Inducción y puntuación de la enfermedad de injerto-versus-huésped en un modelo de murina xenógeno y cuantificación de células T humanas en tejidos de ratón utilizando PCR digital

Este protocolo describe cómo inducir la enfermedad de xenoinjerto contra huésped, o xenoGVHD, y cómo cegar y estandarizar la puntuación clínica para garantizar resultados consistentes. El modelo xenoGVHD proporciona un método in vivo para probar terapias inmunosupresoras contra células T humanas en lugar de murinas, mejorando la traducción de estos estudios a la clínica. Demostrar el procedimiento será Amara Seng, una estudiante graduada de mi laboratorio.

Un día antes de la inyección, coloque ratones de ocho a 12 semanas de edad, no obesos de ciencia clásica, o NSG, ratones en una jaula de pastel esterilizado, e irradiga a los ratones en una fuente de cesio-137 con una dosis total de 150 centigrayrays, con una rotación lenta para asegurar una irradiación uniforme. Luego, coloque los ratones en jaulas limpias en un gabinete de bioseguridad estéril durante la noche. A la mañana siguiente, recoja suficiente sangre humana sana para aislar 1,1 veces 10 a las siete células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, por ratón, y diluya la sangre heparinizada en un volumen igual de 2%suero bovino fetal, o FBS, en PBS.

Superponga cuidadosamente hasta 25 mililitros de sangre diluida en 15 mililitros de gradiente de densidad de separación de linfocitos en un tubo cónico de 50 mililitros para centrifugación de gradiente de densidad. Al final de la separación, cosecha el PBMC en la interfaz, y lava las células en 10 mililitros de PBS en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Aspirar el sobrenadante, y mover el tubo para aflojar el pellet.

Resuspender los PBMC en 10 mililitros de PBS fresco para otra centrifugación, seguido de resuspensión en cinco mililitros de PBS fresco para el recuento. Luego, recoger las células con una centrifugación final, y resuspender el pellet en un uno por 10 a los ocho PBMC por mililitro de concentración de PBS. Para la entrega retro-orbital del PBMC humano aislado en el ojo del ratón, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 28 con 100 microlitros de células.

Confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo delfín y retenga suavemente el ratón con el pulgar y el dedo medio. Inserte el lado biselado de la aguja hacia abajo, lateralmente en el canthus medial, a través de la membrana conjuntival hasta que se alcance la parte posterior del ojo. Retraiga ligeramente la aguja e inyecte lentamente todo el volumen de las células.

A continuación, retraiga completamente la aguja para la eliminación adecuada de la jeringa y la aguja. Cierre el párpado y aplique una presión suave en el lugar de la inyección con una esponja de gasa. Luego, examine el lugar de inyección en busca de hinchazón u otro trauma visible, y permita que el ratón recupere la conciencia en una jaula estéril forrada con toallas de papel y monitoreo antes de trasladar al animal a su jaula de origen.

Para medir la puntuación de la EICH, coloque la jaula en una capucha de flujo laminar y retire los alimentos y el agua de la jaula. Para puntuar la actividad, observe el comportamiento de los ratones durante cinco minutos. Para obtener una puntuación de pérdida de peso, pese cada ratón en un vaso de precipitados de vidrio.

Mientras el ratón todavía está en el vaso de precipitados, inspeccione al animal en busca de postura, textura de piel e integridad de la piel. Después de cosechar los tejidos de interés, cortar un trozo de tejido de aproximadamente tres por 0,5 milímetros del órgano, y pesar la muestra en una balanza. Transfiera el tejido ponderado a un tubo estéril de 1,5 mililitros y congele la muestra en nitrógeno líquido para su almacenamiento durante la noche a menos 80 grados centígrados.

A la mañana siguiente, descongele las muestras antes de la lelisis, de acuerdo con las instrucciones de un kit de aislamiento de ADN genómico. Para la cuantificación de células T humanas por reacción en cadena de polimerasa digital, o PCR, preparar reacciones PCR digitales de acuerdo con el protocolo para tintes de unión de ADN para la máquina pcR digital que se utiliza y el uso de las imprimaciones adecuadas para el ADN genómico de épsilon CD3 humano. A continuación, realice la reacción pcR digital en las condiciones de reacción adecuadas.

Los ratones NSG de ocho a 12 semanas de edad irradiados por subletally de ambos sexos que reciben PBMC humano comienzan a mostrar signos clínicos de EICH alrededor del día 10 después de la inyección en comparación con ratones de control negativo tratados con PBS solamente. Los ratones XenoGVHD tienen una mediana de supervivencia de 23,5 días. Utilizando PCR digital, las células T humanas CD3 epsilon-positivas se pueden detectar en las muestras de pulmón e hígado de ratones que reciben PBMC humanos.

Es fundamental que la puntuación se realice de forma consistente y que el investigador que anote a los ratones esté cegado a su tratamiento. Después de este procedimiento, el suero se puede recolectar de ratones eutanasiados para el análisis de la expresión periférica de citoquinas, y las células inmunitarias se pueden recoger del bazo para su análisis a través de la citometría de flujo.