Visualisation niveaux gibbérelline cellulaires à l’aide de la NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer biocapteur (FRET)

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement des plantes concernant la distribution de phytohormones réglementaires de croissance. En utilisant des biocapteurs FRET génétiquement codés, par exemple nlsGPS1 qui détecte les gibberellins, il est possible de mesurer la distribution dynamique de composés importants dans les tissus arabidopsis à la solution cellulaire. En général, les personnes nouvelles dans ce domaine auront du mal, parce que l’analyse des biocapteurs FRET implique l’imagerie ratiométrique qui a augmenté le bruit et des étapes analytiques supplémentaires par rapport à l’imagerie métrique intentionnelle.

Commencez par semer environ 20 graines d’Arabidopsis stérilisées sur 1/2 plaques murashige et skoog ou ms agar square. Sceller les plaques avec du ruban chirurgical poreux et les envelopper de papier d’aluminium pendant un à trois jours d’incubation à quatre degrés Celsius pour la stratification. Pour l’imagerie des racines, transférer les plaques dans une chambre de croissance dans une orientation verticale pendant trois jours dans les conditions indiquées.

Pour l’hypocotyl cultivé dans l’obscurité, transférez les plaques dans la chambre de croissance pour une impulsion lumineuse d’une à quatre heures pour synchroniser la germination. Enveloppez ensuite les plaques de papier d’aluminium et placez-les dans la chambre de croissance dans une orientation verticale pendant trois jours. Pour des mesures à l’état stable, ajoutez 50 microlitres de solution simulée à une lame de microscope propre et placez doucement trois capteurs de perception gibberellin localisés nucléaires un ou nlsGPS1 exprimant des semis sur la lame.

Ensuite, placez une goutte d’huile sous vide sur chaque coin d’un glissement de couvercle propre et placez doucement pour couvrir glisser sur les semis. Ajouter soigneusement la solution de maquette supplémentaire pour enlever toutes les bulles d’air si nécessaire. Avant le traitement gibberellin quatre ou GA4, utilisez une seringue de 20 millilitres remplie de graisse sous vide et équipée d’une pointe de pipette modifiée de 200 microlitres avec une ouverture d’un millimètre de diamètre pour dessiner un rectangle uniformément superposé de trois centimètres et demi de long par deux centimètres et demi de large sur une glissière de verre propre.

Ajouter 50 microlitres de solution simulée au centre du rectangle et utiliser des forceps propres pour soulever nlsGPS1 exprimant les semis par le dessous de leurs cotylédons pour un transfert soignable dans la solution simulée. Placez un bordereau de couvercle tacheté de graisse sous vide comme il vient de le démontrer au centre du rectangle de graisse sous vide et remplissez soigneusement le réservoir d’une solution simulacre supplémentaire sans déranger les semis. Puis acquérir des images des semis sur un microscope confocal équipé de lasers appropriés pour cfp passionnant et YFP pour effectuer forster résonance imagerie de transfert d’énergie.

Pour ga4 pour le traitement, retirez la lame du stade du microscope et réglez une minuterie pendant 20 minutes. Retirez immédiatement la solution simulée du côté droit du bordereau de couvercle tout en ajoutant 17 microlitres d’un quart de liquide MS complétés par un micro molaire GA4 sur le côté gauche du bordereau de couvercle jusqu’à ce que toute la solution simulée ait été remplacée. Ensuite, placez la glissade de verre sur l’étape du microscope et attendez encore 10 minutes avant d’acquérir l’image de traitement GA4 après.

Pour mettre en place un cours du temps pour un tissu d’intérêt, ajouter 200 microlitres de solution simulée au centre du canal de perfusion d’un ibidi collant-slide, et placer doucement les semis nlsGPS1 dans la solution simulée comme démontré. Utilisez des forceps pour placer délicatement un glissement de couverture sur les semis à l’aide de l’arrière des forceps pour appuyer doucement sur les bords extérieurs du glissement de couverture jusqu’à ce qu’il forme un lien fort avec le matériau collant à la périphérie de la glissière collante. Ensuite, utilisez deux connecteurs Luer de diamètre intérieur de 0,8 millimètre et un tube en silicone de 0,8 millimètre de diamètre intérieur pour connecter la glissière collante à une seringue de 20 millimètres remplie de solution simulée et pour connecter la glissière à un récipient de sortie pour la collecte de la solution de sortie.

Déprimez doucement le piston pour distribuer suffisamment de solution à la chambre pour s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air, puis chargez la seringue sur une pompe à seringues programmable. Ensuite, démarrez la pompe pour lancer le cours du temps. Pour les traitements GA4 pendant le cours du temps, mettre en pause la pompe pour arrêter la perfusion et remplacer le tampon simulé contenant de la seringue par une seringue remplie d’un quart de liquide MS complété par GA4.

Pour l’analyse d’images 3D, importez les fichiers dans le logiciel d’analyse d’images IMARIS et ouvrez l’assistant surfaces. Réglez la soustraction d’arrière-plan à trois microns et le seuil à défaut. Pendant la segmentation des noyaux, prenez soin de ne pas inclure les nombreux noyaux avec fluorescence faible car la ration signal-bruit de l’objet avec des niveaux de signal proches de l’arrière-plan sera trop faible pour l’analyse de l’image ratiométrique.

Masquez ensuite les canaux d’émission CFP et FRET en fonction des surfaces créées à l’aide de l’émission YFP. Utilisez l’extension du rapport d’intensité moyenne XT pour calculer un rapport d’émission d’accepteur d’excitation du donneur divisé par l’émission du donneur d’excitation entre les valeurs moyennes d’intensité des surfaces individuelles dans les deux canaux. Pour colorier les surfaces individuelles avec le rapport d’émission nlsGPS1, sélectionnez le codage des couleurs avec des statistiques et définissez le rapport d’intensité moyen comme type de statistiques.

Sous l’icône statistiques, exportez les ratios de valeurs individuelles à partir de la table et copiez et coller les valeurs dans une feuille de calcul pour la représentation graphique des données. Dans la racine d’Arabidopsis, le gradient de rapport d’émission nlsGPS1 est indicatif des faibles niveaux de GA4 dans les zones meristematic et de division et des niveaux élevés d’AG dans la zone d’allongement tardif. En revanche, un gradient de rapport d’émission n’est pas observé dans les racines non réactives nlsGPS1, ce qui suggère que le gradient endogène GA4 n’est pas un artefact.

Un gradient de rapport d’émission nlsGPS1 est également formé dans les hypocotyls foncés avec de faibles niveaux dans les cotyléons et le crochet typique et des niveaux élevés dans la région basale rapidement allongée de l’hypocotyl. En revanche, un gradient de rapport d’émission n’est pas observé dans les hypocotyls non résensibles nlsGPS1. En outre, les GA4 fournis exogènement s’accumulent préférentiellement dans la zone d’allongement par rapport à la zone de division de la racine d’Arabidopsis indiquant que nlsGPS1 peut être utilisé pour étudier les schémas ga endogènes et exogènes.

En outre, l’analyse de cours de temps des semis nlsGPS1 traités ga4, révèle une accumulation plus rapide de GA4 exogène dans l’allongement de racine ainsi comparé à la zone de division. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter les pixels saturés pendant l’imagerie quantitative pour maintenir les paramètres d’imagerie constante et de minimiser les problèmes de dérive et de changement focal au cours de la perfusion de l’échantillon. Suite à cette procédure, des méthodes élaborées, comme les racines d’imagerie de plus en plus dans les dispositifs de profusion de contrôle de type puce racine peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont les gradients GA changent dans les extrémités des racines arabidopsis de plus en plus à des taux différents ou en réponse au stress Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de la croissance des plantes pour explorer la distribution dynamique des gibberellins dans les tissus et organes arabidopsis thaliana supplémentaires.