efficace de hiPSC neurones Lineage Reporters Knockin spécifique en utilisant l'CRISPR / Cas9 et Cas9 Système Double Nickase

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules souches pluripotentes induites humaines spécifiques à la lignée ou des rapporteurs de knockin H-I-P-S-C en utilisant la recombinaison homologue médiée par CRISPR Cas nine. Pour ce faire, il faut d’abord concevoir et construire des vecteurs de ciblage. La deuxième étape consiste à concevoir et à construire des ARN guides simples pour le système CRISPR Cas neuf ou le système CAS nine N double Nick case.

2 93 PIEDS Les cellules sont ensuite transfectées avec les ARN guides simples et le vecteur d’expression CAS neuf, et l’ADN est extrait et amplifié pour évaluation par un test T sept ENDONUCLEASE un. La dernière étape consiste à effectuer une prédiction in silico de sites potentiels hors cible. Sites. En fin de compte, les CSP HI seront transfectées avec le vecteur de ciblage et les neuf composants du système CRISPR Cas pour fabriquer des lignées cellulaires rapporteures de la lignée neuronale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la recombinaison homologue conventionnelle. Au lieu de cela, le ciblage génique médié par CRISPR a une efficacité de ciblage beaucoup plus élevée. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à concevoir un seul ARN GA.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de conception d’une RA à guide unique et de prédiction indirecte de sites hors cible sont difficiles à apprendre car le concept CRISPR Cas neuf n’a été introduit que récemment pour l’édition de gènes et les nouveaux outils de ressources en ligne sont utilisés lors de la détermination du marqueur spécifique de la lignée. Localisez la séquence génomique du gène et concevez les bras d’homologie en conséquence. Le locus génomique A LDH un L un est utilisé dans cet exemple.

La construction de ciblage est réalisée par sous-clonage de la GFP en aval de la séquence génomique juste avant le code d’arrêt sur connecté par auto-clivage deux séquences peptidiques A ajouter une cassette de sélection positive telle qu’une cassette de néomycine fluxée F en aval du rapporteur inclure une cassette de sélection négative, par exemple thymidine kinase en dehors du bras d’homologie à trois primes. Commencez cette procédure en déterminant le marqueur spécifique à la lignée qui sera ciblé pour faire en sorte que le rapporteur A LDH un L un est utilisé dans cette démonstration. Copiez la séquence CDNA à partir de la base de données NCBI.

Allez à la recherche de blatt humain pour obtenir un alignement d’ADN génomique. Cliquez sur l’onglet du navigateur pour afficher l’assemblage du gène sous l’onglet Vue. Cliquez sur ADN pour obtenir la séquence d’ADN génomique complète dans un format rapide.

Localisez le code d’arrêt dans la séquence d’ADN où la séquence bidirectionnelle et la cassette de rapporteur seront étiquetées. Recherchez le motif adjacent à l’espaceur proto, ou Pam, par exemple NGG, à proximité du code d’arrêt, sur balayez les deux brins pour localiser la séquence NGG appropriée. Copiez la séquence de la base 20 immédiatement en amont de NGG et collez-la dans le web Outil de conception Z fit design oligos avec surplombs compatibles avec MLM 3 6 3 6.

Le vecteur d’expression de l’ARNG humain avec un promoteur U six. Une fois que les oligonucléotides avant et inverse ont été synthétisés, procédez à la fabrication d’un ARN guide simple brin double brin pour une réaction de 50 microlitres. Ajoutez respectivement 22,5 microlitres d’oligonucléotides avant et arrière et cinq microlitres de tampon à genoux Anne, dénaturez les deux oligonucléotides à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes et refroidissez progressivement à température ambiante.

Ensuite, mélangez et ligaturez les oligos avec BSMB un digéré MLM 3 6 3 6. Pour une réaction de 20 microlitres, ajoutez un microlitre d’oligos, 100 nanogrammes de MLM 3 6 3 6 et un microlitre de T quatre ligases incuber à température ambiante pendant la nuit du lendemain, transformez les cellules DH à cinq composants alpha avec un produit de ligature par choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Cultivez les bactéries sur une plaque d’ampicilline à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, choisissez trois à cinq colonies pour la préparation du plasmide. Par la suite, l’ADN du plasmide est confirmé par séquençage commercial et le plasmide correct est préparé à l’aide d’un protocole de préparation maxi standard pour commencer cette procédure, obtenir un cas de double entaille CAS neuf ND 10 un vecteur Concevoir une paire d’oligos avant et inverse pour chaque locus de ciblage en suivant la même procédure démontrée pour le système CRISPR Cas neuf. Une LDH une L sera à nouveau l’exemple ici.

Copiez la séquence de 20 bases immédiatement en amont de NGG et collez-la dans le web. Outil de conception Z ajusté pour obtenir des oligos avec des écheveaux compatibles avec le vecteur. Retirez la première base et la dernière base des oligonucléotides avant et arrière qui sont indiqués par l’outil de conception d’ajustement en Z.

Synthétisez les oligonucléotides avant et inverse et nommez-les comme suit. FN minuscule, F majuscule et FN minuscule, R majuscule Pour les PAM d’un côté du site cible et R minuscule et F majuscule, R minuscule et R majuscule et R majuscule pour les PAM de l’autre côté du site cible de ces N, est le nombre à désigner différents PAM Les f et r minuscules représentent l’emplacement des PAM soit au brin sens ou antisens et f et r majuscules représentent l’avant et oligos inverses. Après avoir identifié la paire optimisée d’ARN guide simple à utiliser pour CAS neuf n à l’aide du test T sept E un, procédez à la fabrication d’ARN guide simple brin double brin pour une réaction de 50 microlitres, ajoutez respectivement 22,5 microlitres d’oligos avant et inverse et cinq microlitres d’un tampon à genoux.

Dénaturez les deux oligonucléotides à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes et refroidissez progressivement à température ambiante. Mélangez et ligaturez les oligos avec des bbs. Un digéré double nase CAS neuf ND 10 un vecteur.

Pour une réaction de 20 microlitres, ajoutez un microlitre d’ARN guide unique, 100 nanogrammes de bbbs, un vecteur digéré et un microlitre de T quatre ligase, incubez à température ambiante pendant la nuit, transformez DH cinq cellules alpha avec un produit de ligature par choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Cultivez la bactérie dans lb de gélose ampicilline à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, choisissez trois à cinq colonies pour la préparation du plasmide.

Par la suite, l’ADN du plasmide est confirmé par un fournisseur commercial de séquençage et le bon plasmide est préparé à l’aide d’un protocole de préparation maxi standard pour commencer ce test. Co transfectez 2 cellules de 93 pieds avec le plasmide d’ARN guide unique et le vecteur d’expression CAS neuf à 0,5 microgramme de vecteur d’ARN guide unique, 0,5 microgramme de vecteur d’expression CAS neuf et 1,5 microlitre de lipectomie 2000 aux cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 72 heures.

Après 72 heures, récoltez les cellules en retirant le milieu de culture de chaque puits. L’ajout de 100 microlitres d’ADN, le tampon d’extraction rapide et l’évaluation du trier transfèrent vigoureusement les cellules dans des tubes. Incuber le mélange à 68 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant huit minutes.

Il s’agit du modèle pour les expériences PCR ultérieures. Configurez la PCR pour amplifier la séquence flanquant le motif adjacent à l’espaceur proto. Pour une réaction de 50 microlitres, combinez un microlitre de gabarit, 0,5 microlitre d’Hercules, deux 0,5 microlitres de DMSO, 10 microlitres de cinq tampons, 0,5 microlitres de mélange A-D-N-T-P et un microlitre d’un mélange d’amorces avant et arrière.

Effectuer la PCR en suivant les paramètres décrits dans le protocole lorsque la PCR est terminée et que les concentrations d’ADN des produits PCR ont été mesurées à 400 nanogrammes de produits PCR à deux microlitres de tampon de digestion deux, ADD DD H2O à une réaction finale. Volume de 19 microlitres incuber dans de l’eau bouillante pendant cinq minutes. Laissez la réaction reposer sur le banc pendant 45 à 60 minutes pour la refroidir naturellement à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un microlitre de T sept E un et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Arrêtez la réaction en ajoutant deux microlitres d’EDTA 0,25 molaire mélangés à six colorants de chargement XDNA. Chargez l’intégralité de la réaction de 20 microlitres dans un gel AROS à 2,5 %.

Faites fonctionner le gel à 100 à 150 volts pendant 30 minutes. Inspectez le gel sous la lumière UV pour évaluer le clivage médié par l’ARN guide unique. Par la suite, créez des rapporteurs de lignée neurologique par des cellules souches pluripotentes induites par l’électro-homme ou des CSP HI avec un vecteur de ciblage linéarisé Vecteur d’expression CAS 9 0 0 3 et un ou plusieurs vecteurs d’ARN guide unique appropriés Les sites hors cible potentiels peuvent être prédits à l’aide d’un outil open source en ligne appelé CS ot, qui est un programme basé sur Pearl.

Pour un système de fenêtres, téléchargez le programme CS OT et les fichiers de la base de données du génome humain sur un disque dur local. Préparez le fichier cible de l’ARN guide unique conçu au format FATA. Ouvrez le fichier nommé cas ot.

Une fenêtre de commande apparaîtra. Laissez-le tel quel pour l’instant. Ensuite, ouvrez le fichier nommé opt generator.

Pour générer une chaîne d’options, collez le chemin d’accès et le nom du fichier cible dans la boîte de dialogue de l’option moins T ou moins cible. Collez le chemin du fichier de séquence du génome dans la boîte de dialogue de l’option moins G ou moins génome. Copiez la chaîne d’options et collez-la dans la fenêtre de commande CAS OT.

Comme indiqué précédemment à la fin du programme Cas OT, exécuter un dossier sera généré. Ouvrez le fichier CSV dans le dossier à l’aide d’un tableur. Ce fichier contient les informations suivantes pour chaque site hors cible, emplacement chromosomique et génomique.

Séquence du type de site non apparié, nombre total de bases non appariées et informations sur les exons relatives au site hors cible avant la traversée. HI PSC. Les ARN guides simples sont évalués dans 2 cellules de 93 pieds par le test T sept E.

Dans ce résultat représentatif, les ARN guides uniques sont conçus pour cibler l’oli humain. Deux voies de gène un à trois sont transfectées avec un vecteur d’expression CAS neuf et les voies quatre à 11 sont transfectées avec un vecteur d’expression CAS neuf N nase. La GFP est utilisée comme contrôle.

La deuxième voie contient de l’ARN guide unique pour l’oli. Le ciblage deux à l’aide de CAS neuf voies cinq ne contient que le brin de sens de liaison. La voie six contient uniquement un brin antisens de liaison à l’ARN guide unique et les voies neuf et 10 contiennent une paire d’ARN guide unique pour les deux brins d’ADN.

Le produit PCR non digéré est d’environ 614 paires de bases dans le couloir deux. Une partie des produits de PCR est digérée en deux bandes d’environ 470 paires de bases et 140 paires de bases avec un pourcentage d’insertion et de délétion de 33 % dans les voies neuf et 10. Les deux bandes digérées sont d’environ 410 paires de bases et 200 paires de bases avec des pourcentages d’insertion et de suppression compris entre trois et 8 %. Une fois maîtrisé le vecteur et le guide unique, la conception et l’évaluation peuvent être effectuées en une semaine environ.

Il est effectué correctement Après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches avec de larges fonctions génétiques dans le développement et la maladie dans les systèmes humains. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception et de la construction de réseaux à guide unique pour le système CRISPR Cas neuf et CAS neuf N double N.